PLoS ONE: Kombination af cirkulerende tumorceller med Serum carcinoembryonisk antigen Forhøjer Klinisk Forudsigelse af ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er dukket op som en potentiel biomarkør i diagnose, prognose, behandling, og overvågning af lungekræft. Men CTC påvisning er ikke kun dyrt, men dens følsomhed er også lav, hvilket begrænser dets anvendelse og indsamling af solide data vedrørende betydningen af ​​CTCs i lungekræft. Vi havde til formål at søge kliniske variable, der forbedrer forudsigelsen af ​​CTCs hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Kliniske prøver og patologiske data blev indsamlet fra 169 NSCLC patienter. CTCs blev påvist ved CellSearch og tumormarkører blev påvist under anvendelse Luminex xMAP assayet. Univariate analyser afslørede, at histologi, tumor stadium, tumorstørrelse, invasivitet, tumorklassificering og carcinoembryonisk antigen (CEA) var forbundet med tilstedeværelsen af ​​CTCs. Imidlertid blev niveauet af CTCs ikke forbundet med graden af ​​lymfeknudeinvolvering (N) eller tumor prognostiske markører Ki-67, CA125, CA199, Cyfra21-1, og SCCA. Brug logistisk regressionsanalyse, fandt vi, at kombinationen af ​​CTCs med tumormarkør CEA har en bedre sygdom forudsigelse. Fremskredent stadium NSCLC patienter med forhøjet CEA havde højere antal CTCs. Disse data tyder på en nyttig forudsigelse model ved at kombinere CTCs med serum CEA i NSCLC patienter

Henvisning:. Chen X, Wang X, han H, Liu Z, Hu JF, Li W (2015) Kombination af cirkulerende tumorceller med Serum carcinoembryonisk antigen Forhøjer Klinisk Forudsigelse af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (5): e0126276. doi: 10,1371 /journal.pone.0126276

Academic Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA

Modtaget: November 1, 2014 Accepteret: 31 Marts 2015; Udgivet: 21. maj 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af California Institute of regenerativ medicin (CIRM) (RT2-01942), National Natural Science Foundation of China (KN) (# 81.071.920, # 81.372.835, # . 81272294, # 31.430.021), Jilin provinsen Videnskab og Teknologi Institut (11ZDGG003, # 20.120.720) og National Health and Family Planning Kommissionen for Folkerepublikken Kina (CN) (# 2.001.133)

Konkurrerende interesser: de forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for 75-80% af lungekræfttilfælde. NSCLC typisk ikke diagnosticeret indtil sygdommen har nået et fremskredent stadium, hvilket fører til lave overlevelsesrater, med en 5-års overlevelse på 20% [1,2]. En række biomarkører er blevet anvendt i klinikken som prognostiske markører for NSCLC-patienter. Disse indbefatter carcinoembryonisk antigen (CEA), cancer antigen (CA) -199, CA-125, pladecellecarcinom antigen (SCC-Ag), og cytokeratin-19-fragmenter antigen 21-1 (CYFRA21-1). Forhøjede niveauer af disse markører er blevet forbundet med dårlig prognose [3-12]. Blandt dem, CEA og CYFRA 21-1 er de mest følsomme tumormarkører i NSCLC [13,14].

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er tumorceller, der forlader den primære tumor stedet og ind i blodbanen, hvor de kan sprede sig til andre organer. CTCs kan identificeres i det perifere blod ved histologisk farvning for epitelial og cancer-markører. I øjeblikket er den eneste afsløring kit godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) er den CellSearch systemet (Veridex, NJ), som bruger specifikke antistoffer til at identificere og kvantificere CTCs i en 7,5 prøve ml blod.

