PLoS ONE: Identifikation af kræft i æggestokkene Metastatisk miRNAs

Abstrakt

Serøse epitelial kræft i æggestokkene (EOC) patienter ofte bukke under for aggressiv metastatisk sygdom, men lidt er kendt om adfærd og genetik kræft i æggestokkene metastaser. Her ønsker vi at forstå, hvordan oment metastaser adskiller sig fra primære tumorer, og hvordan disse forskelle kan påvirke kemoterapi. Vi analyserede miRNA udtryk profiler af primære EOC tumorer og deres respektive oment metastaser fra 9 patienter, der anvender miRNA Taqman qPCR arrays. Vi finder 17 miRNA med forskellig ekspression i oment læsioner sammenlignet med primære tumorer. miR-21, miR-150, og miR-146a har lav udtryk i de fleste primære tumorer med markant forøget ekspression i oment læsioner, med samtidig nedsat ekspression af forudsagte mRNA mål baseret på mRNA-ekspression. Vi finder, at miR-150 og miR-146a mægle klumpformet størrelse. Både MIR-146a og MIR-150 øge antallet af resterende overlevende celler med 2-4 gange ved udsættelse for letale cisplatin koncentrationer. Disse observationer antyder, at mindst to af miRNA, MIR-146a og MIR-150, opreguleret i oment læsioner, stimulere overlevelse og øge drug tolerance. Vore iagttagelser antyder, at kræftceller i oment tumorer udtrykker centrale miRNA anderledes end primære tumorer, og at mindst nogle af disse microRNA’er kan være kritiske regulatorer af fremkomsten af ​​lægemiddelresistente sygdom

Henvisning:. Vang S, Wu HT , Fischer A, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et al. (2013) Identifikation af kræft i æggestokkene Metastatisk miRNA. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10,1371 /journal.pone.0058226

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: September 21, 2012; Accepteret: 31 januar 2013; Udgivet: 12 Marts 2013

Copyright: © 2013 Vang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Brown University center for Computational Molecular Biology, Seed pris fra Brown University National center of Excellence i kvinders sundhed, og National Institutes of Health /National center for Research Resources giver 5P41RR001395. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

serøs epithelial kræft i æggestokkene (EOC) er en aggressiv sygdom, for hvilken der er få effektive biomarkører og terapier. EOC er ofte diagnosticeret efter tumorceller har formidlet inden bughulen [1]. På trods af at metastaser udgør størstedelen af ​​sygdomsrelaterede dødsfald, forbliver ovariecancer metastase dårligt forstået [1].

Formålet med denne undersøgelse var at identificere træk, der kan være vigtigt at fastslå metastaser og til at bestemme hvordan disse faktorer kan påvirke kemoterapi reaktioner. Fremskreden metastatisk sygdom er fortsat en stor udfordring at behandle, oftest fører til tilbagevendende, lægemiddelresistente tumorer. Metastaser kan beriges til et særskilt mutationel spektrum sammenlignet med primære tumorer [2], [3], [4]. Sammenligning primære og metastatiske tumorer har genereret vigtigt indblik i sygdomsprogression i begge dyremodeller [5], og i patienter [2]. For at forbedre behandlingen af ​​metastatisk sygdom, er det vigtigt at forstå de gener og veje dukker op i metastaser, som måske ikke er til stede i primære tumorer. Selvom metastatisk potentiale kan forudsiges baseret på den primære tumor [6], [7], denne iagttagelse er ikke gensidigt udelukkende med den mulighed, at de vigtigste funktioner dukke op i metastaser, der ikke er observeret i primære tumorer. For eksempel kan den nye mikromiljø fremkalde betydelige fænotypiske ændringer cancerceller, herunder ændringer i metaboliske aktivitet i omentum [8], og øget modstand narkotika [9].

