PLoS ONE: Vascular CXCR4 Udtryk – en roman Antiangiogenisk Target i Gastric Cancer

?

Abstrakt

Baggrund

G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) er prime kandidater til nye forebyggelses- og behandling af kræft. Vi søgte efter differentielt udtrykte GPCR’ere i node positive gastriske carcinomer.

Metodologi /vigtigste resultater

Differentiel udtryk for GPCRs i tre node positive vs. tre node negative tarm gastriske carcinomer blev analyseret ved gen-array teknologi. Den kandidatgener CXCL12 og dets receptor CXCR4 blev valideret af real-time reverse transkription polymerasekædereaktion i et selvstændigt sæt af 37 gastriske carcinomer. Oversættelse blev undersøgt ved immunohistokemi i 347 gastriske carcinomer ved hjælp væv microarrays samt i 61 matchende lymfeknudemetastaser. Proteinekspression blev korreleret med klinisk-patologiske patientkarakteristika og overlevelse. 52 GPCR og GPCR-relaterede gener var op- eller nedreguleret i knude positiv mavekræft, herunder CXCL12. Differentiel ekspression af CXCL12 blev bekræftet ved RT-PCR og korreleret med lokal tumorvækst. CXCL12 immunopositivitet var negativt forbundet med fjerne metastaser og tumor kvalitet. Kun 17% af gastriske carcinomer viste CXCR4 immunpositive tumorceller, og som var forbundet med højere lokal tumor omfang. 29% af gastriske carcinomer viste CXCR4 positiv tumor mikrokar. Vaskulær CXCR4 udtryk var signifikant forbundet med højere lokal tumor omfang samt højere UICC-etaper. Når udtrykker begge, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor mikrokar, disse tumorer også var stærkt signifikant associeret med højere T- og UICC-etaper. Tre lymfeknudemetastaser afslørede vaskulær CXCR4 ekspression mens tumorceller fuldstændigt manglede CXCR4 i alle tilfælde. Udtrykket af CXCL12 og CXCR4 havde ingen indvirkning på patientens overlevelse.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater underbygger betydningen af ​​GPCRs på biologi gastriske carcinomer og dokumentere, at CXCL12-CXCR4 vej kan være en roman lovende antiangiogenisk mål for behandling af gastriske carcinomer

Henvisning:. Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Müller BM, Lupp a, et al. (2010) vaskulær CXCR4 Udtryk – en roman Antiangiogenisk Target i Gastric Cancer? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10,1371 /journal.pone.0010087

Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 22, 2009; Accepteret: 16 marts 2010; Udgivet: April 8, 2010

Copyright: © 2010 Ingold et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden, ranking fjerde i den samlede frekvens og tegner sig for mere end 650.000 dødsfald om året [1]. Dødeligheden af ​​mavekræft er kun udmærkede ved lungekræft. Tidlig mavekræft ofte forårsager ingen specifikke symptomer. Manglen på tidlige symptomer forsinker diagnosen. Følgelig 80-90% af vestlige patienter med gastrisk cancer stede med avancerede tumorer, når de lokale eller fjerne metastaser havde allerede [1] opstod. Lymfeknuderne status, især forholdet mellem metastase-positive /metastase-negative lymfeknuder, er den stærkeste prognostisk faktor gastrisk cancer [2]. Den 5-årige overlevelsesrate for patienter med 1-6 lymfeknudemetastaser er 44% og slutter med kun 11% i patienter med mere end 15 positive lymfeknuder. Delvis eller total gastrektomi, kombineret med adjuverende strålebehandling og /eller kemoterapi som indikeret, lover fuldstændig helbredelse kun hos patienter med tidlig fase sygdom. I metastatisk sygdom, som i øjeblikket anvendes radioterapeutiske og kemoterapeutiske behandlingsplaner har dårlig virkning og behandlingsresistent sygdomsprogression fører til døden inden for få måneder [3]. Til dato findes der ingen specifik prædiktiv markør som HER2 i brystcarcinom, EGFR i ikke-småcellet carcinom eller K-RAS i colorektal carcinom, som muliggør en mere individualiseret terapeutisk strategi. Derfor er der behov for nye molekylære målrettet behandlingsmetoder.