Til dato, er fortsat uklart rolle CTCs i NSCLC. For eksempel, mens nogle undersøgelser korrelerer CTCs med dårlig prognose [15-18], andre fandt ingen sammenhæng [19]. En nylig meta-analyse af 20 undersøgelser med i alt 1576 patienter viste, at tilstedeværelsen af ​​CTCs var forbundet med dårlig prognose i NSCLC-patienter [20]. Notatet den prognostiske værdi CTCs stadig kontroversielt. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at ca. 30% af NSCLC-patienter har mindst én CTC pr 7,5 ml blod, og ca. 15% af NSCLC-patienter har fem eller flere CTCs pr 7,5 ml blod, med højere CTC-niveauer i patienter med spredte metastaser [ ,,,0],15, 21-22]. Ud over sin lave følsomhed, har den høje pris på CTC afsløring gjort det vanskeligt at blive en rutinemæssig klinisk test for NSCLC, især i kinesiske befolkningsgrupper.

For at opnå en bedre forståelse af betydningen af ​​CTCs i NSCLC, vi har igangsat et prospektivt, enkeltinstitutionsforsøget at karakterisere CTCs i NSCLC patienter og undersøgt forholdet mellem CTCs og andre kliniske faktorer. Vi havde til formål at teste hypotesen, at tilstedeværelsen af ​​CTCs i kombination med tumor biomarkører bedre kunne forudse tumorindtrængen i NSCLC patienter.

Materialer og metoder

studiepopulation

Denne undersøgelse blev udført på det første hospital i Jilin Universitet (Changchun, Jilin, Kina). Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Første Hospital i Jilin Medical University, og udført i henhold til Helsinki-erklæringen principper. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle tilmeldte patienter forud for eventuelle indgreb. Patienter med histologisk bekræftet NSCLC var støtteberettigede. Før behandling blev Tumor Knude Metastase (TNM) iscenesættelse (7. udgave) vurderet af Computated Tomography (CT) scanninger [23].

CTC analyse

CellSearch systemet (Veridex, NJ, USA) blev anvendt til at kvantificere CTCs i 7,5 ml blodprøver trukket fra patienter inden for syv dage før behandlingen (defineret som baseline). Blodprøver blev opsamlet i 10 ml CellSave (Veridex) konserverende rør, opbevaret ved stuetemperatur og behandles inden for 96 timer efter opsamling, ifølge producentens instruktioner. CTCs er defineret som celler med runde til ovale morfologi, a, 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) positiv kerne af 4 uM eller større, positiv cytoplasmatisk farvning for cytokeratiner (CK-8, CK-18, og CK -19), og fraværet af CD45-ekspression.

Tumor markør analyse

Sera blev separeret fra en 2 ml prøve af koaguleret blod fra hver patient. En Luminex xMAP assay (Luminex, Austin, TX, USA) var brug for at detektere tumormarkører carcinoembryonisk antigen (CEA), cancer antigen (CA) -199, CA-125, pladecellecarcinom antigen (SCC-Ag), og cytokeratin -19 fragmenter antigen 21-1 (CYFRA21-1). Niveauet af hver markør blev sammenlignet med de normale referenceværdier af 5 ng /ml CEA, 35 U /ml CA19-9, 35 U /ml CA125, 1,5 ng /mL SCC, og 5 ng /ml CYFRA21-1. På grund af grænsen for serum volumen, kun 109 patienter havde deres serum analyseres for CEA niveauer, 70 patienter til CA125, 76 patienter til CA199, 107 patienter til CYFRA21-1, og 75 patenter for SCCA.

Patologi eksemplar og immunhistokemi

Tumor prøver blev opnået fra patienter med stadie IIIB eller IV NSCLC for patologisk analyse. Tumorprøver blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin, skåret i 4 mm sektioner og fastgjort til objektglas. Celleproliferation blev vurderet ved immunohistokemi under anvendelse af et monoklonalt antistof mod Ki-67 (MAIXIN-BIO Inc., Kina). Ki-67 farvning i færre end 25% af cellerne blev betragtet negativt, mens farvning i 25% af cellerne blev betragtet som Ki-67 positive [24].