Tidligere mRNA ekspression undersøgelser gransket den matchet æggestokkene primær og metastatiske tumorer fra den samme patient, understøtte en ‘primær tumor disposition’ model [6], [10], [11], [12]. mRNA udtryk data ved hjælp af tidlig generation microarrays tyder der er få signifikante udtryk forskelle mellem oment læsioner og primære tumorer [13], [14], [15], men har talrige undersøgelser beskrevet forskellen udtryk for vigtige regulatoriske faktorer mellem primære tumorer og metastaser, herunder E-cadherin [16], MMP [17], [18] og integriner [19]. For at løse denne tilsyneladende uoverensstemmelse og få ny indsigt i tilstanden af ​​kræftceller i metastaser, profileret vi miRNA udtryk i matchede par af primær serøs epitelial ovariecancer (EOC) tumorer og oment læsioner. miRNA udtryk profilering identificerer miR-150 og miR-146a at være opreguleret i oment metastaser. Vi finder, at MIR-150 og MIR-146a fremme sfærisk formation og øge den del af resterende overlevende celler efter cisplatin eksponering. Disse observationer tyder på, at højere udtryk for miR-146a og miR-150 i oment læsioner kan føre til mere aggressive, kemoterapi sygdom.

Resultater

Vi identificerede 9 Stage IIIC serøse epitelial æggestokkene kræftpatienter med par af primære og oment metastatiske tumor prøver (figur S1, tabel S1). Alle patienter var post-menopausal ( 55 år på tidspunktet for diagnose) og havde metastatisk sygdom i omentum. Vi målte miRNA udtryk ved hjælp Taqman qPCR array-kort i de 9 par tumorer. Hver tumor havde 70% cancerceller, og god RNA kvalitet (Agilent Bioanalyzer RIN 5). Vores fokus er at forstå de forandringer manifesterer under sygdomsprogression, og derfor har vi fokuseret på at sammenligne metastaser til de primære tumorer og mente ikke normale ovarieepitelceller.

Identifikation af miRNA differentielt udtrykte mellem primære og metastatiske tumorer

Vi målte 377 miRNA hjælp ABI Taqman qPCR arrays, specifik for modne miRNA [20], i 9 matchede primære og metastatiske humane tumorer. 180 miRNA udtrykkes, i mindst to tumorer, med ingen global op- eller nedregulering af disse miRNA mellem de primære og metastatiske tumorer. Figur 1A opsummerer de miRNA med store tilbagevendende udtryk forskelle identificeres ved en parret t-test (Figur S2). Vi testede ekspressionen af ​​MIR-146a og MIR-150 i assays målrettet netop disse miRNA i to par patienter at bekræfte, at Taqman assays er specifikke for disse miRNA uden krydstale fra de andre 376 assays (figur S3).

A. miRNA udtryk profilering af Taqman qPCR arrays identificerer 17 miRNA differentielt udtrykte mellem 9 par primære tumorer og oment læsioner. miRNA med P 0,05 (parret t-test) blev udvalgt. Ekspressionsniveauet præsenteres som middelværdien +/- standardafvigelse af middelværdien (S.E.M.) af folden forandring ved hjælp af ΔC

t metode i forhold til U6 snRNA. Rød, lavere udtryk i metastaser, blå, højere udtryk i metastaser. B. Venstre, ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse af folden ændringer i de analyserede patienter. Right, forening plot analyse af miRNA udtryk identificerer miRNA klynger angivet med rødt. Clustering blev udført i Gene-E] 50].

Hierarkisk gruppering af folden skift mellem primære og metastatiske tumorer for de 17 miRNA viser tre forskellige grupper (Figur 1B). Patienterne blev grupperet med lignende fold ændringer i miRNA udtryk (figur 1B, venstre panel). Distinct miRNA grupper er lettere visualiseres når miRNA er grupperet uafhængig af patienterne (figur 1B, højre panel). Fordi miR-146a, miR-21 og miR-150 er repræsentative for de tre store up-regulerede klynger, besluttede vi at fokusere vores indsats for at forstå deres mulige funktioner i kræft i æggestokkene. Vi fandt, at ekspressionen af ​​MIR-21, MIR-146a, MIR-150 er negativt korreleret med deres forudsagte mRNA mål (fig S4), antyder, at disse miRNA aktivt undertrykker mRNA-ekspression i metastaser i sammenligning med primære tumorer. Vi valgte at fokusere på miR-146a og miR-150, fordi disse to miRNA ikke tidligere har været undersøgt i kræft i æggestokkene til vores viden.