G-protein-koblede receptorer (GPCR) repræsenterer langt den største familie af celle-overflademolekyler, hvilket relæ signaler via GTP-bindende protein (G-protein ) -initiated second messenger kaskader ind i cellen [4]. GPCRs er reguleret af mange agonister, men alle deler en karakteristisk kerne bestående af syv transmembrane α-helixer, som er forbundet via tre intra- og tre ekstracellulære løkker. Disse receptorer styrer vigtige fysiologiske funktioner, herunder neurotransmission, hormon og enzym løsladelse fra endokrine og eksokrine kirtler, immunrespons, muskelsammentrækning og blodtryk regulering for at nævne et par stykker [4].

Maligne celler ofte kapre den normale fysiologiske funktioner af GPCR’er at overleve, formere autonomt og omgå immunsystemet. Endvidere GPCR’er spiller en central rolle i tumor-induceret angiogenese og cancermetastase. Mange faste tumorer afhængige af GPCR’er at fremkalde en angiogen respons, enten ved at virke på endotelceller eller stromale komponenter direkte eller gennem regulering af frigivelsen eller aktiviteten af ​​andre angiogene mediatorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) eller basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) ved stromale og immunceller [5]. Kræftceller manipulere GPCRs at tiltrække endothelceller og føre dem til invadere tumormassen, hvorved der dannes nye fartøjer til at levere næringsstoffer og ilt. Mange kræftformer metastaserer til specifikke organer, hvad ofte er forårsaget af afvigende ekspression af GPCR i kræftceller – især kemokinreceptorer – samtidig med udgivelsen af ​​kemokiner fra de sekundære organer [6]

Drug delivery, tumor billeddannelse. og biomarkører forudsige malignitet er anvendelser af GPCRs at fremhæve: Radio-mærkede peptider, der binder til GPCRs kan have brede applikationer til kræft diagnose og terapi [7]. Ligander, der binder GPCR’er er også blevet konjugeret til cytotoksiske midler til specifikt at målrette maligne celler, der overudtrykker disse receptorer, derfor reducere bivirkninger [8]. Desuden kan GPCR’ere være værdifulde biomarkører for kræft diagnose som dokumenteret af undersøgelser i prostatakræft [9].

Derfor har vi rettet til (i) vurdere differentielt udtrykte GPCRs i nodal negativ versus nodal positive tarm typen gastrisk karcinom ved GeneChip-array teknik. (Ii) Transkription af kandidatgener blev valideret af real-time reverse-transkription polymerasekædereaktion (real-time RT-PCR). Vi evaluerede oversættelse og histoanatomical fordeling af kemokin CXCL12 og dens tilsvarende kemokinreceptor CXCR4 i en stor serie af 347 gastriske carcinoma prøver immunhistokemisk under anvendelse af væv microarray-teknologi såvel som i 61 matchende lymfeknudemetastaser på konventionelle objektglas (III). Vi korreleret de translationelle ekspressionsmønstre med en rigelig sæt klinisk-patologiske patientkarakteristika, herunder patient overlevelse (iv).

Resultater

Differential genekspression i node negative og node positiv mavekræft væv

først studerede vi den differentielle ekspression af mRNA i en serie af 6 intestinal typen patienter mavekræft (3 med og 3 uden lymfeknudemetastaser) under anvendelse af GeneChip® human Genome U133 Plus 2.0 Array fra Affymetrix, der detekterer 47.000 transkripter og varianter såvel som 38.500 godt karakteriserede humane gener. mRNA blev ekstraheret og transskriberes kun fra vævsprøver opnået fra de primære tumorer. I alt 115 transkripter fandtes at være op- og 219 at være nedreguleret i knudepunkt positiv mavekræft sammenlignet med node negative gastriske cancere (tabel S1). Næste vi søgt efter differentielt udtrykte GPCRs. Vi identificerede 52 GPCR og GPCR-relaterede gener, som var op- eller nedreguleret med en fold ændring faktor . 1.5 (tabel S2)