Statistisk analyse

Individuelle variabler blev vurderet ved univariat analyse ved anvendelse af chi i anden-test. Risiko nøgletal blev beregnet for hver variabel for at vurdere den prædiktive værdi for CTCs. Logistisk regressionsanalyse blev anvendt til at vurdere forholdet mellem CTC tæller og klinisk-patologiske data. Alle analyser blev udført ved anvendelse af SPSS v19.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). For alle analyser, en

s

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

patientkarakteristika

Et hundrede og tres-ni patienter med NSCLC blev rekrutteret i perioden juli 2012 og januar 2014 og deres egenskaber blev registreret (tabel 1). CTCs blev kvantificeret fra en 7,5 ml prøve blod for hver patient (figur 1). Den mediane follow-up periode var 1,1 år. Således ville overlevelsesanalyse ikke gennemføres på denne kohorte population. Samlet, forudsigelse af NSCLC ved CTCs var relativt lav i vores kohorte prøver. I alt 169 NSCLC patienter, kun 40 (23,7%) patienter udviste positiv CTC detektion ( 1 pr 7,5 ml blod), i en lignende aftale med det rapporterede i de vestlige befolkning [15, 21-22]

.

Positiv immunomagnetisk udvalg med anti-EpCAM Ab blev efterfulgt af morfologisk bekræftelse med farvning for cytokeratiner (cytoplasma), DAPI (kerne), og CD45 (negativ).

Interessant, vores cohort prøver udviste en forholdsvis lav andel af kvindelige patienter (33,7%) sammenlignet med vestlige lande, hvor NSCLC er mere udbredt hos kvinder [1-2]. Det kunne være muligt, at forskelle i etnicitet og ætiologiske faktorer af NSCLC patienter kan redegøre for denne uoverensstemmelse. For eksempel rygning er forholdsvis lav i kinesiske kvinder.

univariat analyse af CTC tæller med klinisk og patologisk

data

I sammenhæng analyser, fandt vi ingen signifikant association af CTC tæller med køn, alder, rygning status, og placering af primær tumor (tabel 2). Imidlertid blev histologisk type, positivt associeret med CTCs (p 0,05 for CTC tærsklerne ≥ 1 og ≥ 2CTC /7,5 ml blod). Ingen patienter på stadium I NSCLC havde CTC ≥ 1 CTC /7,5 ml blod, mens 15,8% (6/38) af stadie II-III A patienter og 29,1% (34/117) af trin III B-IV patient viste sig at have CTC ≥ 1 CTC /7,5 ml blod. Klinisk TNM mellemstationer var positivt associeret med CTCs, da det blev opdelt i fase I, fase II, fase III og fase IV (p 0,05 for CTC tærsklerne ≥ 1 og 2 CTC /7,5 ml blod). Selv når kliniske TNM mellemstationer blev opdelt i fase I-IIIA og IIIB-IV, forblev det forbundet med CTCs (p 0,05 for CTC tærskler ≥1, 2 og 5 CTC /7,5 ml blod).

for yderligere at forstå, hvis tumor størrelse, invasiv eller lymfe og fjernmetastaser have en indvirkning på CTC tæller, forholdet mellem CTCs og TNM stadie blev også vurderet. Vi fandt, at 28,1% (9/32) af T1, 12,1% (8/66) af T2, 29,4% (5/17) af T3 og 34,9% (15/43) af T4 patienter havde CTCs ≥ 1 CTC /7,5 ml blod, som udgør en signifikant sammenhæng mellem tumorstørrelse og tilstedeværelsen af ​​mindst 1 CTC /7,5 ml blod. Der var imidlertid ingen korrelation mellem andre tærskler CTC tæller og tumorstørrelsen. Ligeledes var der ingen sammenhæng mellem en tærskel CTC optælling og lymfeknuder metastaser. fjernmetastaser var dog korreleret med CTC, tæller på tærskler for ≥ 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml (p 0,05).

Multivariate analyse viser, at CTCs korrelerer med fremskreden sygdom

for at forbedre forudsigelse værdi CTCs i NSCLC, vi udførte multivariat analyse omfatter alder, køn, rygevaner, histologi, klinisk-iscenesættelse og placeringen af ​​den primære tumor. Vi fandt, at patienter med stadium IIIB-IV sygdom havde en høj hyppighed af CTCs sammenlignet med dem med stadium I-IIIA. (P 0,05; tabel 3).