For at afgøre, om udtrykket skifter stammer fra cancerceller eller stroma, ved hjælp af en ortogonal assay, udførte vi

in situ

hybridisering (ISH). MIR-21 udtrykkes i både cancerceller og stromaceller, og opreguleret i oment læsioner, i overensstemmelse med Taqman qPCR skærmen (figur 2A). Ved ISH, vi se, at de absolutte ekspressionsniveauer er variable, men alle 8 oment læsioner testede show øget MIR-21 cancercelle ekspression sammenlignet med den tilsvarende primære tumor (figur 2 og figur S5). I vores hænder, ISH følsomhed er fattige og afhænger af kvaliteten af ​​sonden, og vi var ude af stand til at opnå pålidelige signal til andre miRNA, selv efter udtømmende gennemgang af de vigtigste variabler, herunder hybridiseringstemperatur, proteinase K-koncentration, og sonde koncentration. Disse iagttagelser antyder, at MIR-21 stammer fra både kræft og stromaceller, og at MIR-21 ekspression øges i oment metastaser i kræftceller.

A.

In situ

hybridisering af miR-21. Kræftceller er farves røde af Nuclear Rød. Højere ekspression i oment metastaser er observeret i hvert tilfælde, selv med både relativt høj og lav MIR-21-ekspression i den primære tumor. Pilene angiver regioner i miR-21-ekspression co-lokalisere med Nuclear Rød farvning. B. Laser Capture mikrodissektion (LCM) af to sager afslører miRNA sandsynligvis udtrykt i kræftceller. Varmen Kortet viser fold ændring for de 17 miRNA identificeret i bulk tumor skærmen. Lignende mønstre af differential udtryk observeres for miRNA udtrykt i cancerceller som observeret i bulk tumor. Sort viser, at miRNA ikke kunne påvises i LCM isoleret kræftceller

For at forfølge en mere generel analyse, vi beriget for kræftceller ved Laser Capture mikrodissektion (LCM) af H . E farvet kræftceller, og udførte Taqman qPCR arrays fra to tilfælde. 11 af de 17 miRNA, der er konstateret i bulk tumor skærmen (figur 1A), er udtrykt i LCM beriget cancerceller, og den differentielle ekspression mellem primære tumorer og oment læsioner er kvalitativt den samme (figur 2B, fig S6). Disse observationer antyder, at den observerede ændring i ekspression sandsynligvis stammer i cancerceller for disse 11 miRNA (figur 2B). miRNA ikke udtrykkes i cancerceller, men med store ekspressionssystemer ændringer i bulk-tumor, såsom MIR-124 og MIR-370, kan indikere tilstedeværelsen af ​​specifikke typer af stromaceller, såsom fibroblaster eller immunceller. Vi blev oprindeligt fascineret af miR-509-3-5p, miR-508-3p, og miR-508-5p, da disse var de eneste miRNA nedreguleret i metastaser i bulk tumor målinger. disse tre miRNA er imidlertid ikke udtrykkes i de LCM beriget cancer cellepopulationer (figur 2B), og er ikke signifikant udtrykkes i de testede ovarian cancer cellelinjer (fig S7), og således ikke blev undersøgt yderligere.

selvom LCM valgt cancerceller er ikke 100% cancerceller disse observationer antyder kraftigt, at mIR-146a og mIR-150 sandsynligvis udtrykkes i cancerceller, og at deres ekspression opreguleres i oment metastaser. Vigtigt er det, finder vi udtryk for disse miRNA i H . 0,01, *, p 0,05 ved t-test