I silico

analyse

Vi søgte derefter på

ENTREZ

database med de “

National center for Biotechnology Information (NCBI)

” for registreringer under GPCR’ere og GPCR-ligander og deres formodede rolle i tumor biologi . Betydningen af ​​angiotensin II type 1-receptoren i gastrisk cancer er tidligere bekræftet af vores egen gruppe [10]. Flere undersøgelser har vist, at ekspressionen af ​​Duffy-blodgruppe chemokinreceptor (DARC) korreleret omvendt med forekomsten og prognose af prostatacancer [11] – [13]. I dyremodel for brystkræft ekspressionen af ​​EDG2 korreleret med forekomsten af ​​lungemetastaser [14]. FPRs medierer virkningen af ​​annexin 1 på cellemotilitet og invasion, som er vigtige for den metastatiske potentiale af tumorceller [15]. LGR5 blev for nylig vist at være en stamcelle markør for celler i tyndtarmen og colon og stamcelle specifik tab af aPC resulterer i gradvis voksende neoplasier [16]. Kollektivt, disse data dokumenterer, at vores tilgang identificerede GPCR’ere og GPCR-ligander, der kan være involveret i mavekræft biologi. Vedrørende chemokinreceptorer og chemokiner, blev ekspressionen af ​​chemokiner CCL2 og CXCL12 steg i nodal positiv gastrisk cancer sammenlignet med nodal negative tilfælde (supplerende tabel S2). Siden CXCL12-CXCR4 aksen spiller en fremtrædende rolle i tumorudvikling, fremme angiogenese og migration af tumorceller til metastatiske steder [17] – [19], valgte vi CXCL12 og dets receptor CXCR4 for yderligere analyser

Transskription af. CXCL12 og CXCR4 i mavekræft

Den differentielle udtryk for CXCL12- og CXCR4-mRNA blev valideret af real-time RT-PCR i et uafhængigt sæt 37 tarm typen gastrisk karcinom prøver. Vi sammenlignede ikke-neoplastisk slimhinde med den primære tumor samt primære tumorer i node negativ med primære tumorer i node positive kræftformer.

CXCL12 udtryk blev øget betydeligt i gastrisk karcinom sammenlignet med ikke-neoplastiske slimhinde (p = 0,033 ). Bekræftelse array data, CXCL12 udtryk var også opreguleret i nodal positive gastrisk karcinom sammenlignet med nodal negative sager. Men denne forskel ikke statistisk signifikans (p = 0,132; figur 1a). Vedrørende lokal tumorvækst, var der ingen signifikant forskel i CXCL12 udtryk i PT1 /T2 etape tumor versus PT3 /T4 tumorer. Men interessant, viste CXCL12 udtryk en signifikant sammenhæng i PT1 /pT2a versus pT2b /T3 /T4 (p = 0.049; figur 1b)

Boxplots skildrer overordnede fordeling af CXCL12 i (a) nodal negativ versus nodal positive gastrisk. carcinomer og i (b) PT1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 gastriske carcinomer. Samlet fordeling af CXCR4 i (c), nodal negativ versus nodal positive gastriske carcinomer og (d) PT1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 gastriske carcinomer. Box grænser: 25

th og 75

th percentiler; optrukket linie: median; whiskers:. 10

th og 90

th percentiler

Der var hverken en forskel på CXCR4 udtryk i gastrisk karcinom versus ikke-neoplastisk væv (p = 0,229) og heller ikke i nodal negativ versus nodal positiv gastrisk karcinom (p = 0,22, figur 1c). Sammenligning CXCR4 udtryk med den lokale tumor omfang, CXCR4-mRNA-niveauer øges med den lokale tumorvækst. (P = 0,079; figur 1d)