Foreningen af ​​CTC tæller med Ki-67 og tumor klasse i NSCLC patienter

Patologisk analyse viste, at dårligt differentierede tumorer blev korreleret med højere CTC tæller (CTCs ≥ 2 /7.5 ml blod, p 0,05, tabel 4), sammenlignet med de moderat differentierede tumorer. Patienter med Ki-67-positive tumorer syntes at have højere CTC tæller, men det nåede ikke statistisk signifikans.

CTCs tæller korrelerer med CEA

tumormarkører CEA, Cyfra21- 1, CA19-9, CA-125, og SCC-Ag blev også analyseret i NSCLC patienter. Hver serum markør blev sammenlignet selvstændigt med CTC tæller at identificere potentielle relationer. Den eneste markør fundet at være associeret med CTCs blev serum CEA. Forhøjet serum CEA var positivt associeret med CTC tæller på tærskler ≥ 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml blod, sammenlignet med normale CEA niveauer (tabel 5).

Yderligere statistiske analyse blev udført for at undersøge om der var en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​CTCs, TNM mellemstationer, og serumkoncentration af CEA. Efter justering for TNM mellemstationer (I-IIIA og IIIB- IV), blev serum CEA stadig positivt associeret med tilstedeværelsen af ​​CTC (OR 95% CI = 4,263 [1,194 til 15,226], p = 0,026.

Serum CEA øger forudsigelse magt CTCs i tumor aggressivitet

Påvisning af CTCs i vores NSCLC patienter var forholdsvis lav, med kun 23,7% af patienterne, der viser . en CTC pr 7,5 ml blod Vi foreslås således at undersøge, om tilføjelse af en billig klinisk variabel vil øge sin magt for sygdom forudsigelse. til dette brugte vi logistisk regressionsanalyse til at analysere muligheden for CTCs i kombination med serum CEA forudsige NSCLC aggressivitet, herunder TNM mellemstationer (i-IIIA og IIIB- IV), Ki-67-niveau, og tumorklassificering. som det ses i tabel 6, fandt vi, at forudsigelsen evne sent stadieinddeling og Ki-67 blev forøget i gruppen med den kombinerede CTC og CEA model i sammenligning med CTC-modellen.

diskussion

Cirkulerende tumorceller (CTCs) er blevet undersøgt som potentielle biomarkører til at forbedre NSCLC diagnose, prognose, behandling og overvågning. Men til vores viden, vores undersøgelse er den første til at bruge CellSearch system til at evaluere CTCs i en stor kohorte af kinesisk NSCLC patienter.

I univariat analyse, fandt vi, at CTC tæller i NSCLC patienter var forbundet med sent tidspunkt, adenokarcinomer, dårligt differentieret tumor klasse, og forhøjede CEA niveauer. Brug logistisk regressionsanalyse, fandt vi, at den kombinerede CTCs og CEA model havde en bedre forudsigelse for aggressivitet NSCLC (sen iscenesættelse og Ki-67). Vore data antyder, at kliniske variable, især serum CEA, kan forbedre forudsigelsen magt CTCs i NSCLC-patienter

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at 30% af patienterne har . 1 CTC pr 7,5 ml blod, som målt ved CellSearch, og at 15% har fem eller flere CTCs [15,21-22]. I vores undersøgelse, 23,7, 11,8 og 7,7% af patienter viste mindst 1, 2 og 5 CTCs /7,5 ml blod, hhv. Mens disse niveauer er noget lavere end i tidligere rapporterede studier kan forskellige patientpopulationer højde for disse forskelle. Især har tidligere undersøgelser omfattede heterogene populationer af metastatisk og betjenes NSCLC.

Fælles prognostiske faktorer i NSCLC omfatter Ki-67 positivitet og tumor klasse. [25-28]. Tumor kvalitet er korreleret med niveauerne af apoptose og celleproliferation i lunge adenokarcinomer, med hurtigere omsætning af tumorceller i dårligt differentierede tumorer [29]. I overensstemmelse med dette koncept, fandt vi, at høje CTC tællinger blev forbundet med dårligt differentieret tumorer. Især blev en dårligt differentieret tumor klasse signifikant associeret med CTC tællinger af ≥ 1 eller 2 CTC /7,5 ml blod. Desuden blev høj Ki-67 farvning i den primære tumor også forbundet med høj CTC tæller på alle tærskler, selv om disse data ikke var statistisk signifikante på grund af den lille kohorte størrelse. Forholdet mellem spredning og CTCs i NSCLC vil kræve yderligere undersøgelse ved hjælp af en større kohorte.