Spheroids model flercellede aggregater. i ascites i æggestokkene kræftpatienter, der etablerer metastaser [22]. spheroids er en mere nøjagtig gengivelse af tumorer og stigende tegn på, at narkotika reaktioner er bedre modelleret i spheroids end i monolagskultur [23], [24], [25], [26]. Sfæroid dannelse kræver typisk et minimum antal celler, efterfulgt af spontan aggregering, overlevelse under forankringsuafhængig betingelser, og komprimering for at styrke overlevelsen af ​​aggregatet [27]. Til bedømmelse miRNA funktion i sfæroider, danner vi ensartede sfæroider ved podning celler i agarose micromolds [28]. Interessant, alle de udtrykte miRNA er opreguleret i 3D sfæroider forhold til monolag under anvendelse af en Taqman-array-kort (fig S4). Vi testede MIR-146a og MIR-21-ekspression ved Taqman qPCR, anvendelse af primere rettet mod kun disse to miRNA, og reproducerbart observere opregulering af disse to miRNA i sfæroider (figur 4A). For at teste om opregulering af MIR-146a er vigtig for kugleformet dannelse, vi inhiberede MIR-146a med en Locked Nucleic Acid (LNA) inhibitor. MIR-146a inhibering forårsager amorfe mere løst dannede sfæroider i begge SKOV-3 og OVCAR-8 celler efter to dage (figur 4B), sammenlignet med de mere kompakte sfæroider dannet i de negative kontroller. Effekten er mere dramatisk i SKOV-3 end Ovcar-8. På grund af den amorfe karakter af disse tidlige danner dag 2 sfæroider, kunne vi ikke med sikkerhed afgøre deres størrelser. Denne observation tyder på, at tidlig kugleformet dannelse er påvirket af en reduktion af miR-146a-aktivitet. Efter 4 dage, når kontrol sfæroider har mere fuldt dannet efter undergår komprimering, hæmning af miR-146a med en LNA-hæmmer reducerer klumpformet størrelse, sammenlignet med en negativ kontrol LNA, i SKOV-3, men kun beskedent i OVCAR-8 (figur 4C ). 45 sfæroider blev målt i hver gentagelse, og tre uafhængige gentagelser blev udført. Størrelsen af ​​hver sfæroide blev bestemt ved ImageJ og størrelsesfordelingen af ​​sfæroider er repræsenteret med box plots (figur 4C og 4D). Klumpformet dannelse kan være en udfordring på grund af små forskelle i antallet af celler, der anvendes til at pode hver klumpformet. Med agarose forme, vi evaluerer et stort antal sphæroider at overvinde bekymringer med fejl i celle nummer anvendes til frø sfæroiderne i hver brønd giver mulighed for forskellige miRNA afhængige forskelle, der skal overholdes.

24 timer efter transfektion med anti- miR LNA inhibitorer eller præ-mir efterligner som angivet, 700 /pl SKOV-3 eller 600 /pl OVCAR-8 celler blev udsået i 35 brønd agarose micromolds med én sfæroide formning i hver brønd. A. MIR-21 og MIR-146a er opreguleret i 4 dages SKOV-3 og OVCAR-8 sfæroider påvises under anvendelse Taqman qPCR array kort i to replikater. Fejl barer er S.E.M. B. Hæmning af miR-146a med 10 nM LNA forsinkelser klumpformet dannelse og fører til mere amorfe og løsere dannede spheroids i SKOV-3 og OVCAR-8 efter 2 dage. Rød bar er 400 um. C. Box og whisker plot viser at inhibering af MIR-146a med LNAs reducerer sfæroide størrelse efter 4 dage i SKOV-3, og beskedent i OVCAR-8. Repræsentant udtryk vist fra fire gentagelser. D. Ektopisk udtryk for miR-150 og miR-146a forbedrer markant klumpformet dannelse efter 4 dage. SKOV-3 og OVCAR-8 celler blev transficeret med 50 nM af præ-miR MIR-150 og MIR-146a pre-Mirs før sfæroide formation. SKOV-3 eller OVCAR-8-celler blev transficeret som anført. Repræsentative sfæroider er vist. Rød bar er 400 um. Box og whisker plots af størrelsesfordelingen af ​​45 sfæroider fra et repræsentativt eksperiment. Eksperimentet blev gentaget tre gange. P-værdier bestemt ved t-test.