Oversættelse af CXCL12 i gastrisk karcinom, korrelation med klinisk-patologiske parametre og overlevelse analyser

oversættelse og histoanatomical fordeling af CXCL12 blev efterfølgende undersøgt af immunhistokemi i 347 gastrisk karcinom prøver. I 291 tilfælde, CXCL12 immunoreaktivitet var vurderbare. Tumorceller udtrykte CXCL12 i 244 af 291 (84%) prøver. En stærk cytoplasmatisk og membranøs immunreaktion blev observeret i 143 (49%) tilfælde og en svag farvning i 101 (35%). 47 tumorer (16%) manglede CXCL12-immunreaktivitet. Alle tumorprøver viste et klart CXCL12 positivitet af de vaskulære endotelceller, som tjente som en intern positiv kontrol (figur 2a-c). De statistiske analyser viste en signifikant korrelation mellem ekspressionen af ​​CXCL12 i tumorceller og fjerne metastaser (p = 0,043) samt tumor bedømmelse (p = 0,0064). Alle andre klinisk-patologiske parametre viste ingen sammenhæng med CXCL12 udtryk i tumorceller (tabel 1). Når dividere kohorte i to grupper, dvs. intestinal type og diffus art gastrisk carcinom, blev ingen korrelation fundet mellem CXCL12 ekspression og enhver klinisk-patologisk parameter for nogen af ​​grupperne (data ikke vist). Den CXCL12 udtryk i tumorceller ikke havde nogen indvirkning på patientens overlevelse (hele gruppen: p = 0,830; tarm typen karcinom: p = 0,766; diffus typen karcinom: p = 0,817)

Gastric carcinoma prøver afslører stærk (a. ) og svage (b) CXCL12 immunoreaktivitet. Kun få tilfælde var CXCL12 negative (c). Bemærk positiv CXCL12 farvning af blodkar (pil). Gastric carcinoma prøver viser en klar cytoplasmatisk og membranøs CXCR4 immunoreaktivitet blev sparse (d). Kun få prøver afslørede en svag (e) CXCR4 farvning mens de fleste af tumorerne manglede CXCR4 udtryk (f). Leukocytter tjente som intern positiv kontrol (pile). Målestok: a-f: 50 pm

Oversættelse af CXCR4 i gastrisk karcinom, korrelation med klinisk-patologiske parametre og overlevelse analyser

Oversættelse af CXCR4 blev også undersøgt ved immunhistokemi.. Immunoreaktivitet i tumorceller var vurderbare i 293 tumorprøver, hvoraf kun 6 (2%) viste en utvetydig membranøs farvning (kategori 2+; figur 2D). De fleste af de CXCR4 positive tumorprøver kun afsløret en svag cytoplasmatisk CXCR4 immunoreaktivitet (kategori 1+, 44 tilfælde, 15%; figur 2e). Nuclear CXCR4 immunreaktivitet blev ikke observeret i alle tilfælde, og en hvilken som helst celletype. En samlet på 83% (243 af 293) af de gastriske carcinomer var immunonegative for CXCR4, de fleste af dem viser samtidig CXCR4 positive leukocytter som en intern positiv kontrol (figur 2f). Interessant, som tidligere observeret i colorektale carcinomer, 86 293 gastriske carcinomer (29%) viste CXCR4 positive mikrokar i tumoren stroma med en stærk CXCR4 immunreaktivitet af endotelceller (figur 3A). Den vaskulære karakter af disse delikate strukturer blev bekræftet af en CD34 immunfarvning (figur 3b).

Gastric carcinoma prøver viser stærk vaskulær CXCR4 immunoreaktivitet eller mangler CXCR4 udtryk (a, c), angivet med pile. Vaskulære strukturer blev bekræftet ved en CD34 immunfarvning (b, d). Målestok: a-d: 50 pm

Når korrelere CXCR4 udtryk i tumorceller med forskellige klinisk-patologiske parametre blev CXCR4 udtryk signifikant associeret med højere lokal tumor grad (T-status; p = 0,030).. Der blev imidlertid ikke yderligere sammenslutninger af tumoral CXCR4 udtryk og andre klinisk-patologiske variabler fundet (tabel 2). Ved analyse undergruppen af ​​tarm gastriske carcinomer, blev der ikke associationer fundet med nogen klinisk-patologisk parameter (data ikke vist).