Tidligere undersøgelser har vurderet forholdet mellem CTCs og tumormarkører i solide tumorer [30-32]. Dog er data fra patienter med lungecancer stadig mangler, især i kinesiske befolkning. Vi undersøgte forholdet mellem CTCs og almindeligt anvendte NSCLC tumormarkører, herunder CEA, CA19-9, CA-125, SCC, og CYFRA21-1. Interessant, vores data viser, at serum-CEA niveauer er korreleret med CTC tæller i NSCLC patienter. CEA, et glycoprotein, der normalt fremstilles under fosterudviklingen, er til stede i meget lavt niveau i serum hos raske voksne. Forhøjede serumniveauer af CEA er forbundet med udvikling, forløb, fase og prognose af NSCLC [4-5, 12]. Dataene i vores undersøgelse tyder på, at kombinationen af ​​CTC tæller og serum CEA var forbundet med en mere aggressiv NSCLC. Det er dog ikke klart, hvorfor andre serum biomarkører ikke har lignende foreninger med CTCs i NSCLC patienter. Yderligere undersøgelser med store stikprøvestørrelser er nødvendige for at afgøre, om det var nyttigt at inkludere disse markører i forudsigelsen model.

På trods af fremskridt i de seneste år, CellSearch teknologi stadig har mange begrænsninger. Påvisning af CTCs ved CellSearch system er baseret på celleoverflademarkører såsom EpCAM. Det kan således potentielt brænde CTCs som ikke udtrykker målantigenet [33-34]. Ligeledes aggressive tumorceller miste epitel markører på grund af epitel-mesenkymale overgang (EMT) og vil ikke blive opdaget af CellSearch. Det skal bemærkes, at feltet bevæger sig væk fra CTC tæller til molekylær og funktionel karakterisering af CTCs og anvendelse af CTCs som flydende biopsier at teste, om visse patienter er mere tilbøjelige til at drage fordel center biologiske terapier [35-36]. For eksempel fænotypisk karakterisering af CTCs ved at medtage en “tumorspecifik” markørgen, ligesom CEA ved RT-PCR, har en fordel ved at øge følsomheden.

CellSearch assay er meget dyrt i Kina. Fundet af vores undersøgelse kan foreslå en omkostningseffektiv metode til NSCLC patienter til at bestemme, hvem der skal køre i denne dyre assay. Tumor markører er altid bruges som biomarkører for tidligere diagnose, behandling effekt og prognose i NSCLC [4-5, 12, 37-38]. Som serum CEA er forbundet med CTCs, kan det være muligt at anbefale CellSearch assay for de NSCLC patienter, der er CEA-positive. Alternativt kan vi undersøge, om de NSCLC patienter med både positive CTC og forhøjet CEA er forskellige fra andre undertyper i terapeutisk respons.

Det skal understreges, at denne undersøgelse omfattede kun 169 NSCLC patienter i korrelationsanalysen. Hertil kommer, på grund af grænsen for serumprøver, vi kunne ikke udfylde alle biomarkør assays til hver patient, hvilket fører til lav statistisk styrke for nogle variable i stratificerede undergrupper. Vi håber, at løbende indsamling af tumor biopsier fra dette igangværende projekt vil styrke vores fund.

I sammendrag, en enkel og pålidelig metode til at identificere NSCLC patienter med CTCs ville have stor prognostisk værdi. Vi fandt, at tilstedeværelsen af ​​CTCs er forbundet med sent tidspunkt og dårligt differentierede tumorer, adenocarcinomer, og forhøjede CEA-niveauer. Kombinationen af ​​CTC tæller med serum CEA-værdier var forbundet med mere tumor aggressivitet i NSCLC patienter. Langsigtet opfølgning vil være nødvendigt at foretage en yderligere betydning af CTCs i NSCLC.