I overensstemmelse med forøget ekspression af miRNA i sfæroider er kritiske for kugleformet dannelse, højere MIR-150 og MIR-146a ekspression fremme større sfæroider i SKOV-3 og OVCAR-8 (figur 4D). Indførelse af miR-150 og miR-146a vise de mest konsekvente og største effekter på sphæroider forhold til den negative kontrol og de andre testede pre-Mirs. For MIR-146a, vi observerer mindre sfæroider når MIR-146a inhiberes (figur 4C) og større sfæroider upon ektopisk ekspression (figur 4D) efter 4 dages sfæroide formation. Tilsammen udgør disse observationer, støtte miR-146a fremmer klumpformet dannelse.

miR-150 og miR-146a stigning cisplatin tolerance

Når metastaser er etableret, kræft i æggestokkene er meget vanskelige at behandle så tilbagevendende resistente tumorer ofte dukke op igen efter indledende kemoterapi. Ændringer i miRNA udtryk kan indikere en anden fysiologisk tilstand for kræftceller i metastaser påvirker, hvordan disse læsioner ville reagere på kemoterapi. Vi testede effekten af ​​forøget ekspression af fire miRNA, opreguleret i oment læsioner, på cisplatin følsomhed. Dosisafhængige undersøgelser under anvendelse Wst-1 assays afslører, at højere ekspression af MIR-150 beskedent øger cisplatin IC

50 i SKOV-3, men ikke OVCAR-8 og IGROV-1 (figur 5A). Andre miRNA, såsom miR-146a, påvirkes enten SKOV-3 eller IGROV-1, men ikke begge i en statistisk signifikant måde.

A. Behandling af celler med præ-MIR-150 mimic beskedent øger cisplatin IC50 i SKOV-3 og IGROV-1, men ikke OVCAR-8 celler. WST-1 assays blev udført 48 timer efter cisplatin-behandling. Grafen viser gennemsnit på 3 biologiske gentagelser. Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. B. Skematisk af cisplatin overlevelse assay. Celler behandles to gange med høje koncentrationer af cisplatin fører til overlevelse med ca. 1% af cellerne. C. MIR-150 og MIR-146a er opreguleret i overlevende celler efter 6 dages 50 pM cisplatin i SKOV-3 og 7 dage af 30 pM cisplatin i OVCAR-8 celler sammenlignet med ubehandlede, prolifererende celler. Dataene er i dublerede og fejl barer er S.E.M. Fold ændring for MIR-150 er meget stor, fordi MIR-150 ikke var påviselig i prolifererende celler. C

t blev indstillet til maksimal testet, 40 cyklus, at estimere fold-change. D. Inhibering af MIR-146a med 10 nM LNA inhibitor reducerer antallet af tilbageværende celler i SKOV-3 og beskedent reducerer de overlevende celler i OVCAR-8 efter 6 dages 50 pM cisplatin i SKOV-3 og 7 dage efter 30 uM cisplatin i OVCAR-8 celler. De overlevende levedygtige celler blev bestemt ved trypan blå-udelukkelse assay. er vist biologiske tredobbelte eksperimenter. Fejl barer er S.E.M. E. Transfektion af 50 nM pre-MIR-146a og præ-MIR-150 øger langtidsoverlevelse efter 6 dages 50 pM cisplatin i SKOV-3 og 7 dage af 30 pM cisplatin i OVCAR-8 celler.