Så vi studerede sammenhængen mellem CXCR4 udtryk i endotelceller (vaskulær CXCR4 udtryk, vCXCR4 ) af tumor mikrokar og forskellige klinisk-patologiske parametre. Interessant ekspressionen af ​​CXCR4 i mikrokar korrelerede stærkt signifikant med den lokale tumorvækst (T-kategori; p = 0,0001) såvel som med UICC-tumor fase (p = 0,0059). Selv i de undergrupper af intestinal type og diffus typen gastrisk karcinom, blev vCXCR4 udtryk signifikant associeret med lokal tumor omfang (tarm seværdighed: p = 0,004; diffus seværdighed: p = 0,030) og UICC-tumor stadie (tarm seværdighed: p = 0,020) . Endvidere vCXCR4 ekspression blev signifikant associeret med patientens alder (p = 0,0148) i hele gruppen (tabel 3).

Survival analyse viste, at CXCR4 ekspression i tumorceller af gastrisk karcinom samt i tumor mikrokar ikke havde nogen indvirkning på overlevelse

Samtidig CXCL12 /vCXCR4 udtryk i gastrisk karcinom

Siden CXCL12-CXCR4 aksen har vist sig at være involveret i tumor progression [17] – [19]., vi undersøgte korrelationen af ​​samtidig udtryk for CXCL12 og vCXCR4 med klinisk-patologiske parametre. Faktisk blev CXCL12-vCXCR4 positive tumorer forbundet med højere lokal tumor grad (p = 0,0014) og højere UICC stadier (p = 0,017). Men det havde ingen indvirkning på patientens overlevelse, selv i de undergrupper af tarm og diffus typen gastrisk karcinom.

Expression mønster af CXCL12 og CXCR4 i matchende lymfeknudemetastaser

De CXCL12-CXCR4 akse er blevet rapporteret at være involveret i metastatiske processer i forskellige tumor enheder. Derfor undersøgte vi CXCL12 og CXCR4 immunoreaktivitet i en delmængde af 61 matchende lymfeknudemetastaser. Den CXCL12 ekspressionsmønster var tilgængelig for 46 metastaser. Samlet set 4 lymfeknudemetastaser var CXCL12 negative ligesom deres tilsvarende primære tumor. 40 lymfeknudemetastaser viste en klar CXCL12 positivitet efter den primære tumor. Den farvningsintensitet var meget heterogen viser stærkt positive tumorceller støder op til svagt farvet tumor celle klynger. Men to metastaser afslørede CXCL12 immunoreaktivitet selv om der ikke er konstateret CXCL12 udtryk i den primære tumor.

CXCR4 immunoreaktivitet blev vurderet i 54 lymfeknudemetastaser. Interessant ingen af ​​dem viste nogen CXCR4 ekspression. Selv de tumorer (n = 6), der viser en svag CXCR4 positivitet i den primære tumor, manglede CXCR4 ekspression i de tilsvarende lymfeknudemetastaser. Imidlertid afslørede alle lymfeknudemetastaser klart CXCR4-positive lymfocytter, der tjente som intern positiv kontrol. Interessant nok i tre tilfælde intratumoral CXCR4 positive mikrokar var påviselige.

Diskussion

G-protein-koblede receptorer udgør den største familie af transmembrane receptorer. Fem procent af alle humane gener koder for mere end 800 forskellige GPCR og cirka 80 forskellige ligander blev identificeret indtil nu [20]. GPCRs er de mest almindelige farmakologiske mål inden for medicin, dvs. næsten 30% af alle lægemidler er rettet mod GPCRs. Beviser er stigende, at GPCRs også kan være lovende mål for kræftbehandling. I denne undersøgelse sigtede vi mod at finde GPCR’er der udtrykkes differentielt i knudepunkt positive gastriske cancere og dermed kan betragtes som fremtidige mål for mavekræft behandling. Vi fandt 52 ​​GPCR og GPCR-relaterede gener, som er op- eller nedreguleret i knude positiv primær mavekræft væv sammenlignet med node negativ kræft. Flere af GPCRs blev tidligere vist at være involveret i tumor biologi, såsom AT1R, EDG2, DARC, og FPR1 [10], [11], [14], [15]. Mest interessant, vores liste også LGR5 [16], som for nylig blev vist at være en stamcelle markør i tyndtarmen og tyktarmen. Desuden specifikke tab af Apc i LGR5-positive celler resulterer i en gradvis voksende neoplasier. Således

i silico

validering af vores data støttede den hypotese, at GPCRs er involveret i tumor biologi mavekræft.

Vores efterfølgende valideringsundersøgelser ved hjælp af en gruppe af uafhængige patienter viste, at GPCR- ligand CXCL12 udtrykkes i tumorceller hos flertallet af gastriske carcinomer. Endvidere er CXCL12 ekspression negativt associeret med fjerne metastaser og tumor kvalitet. Tværtimod kun 17% af gastriske carcinomer viste CXCR4 immunpositive tumorceller, og som var forbundet med højere lokal tumor omfang. Interessant, omkring en tredjedel af de gastriske carcinomer viste CXCR4 positiv tumor mikrokar. Vaskulær CXCR4 udtryk var signifikant forbundet med højere lokal tumor omfang samt højere UICC-etaper. Når udtrykker begge, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor mikrokar, disse tumorer blev også signifikant associeret med højere T- og UICC-etaper, støtte rolle CXCL12-CXCR4 akse i neoangiogenese af mavekræft.

blandt GPCR’er, chemokinsystemet bidrager væsentligt til tumorudvikling gennem modulering af den lokale inflammatoriske reaktion, tumorcelleproliferation, migration og overlevelse samt neoangiogenese [4]. Kemokinreceptoren CXCR4 oprindeligt blev fundet at regulere målsøgning af lymfocytter i inflammation og betegner en co-receptor for human immundefekt virus (HIV) [21]. Fysiologisk er CXCL12-CXCR4 aksen involveret i migrationen af ​​embryonale celler i centralnervesystemet, knoglemarv og hjerte [22], [23]. Det spiller en kritisk rolle i metastatiske processer som vist for bryst- [24], [25], ovarie- [26] og prostatacancer [27] og CXCL12 er højt udtrykt i organer, der er hyppige steder af fjerne metastaser som lunge, lever og lymfeknuder knuder [28]. I gastrisk karcinom, data vedrørende CXCL12-CXCR4 vej er sparsomme [29]. Der er tegn på, at CXCR4 udtrykker gastriske carcinomer mere sandsynligt udvikle en peritoneal spredning af tumoren, og malign ascites indeholder høje koncentrationer af CXCL12 [30].

Sammenligning vores genarray data med dem, der opnås ved RT-PCR og immunhistokemi, var det interessant at bemærke, at den differentierede udtryk for CXCL12 i knude positiv gastrisk karcinom blev bekræftet på det transkriptionelle men ikke på translationel niveau. Her immunohistokemisk påvisning af CXCL12 i tumorceller korrelerede kun med fjerne metastaser og tumor kvalitet, men ikke med nodal spredning. Imidlertid CXCL12 blev fundet ikke kun i tumorceller, men også i endotel- og stromale celler [31], og den samlede ekspression i hele vævsområderne, er vanskeligere at vurdere ved immunhistokemi. Tværtimod vores transkriptionelle undersøgelser brugte vævshomogenisater som integrerer alle CXCL12 udtrykker celler i tumorvæv. har ikke desto mindre, det skal holdes for øje, at gentranskription ikke altid hænger sammen med mRNA translation og at tumoren biologiske effekt af CXCL12 kan også afhænge af tilstedeværelsen og histoanatomical fordeling af CXCR4. Til støtte for denne påstand, var vi i stand til at vise, at samtidig udtryk for CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor mikrokar korreleret med lokal tumorvækst og UICC-tumor stadie.