Omhyggelig undersøgelse af cellerne i monolagskultur under cisplatin behandling foreslået, at sundere celler overlevede med højere udtryk miR-146a og miR-150 i høje cisplatin koncentrationer. Det dynamiske område for tilbageværende celler er under detektionsgrænsen af ​​WST-1 assay. Nylige undersøgelser har identificeret reversible drug tolerant hvilende celler der overlever letale koncentrationer af lægemidler [29]. Således undersøgelse af overlevende celler repræsenterer en alternativ model til at undersøge, hvordan kræftceller overlever kemoterapi. For at teste om de metastatiske miRNA fremmer overlevelse i dødelige doser af cisplatin, vi undersøgte miRNA udtryk i overlevende resterende celler i monolagskultur udsat for dødelige doser af cisplatin i 6-7 dage. Vi finder, at miR-150 og miR-146a er betydeligt opreguleret i de overlevende celler i forhold til den stadig populationen (figur 5C). MIR-150 kan ikke påvises i OVCAR-8 celler og under ABI anbefalede tærskelværdi i Skov-3-celler (C

t~36 cykler) i prolifererende celler, men bliver markant udtrykt i resterende overlevende celler i begge cellelinier, hvilket antyder en mulige rolle i at overleve cisplatin. For at teste om MIR-146a påvirker evnen af ​​ovariecancerceller at overleve langsigtet cisplatin behandling, inhibering af MIR-146a med LNAs reducerer antallet af levedygtige overlevende resterende celler beskedent i OVCAR-8, og mere væsentligt i Skov-3-celler (figur 5D). I overensstemmelse med deres øgede udtryk i de overlevende celler, finder vi, at højere udtryk for miR-150 eller miR-146a øger antallet af overlevende levedygtige celler ved trypanblåt udelukkelse assay, seks (SKOV-3) eller syv (OVCAR-8) dage efter tilsætning af dødelige koncentrationer af cisplatin (fig 5E). Trypanblåt er en indikator for antallet af levedygtige celler og afspejler det øgede antal overlevende celler vi observerede visuelt. Ikke alle ektopisk udtrykte miRNA forbedre overlevelsen antyder, at virkningerne af MIR-150 og MIR-146a er specifikke. Disse observationer tyder på, at øget ekspression af miR-150 og miR-146a fremmer overlevelse eller i det mindste, forsinke cisplatin-induceret celledød, i æggestokkene kræftceller.

Diskussion

Vores vigtigste resultater viser, at metastatiske tumorer opregulere specifikke miRNA i forhold til deres primære tumorer, og at blandt disse miRNA, miR-146a og miR-150 fremme 3D klumpformet dannelse og øge tolerancen over for cisplatin i æggestokkene cancerceller, hvilket tyder på en rolle for disse miRNA for overlevelse i specifikke betingelser. Vi observerer betydelig fælles fornyet differentiel regulering af 17 miRNA, hvilket antyder, at kravene til at tilpasse sig den omentum er meget ens i størstedelen af ​​EOC patienter. Tilsammen udgør disse data understøtter ideen om, at oment læsioner er beriget af træk ved aggressiv sygdom, som også medierer patientens respons på kemoterapi. Nogle af disse funktioner, såsom MIR-146a og MIR-150 ekspression kan være unikke for metastaser, som de er meget ringe udtrykt i de fleste primære tumorer i vores datasæt og i TCGA [21]. Lav ekspression af disse miRNA i primære tumorer er forbundet med dårlig samlet patientoverlevelse [21]. Fordi disse miRNA er ofte opreguleret i oment læsioner og højt korreleret med udtryk i primære tumorer (Pearson = 0,7 for miR-150 og 0,78 for miR-146a), forudser vi, at højere udtryk i metastaser vil være forbundet med kortere samlet overlevelse og sygdomsprogression.

Et af målene med denne undersøgelse var at forstå, hvordan ens eller forskellige primære tumorer i æggestokkene er fra oment metastaser. Tidligere bestræbelser sammenligner disse tumorer har anvendt microarray teknologi til at undersøge mRNA ekspressionsniveauerne. Ved hjælp af strenge grænseværdier, blev rapporteret relativt små forskelle mellem primære og metastatiske tumorer [15]. Men en række undersøgelser rapporterer betydelige forskelle ved andre metoder, herunder immunhistokemi af E-cadherin [19], MMP’er [17] og den nylige fund af adipocyt signalering påvirker kræftceller i omentum [8]. miRNA er dukket op som vigtige regulatorer af celle skæbne og talrige miRNA profilering undersøgelser tyder på, at miRNA kan have en større dynamisk område i deres udtryk forskelle på tværs væv gør det muligt at identificere særskilte væv og tumor specifikke udtryk signaturer.

Fordi stromaceller forskellige mellem de to tumorer, nogle af de store miRNA ekspressionsforskelle kan stamme fra disse celler. At identificere, hvilken, om nogen, miRNA ekspressionsforskelle stammer fra cancerceller, udførte vi to eksperimenter. Vi var i stand til at påvise MIR-21 ved ISH, som viser øget MIR-21 ekspression i H & E-farvede cancerceller (figur 2a og figur S5). Disse data viser også, at nogle øgede MIR-21-ekspression i nogle patienter stammer fra stromaceller. For at udføre en mere omfattende analyse, vi kombineret Taqman qPCR arrays med LCM at behandle en beriget kræftcelle befolkning. Disse data viser, at nogle af miRNA identificeret i bulk skærm (MIR-370, MIR-124, MIR-508, MIR-509) sandsynligvis ikke udtrykkes i cancerceller, da de ikke let påvises i LCM beriget population. På den anden side, 11/17 af miRNA, herunder MIR-146a og MIR-150, der er konstateret i bulk tumor, udtrykkes og opretholde tilsvarende udtryk forskelle i LCM beriget cancerceller.

ekspressionsprofil fra både bulk tumor og LCM beriget cancercellepopulationer samt ISH data tyder betydelig opregulering af mIR-21 i metastaser i sammenligning med primære tumorer. MIR-21 er velkendt for at være en anti-apoptotisk, pro-overlevelse miRNA i mange cancere, herunder ovariecancer [30], og vores foreløbige observationer støtter også MIR-21 medvirke til at fremme klumpformet dannelse (data ikke vist). Disse observationer støtter konceptet, at oment metastaser kan vælges til at være mere modstandsdygtige over for kemoterapi har overlevet flygte fra den primære tumor.

miRNA ofte nedregulerer ekspression ved binding af 3’UTR af mRNA’er. Effekten på mRNA-stabilitet og total RNA-niveauer er ofte beskedne [31], [32], kan vurderingen af ​​mRNA-ekspression ændringer være vanskeligt at iagttage. For at få indblik i, hvordan opreguleret metastatiske miRNA er medierende spredning og cisplatin respons, vi evalueret deres forudsagte mål. Vi finder, at miR-21, miR-146a og miR-150 mRNA-mål er betydeligt nedreguleret i forhold til tilfældigt udvalgte tilsvarende størrelse gen sæt (Figur S4), i overensstemmelse med disse miRNA aktivt undertrykker mRNA i metastatiske tumorer.

miR-150 er mest kendt for sin rolle i reguleringen af ​​B-celledifferentiering og timingen af ​​udtrykket er kritisk for dens rette rolle i at fremme B-celle udvikling [33], [34]. De seneste rapporter tyder på, at miR-150 enten kan fremme eller hæmme tumorer [35], [36], [37], [38], der fremhæver det fælles tema for kontekst afhængige funktioner af miRNA [39], [40]. Vi har ikke observere omvendt korrelation med ekspression af tidligere identificerede miR-150 mål P2RX7 [41] eller EGR2 [35] i vore primære /metastatisk tumor data.

MIR-146a er blevet identificeret som en tumor suppressor gennem nedregulering af NFkB aktivatorer IRAK1 og TRAF6 [42], [43]. Imidlertid finder vi, at IRAK1 og TRAF6 ikke udtrykkes i SKOV-3 eller OVCAR-8 ved qPCR (data ikke vist). I nogle sammenhænge, ​​MIR-146a er onkogen, ved at undertrykke BRCA1 [44] eller FAS [45]. Vi har ikke observere betydelig reduktion af BRCA1, BRCA2, eller FAS-ekspression på miR-146a ektopisk udtryk (data ikke vist). Undertrykkelse af BRCA1 ville ikke give mening med øget overlevelse, som faldt BRCA1 /BRCA2 medieret DNA reparation funktioner er forbundet med højere cisplatin følsomhed [46]. Således synes miR-146a til at arbejde gennem en ny mekanisme i æggestokkene kræftceller til at øge overlevelsen.

Vi antager, at ændringer i miRNA udtryk i metastaser i forhold til primære tumorer kan indikere funktioner i metastatisk miljø, der adskiller sig fra den primær tumor miljø. For at begynde at modellere, hvordan disse miRNA kan understøtte vedvarende vækst og overlevelse af metastatiske tumorer, vi indledt en række funktionelle eksperimenter under anvendelse etablerede æggestokkene kræft cellelinjer. Vi brugte gevinst og tab af funktion studier i cisplatin cellelevedygtighedsassays at finde nogen signifikante effekter af miR-146a og miR-150 på narkotika følsomhed eller vækst i æggestokkene cancerceller. Foreløbige undersøgelser kontrol med migration viste ikke signifikante miRNA afhængige effekter (data ikke vist). finder dog, at miR-146a og miR-150 mægle dannelsen og størrelsen af ​​sfæroider. Som kræftceller undslippe den primære tumor og ind i bughulen, de ofte danne aggregater fra 50-750 um i størrelse. Sfæroider ligne disse aggregater isoleret fra patienter [47] og ligner xenotransplantattumorer bedre end monolagskultur [48]. Nogle af de ændringer, såsom øget ekspression af integriner ses i etablerede metastaser er også observeret i disse sfæroider (data ikke vist) og kan afspejle samfundet effekten mere minder om sygdom hos mennesker [19], [47], [49]. Vores observationer, at MIR-146a er opreguleret i humane oment metastaser, med en samtidig reduktion af forudsagte mRNA mål samt sfæroider i forbindelse med forstærkning og tab af funktion assays alle antyder en vigtig rolle for MIR-146a i dannelsen og vedligeholdelsen af ​​metastaser . Disse data understøtter også en rolle for MIR-150, dog uden tab af funktionsdata, de konklusioner baseret på de funktionelle eksperimenter er ikke så stærke. Sammen med cisplatin tolerance assay, understøtter disse data den mulighed, at miR-146a og miR-150 er nødt til at støtte overlevelse i stresssituationer, såsom kugleformet vækst, høje koncentrationer af cisplatin behandling, og tilpasning til nye miljøforhold under udbredelse i patienter.

En advarsel af denne undersøgelse er, at disse cellelinjer ikke kan rekapitulere vigtigste funktioner i kræftceller i tumorer, herunder ekspressionen af ​​miR-150 set i ovarietumorer. Vores manglende evne til korrekt model ovariecancer

in vitro

eller

in vivo

kan tilsløre yderligere funktioner af disse miRNA opreguleret i oment metastaser. Kortsigtede kulturer af nyudvundne cellelinjer eller undersøgelse af miRNA-funktion i dyremodeller kan være nødvendigt at identificere yderligere funktioner af disse miRNA i metastaser. Disse data fremhæve, hvordan nogle miRNA kan være vigtige for overlevelse i specifikke betingelser og er således udvalgt til øget ekspression i metastaser. Fremtidige undersøgelser undersøger miR-146a og miR-150 ved hjælp af

in vivo

modeller og co-dyrkningssystemer kan bidrage til at give indsigt i de funktioner af disse miRNA.

En af de store udfordringer i behandling af fremskreden