Det blev rapporteret, at tumor-CXCR4 positivitet betydeligt korrelerer med udviklingen af ​​peritoneal carcinomatose [30]. Endvidere blev stærk CXCR4 udtryk signifikant associeret med lymfeknudemetastaser, højere stadier UICC og en reduceret 5-års overlevelse [32]. Vores resultater synes at afvige fra disse tidligere undersøgelser. Ved vurdering CXCR4 immunoreaktivitet i tumorceller, blev en lav udtryk observeret. Kun 17% af tumorprøverne viste en hovedsagelig svag CXCR4 immunoreaktivitet. Desuden manglede alle 61 matchende lymfekirtelmetastaser CXCR4 udtryk. Dette farvningsmønster kan forklare, hvorfor fx i intestinale gastriske carcinomer, CXCR4 ekspression kun var signifikant associeret med den lokale tumorvækst (T-kategori) men ikke med andre klinisk-patologiske faktorer som tidligere beskrevet. Vi anvendte en grundigt karakteriseret CXCR4 antistof med en højere specificitet end kommercielt tilgængelige antistoffer som vist ved Fisher og kolleger [33]. Denne forskel i specificitet kunne tjene til forskellige farvningsmønstre. For eksempel blev en nuklear CXCR4 ekspression, som blev rapporteret at være associeret med lymfeknudemetastaser i colorektal cancer, ikke set i vores serie [34]. Desuden aldrig opdaget vi CXCR4 positivitet i stromale celler som beskrevet i en undersøgelse af Saigusa og kolleger [35]. For at tydeliggøre, hvis CXCR4-CXCL12 vej i sidste ende bidrager til generation af metastaser i gastrisk karcinom, især lymfeknude metastaser, er behov for yderligere undersøgelser.

Omkring en tredjedel af de undersøgte gastriske carcinomer viste CXCR4 positiv tumour- omkringliggende mikrokar . Tumorceller kræver tilstrækkelig forsyning af ilt og næringsstoffer til at opretholde overlevelse. Selv med genetiske abnormiteter, der dysregulate vækst og overlevelse af de enkelte celler, kan tumorer ikke forstørre ud over 1-2 mm

3 uden vaskularisering og hypoxi-induceret celledød indtræffer. Det er blevet vist, at CXCR4 udtrykkes af endotelceller og stimulering af CXCR4 ved CXCL12 har en proangiogen virkning [36]. Desuden CXCR4 er en hypoxi inducerbart gen, reguleret af hypoxi-induceret faktor 1α (HIF1α). Når ilt er knappe ligesom i hastigt voksende tumorer, HIF1α forstærker udtrykket CXCR4 [37]. Den forøgede ekspression af CXCR4 i endotelceller observeret i vores tumor kollektiv kunne være del af en integreret hypoksisk respons af den voksende tumor, der giver mulighed for dannelsen af ​​nye blodkar. I vores studiegruppe, vaskulær CXCR4 udtryk korrelerede signifikant med omfanget af lokal tumorvækst. I 8% af T1 /pT2a tumorer (4 af 52) og i 34% af T2b /T3 /pt4 tumorer (81 af 239) CXCR4 positive mikrokar var påviselige. T2b /T3 /T4-trins gastriske carcinomer mere sandsynligt huser en hypoxisk mikromiljø end T1 /T2a-trins tumorer og derved kan fremkalde CXCR4 genekspression og angiogenese. Påvisning af CXCR4 positive mikrokar i store lymfeknudemetastaser ( 9 mm i diameter) bekræftet disse observationer. Desuden har vi tidligere vist sammenlignelige resultater i colorectalt carcinom [38]. Derudover, som vist i glioblastoma multiforme [39], tumorprøver afslører både, CXCL12 positive tumorceller og CXCR4 positive mikrokar blev stærkt signifikant associeret med høj lokal tumor omfang og høj UICC stadier, yderligere underbygger betydningen af ​​en funktionel CXCL12-CXCR4 akse i gastrisk cancer biologi

sammenfattende viser vi, at GPCR’er differentielt udtrykkes i gastrisk cancer væv og kan bidrage til tumoren biologi:. tumorer udtrykker både, CXCL12 i tumorceller og CXCR4 i tumor omkring mikrokar, viser en stærkt signifikant sammenhæng med lokal tumorvækst og UICC etaper. Disse resultater, sammen med vores tidligere data om colorektal carcinom, underbygge rolle CXCL12-CXCR4 aksen i tumor-neoangiogenese i gastrointestinale tumorer. Den CXCL12-CXCR4 vej kan være nye lovende antiangiogene mål for behandling af gastriske carcinomer.

Materialer og metoder

Tumorprøver

Vævsprøver af mavekræft blev opnået kirurgisk på Charité University Hospital Berlin (1995-2008). Frisk frosset væv af 6 tilfælde af intestinal type, gastrisk karcinom blev anvendt til GeneChip analyse (nodal negativ: 3 patienter, nodal positiv: 3 patienter, kvinde-mand-ratio: 01:02). En uafhængig serie af parrede kræft og tumor-tilstødende normale væv fra 37 tarm gastriske carcinomer blev undersøgt ved real-time RT-PCR (nodal negativ: 12 patienter, nodal positiv: 25 patienter; kvinde-mand-forholdet: ~1:1 for detaljerede patientkarakteristika se tabel S3). For immunhistokemiske analyser blev en patient kohorte af 347 konsekutive patienter med mavekræft undersøgt, bestående 194 tarm type og 122 diffuse typen carcinomer i henhold til Lauren klassificering. 31 prøver viste andre histologiske undertyper (dvs. mucinous, rørformet, udifferentieret). Kort beskrevet kohorten bestod af 220 mænd og 127 kvinder. Den gennemsnitlige alder af patienterne på diagnosetidspunktet var 64 år. Survival data var tilgængelige fra 196 af disse patienter. Opfølgende data for de andre patienter manglede, fordi disse patienter ikke var bosiddende i nærheden af ​​hospitalet og blev tabt for opfølgning. Ud af 196 patienter, 124 døde under opfølgning. Median opfølgning for de patienter stadig i live ved endepunkt analysen var 33 måneder. Af 61 patienter, væv matchende lymfeknudemetastaser var til rådighed (27 intestinal type, 26 diffus type, 8 andre histologiske undertyper). Kun patienter med histologisk bekræftet gastrisk cancer og passende væv rådighed blev medtaget. Patienter med neoadjuvantly behandlet gastrisk karcinom eller andre kendte maligniteter blev udelukket fra undersøgelsen. Dette projekt blev godkendt af den lokale etiske komité (ref. Nummer EA1 /06/2004).

GeneChip analyse

Totalt RNA blev isoleret med phenol-chloroform ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit ( Ambion, Austin, USA). Kontaminerende DNA blev fjernet ved DNase-behandling (Turbo DNAfree kit, Ambion, Austin, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Vi brugte GeneChip® Human Genome U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol til at analysere mRNA-ekspressionsniveauer. Affymetrix GeneChip® Operating Software (GCOS 1.4) automatiserer kontrollen med GeneChip® Fluidik Stationer og GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatik

Rå data blev analyseret med Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS 1.4) . Påvisningen p-værdi på et transkript bestemmer påvisning opkald, som angiver, om udskriften er pålideligt detekteres (p 0,05; stede) eller ikke påvist (fraværende). For at aktivere sammenligningen mellem chips dataene blev skaleret til en global intensitet på 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) og GeneSpring softwarepakke 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) blev anvendt til gennemsnitlige resultater fra forskellige prøver og statistisk analyse for at sammenligne mellem mavekræft med (N1) og uden (n0) lymfeknudemetastaser. Dataene i seks arrays blev normaliseret at tage højde for variation i hybridisering til probepar og andre hybridiseringsbetingelser artefakter. Normaliseringen består af følgende tre trin: først, transformation data (sæt målinger mindre end 300.0 til 300,0); sekunder, pr chip (normalisere hver chip til den 50. percentil af målingerne fra denne chip); og tredje, pr gen (normalisere hvert gen til medianen af ​​målingerne for dette gen). Den fold ændring blev beregnet for hvert gen som det aritmetiske gennemsnit af de normaliserede udtryk værdier af N1 divideret med det aritmetiske gennemsnit af de normaliserede udtryk værdier N0. Rådata fra microarray eksperimenter blev uploadet til Gene Expression Omnibus Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc acc=GSE17187).

Real-time revers transkriptase polymerasekædereaktion

I cDNA-syntese, 2 ug totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af Omniscript RT Kit (Qiagen). De gen-specifikke primere blev designet af den BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlin, Tyskland). Primer sekvenser var som følger: CXCR4 5’CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3 ‘CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 ‘CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3’CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG;