PLoS ONE: Integrativ Analyse af HNPCC: det bidrag allelspecifik Expression og andre Analyser til Diagnostic Algorithms

Abstrakt

identifikation af germlinie varianter disponerende til HNPCC (HNPCC) er afgørende for kliniske behandling af luftfartsselskaber, men flere probander forblive negativ for sådanne varianter eller bære varianter af usikker betydning (VUS). Her beskriver vi resultaterne af integrative molekylære analyser i 132 HNPCC patienter giver beviser for forbedret genetisk test af HNPCC med traditionelle eller næste generation metoder. Patienterne blev screenet for: kimlinie allel-specifik ekspression (ASE), nukleotid-varianter, omrokeringer og promotor methylering af mismatch reparation (MMR) gener; kønscellelinie

EPCAM

omlejringer; tumor mikrosatellit instabilitet (MSI) og immunhistokemiske (IHC) MMR proteinekspression. Probander negative for patogene varianter af MMR-gener blev screenet for kimcellelinje

APC

og

MUTYH

sekvens varianter. De fleste germline defekter identificerede var sekvens varianter og rearrangementer af MMR-gener. Bemærkelsesværdigt, blev ændret kimlinie ASE af MMR-gener fundet i 8/22 (36,5%) probander analyseret, herunder 3 sager negative på andre screeninger. Desuden ASE fremlagt beviser for den patogene rolle og guidede karakterisering af et VUS deles af 2 ekstra probander. Ingen kimlinje MMR-gen-promotor-methylering blev observeret og kun én

påvistes EPCAM

omlejring. I flere tilfælde tumor IHC og MSI afveg fra kimcellelinje screening resultater. Især

APC

eller biallele

MUTYH

kimlinie fejl blev identificeret i 2/19 probander negative for patogene varianter af MMR-gener. Vores resultater viser, at ASE supplerer gDNA-baserede analyser i identifikationen af ​​MFR defekter og karakteriseringen af ​​VUS påvirker genekspression, øge antallet af kimcellelinje ændringer påvises. En mærkbar brøkdel af probander negative for MMR-gen-varianter havne

APC

eller

MUTYH

varianter. Disse resultater indikerer, at kimcellelinje ASE analyse og screening for

APC

og

MUTYH

defekter bør indgå i HNPCC diagnostiske algoritmer

Henvisning:. De Lellis L, Aceto GM, Curia MC, Catalano T, Mammarella S, Veschi S, et al. (2013) Integrativ Analyse af HNPCC: det bidrag allelspecifik Expression og andre Analyser til Diagnostic algoritmer. PLoS ONE 8 (11): e81194. doi: 10,1371 /journal.pone.0081194

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: 27. juni, 2013; Accepteret: 9 oktober 2013; Udgivet: 20. november 2013 |

Copyright: © 2013 De Lellis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af midler fra det italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

HNPCC (HNPCC), også kendt som Lynch syndrom, er den hyppigste form for autosomal dominant prædisposition for kolorektal cancer (CRC) [1]. Genetisk diagnose af kimlinie defekte luftfartsselskaber i berørte familier er afgørende for en effektiv klinisk overvågning og tillader målrettet chemoprevention, der for nylig blev vist til væsentligt at reducere forekomsten af ​​kræft hos disse patienter [2]. Men identifikation af patogene germlinie defekter i dette syndrom er ikke trivielt, som afspejles i den brede udsving i antallet af genetiske ændringer er identificeret i forskellige undersøgelser og af den relevante antal varianter med usikker betydning (VUS) opdaget [3-6] . Den variable hastighed på ændringer detekterede afspejler til dels forskelle i følsomhed af de molekylære metoder, der anvendes, delvis det forhold, at klinisk diagnose ikke fuldstændigt forklare den underliggende genetiske heterogenitet, selv når udvælgelsen af ​​probander er baseret på strenge Amsterdam kriterier I (AC -i) eller Amsterdam kriterier II (AC-II) [7]. Størstedelen af ​​HNPCC patienter er forbundet med kimcellelinje mismatch reparation (MMR) defekter og udvikle tumorer med høje niveauer af mikrosatellit instabilitet (MSI-H), kendetegnende for MMR-mangel. Kimcellelinje

MLH1

eller

MSH2

varianter er identificeret i de fleste af disse patienter, mens der opdages varianter i andre MMR gener i en mindre brøkdel af tilfældene [1-6]. Især også kimlinie deletioner påvirker 3′-enden af ​​den epitel celleadhæsionsmolekyle gen (

EPCAM

) kan forårsage HNPCC gennem hypermethylering og lyddæmpning af downstream

MSH2

promotor i EpCAM-udtrykkende væv [ ,,,0],8].

EpCAM

sletninger blev rapporteret på et relativt høj frekvens (16-21%) i forskellige undersøgelser i tilfælde negative for germlinie MMR defekter [9,10]. Den højeste frekvens (op til 33%) af

EPCAM

rearrangementer blev observeret i delmængde af MSI-H patienter negative for germlinie MMR ændringer og mangler MSH2 tumor udtryk [11,12], men den samlede hyppighed af disse rearrangementer i serie af HNPCC probander, umarkerede for mutationsstatus eller MSH2 tumor immunfarvning, er ikke blevet evalueret.

Ud over MFR-gener og

EPCAM

, andre gener spiller en rolle i denne genetisk heterogene syndrom. En forholdsvis stor andel af familier, der opfylder AC har “familiær kolorektal cancer type X” (FCCTX), en kolorektal cancer sammenlægning uden tegn på kimlinie eller tumor-associerede MFR defekter [4]. For de fleste af disse familier, er den genetiske ændring er ansvarlig for tyktarmskræft disposition ikke kendt, selv om defekter i ikke-MMR gener, såsom

MUTYH

,

OGG1

eller

BMPR1A

, er lejlighedsvis påvist [13-15]. I denne henseende, også

APC

varianter forbundet til meget svækkede fænotyper kan overlappe med HNPCC [16], hvilket yderligere udvide rækken af ​​CRC disponerende gener skal screenes.

På baggrund af ovenstående overvejelser, traditionelle gentest i HNPCC fokuseret på en analyse af MMR-gener og flere diagnostiske algoritmer blev foreslået at optimere denne screening [17-21]. Dog kan disse algoritmer begrænse følsomheden af ​​gentest, undervurderer bærere af sygdomsfremkaldende varianter i MMR-gener. For nylig blev en særdeles processiv gDNA assay (ColoSeq, University of Washington, Seattle, WA) baseret på målrettet opsamling og næste-generations sekventering (NGS) designet til samtidigt at analysere MMR-relaterede og -unrelated gener i HNPCC [22]. NGS-baserede test kan overvinde nogle af begrænsningerne ved lav-throughput metoder, men selv denne fremgangsmåde har nogle ulemper. Eksempelvis indebærer NGS ikke give indsigt i den patogene rolle VUS der er mere tilbøjelige til at blive detekteret af disse meget processive metoder. Desuden er genomiske tilgange ikke designet til at definere den patogene potentiale

cis

– og trans-virkende varianter, der påvirker genekspression. Disse begrænsninger kan være delvis overvundet ved cDNA-baserede assays, såsom analyse af allelspecifik ekspression (ASE), der har potentiale til at afdække germlinie defekter disponerer til tarmkræft, selv når en patogen variant ikke er konstateret eller rolle de detekterede varianter er uklar [23-27].

i den foreliggende undersøgelse, vi illustrerer resultaterne af integrative analyser udført på en serie af 132 italienske HNPCC patienter under anvendelse af tidligere udviklede og hidtil ukendte assays til screening af kimcellelinje og tumor defekter. Vi viser, at germlinie ASE analyse supplerer gDNA-baserede analyser i identifikation og karakterisering af defekter disponerer for CRC. Vores integrativ tilgang viser også, at inddragelsen af ​​

MUTYH

og

APC

i screeningen øger antallet af patogene varianter detekteret. I betragtning af antallet af patienter analyseret, panelet af gener screenet og række metoder der anvendes, denne undersøgelse giver indikationer for klinisk oversættelse af HNPCC gentest, der kan anvendes på traditionel eller NGS tilgange. Især vores resultater støtter opførelse af ASE analyse og screening af polypper gener hos algoritmer til genetisk diagnose af HNPCC.

Materialer og metoder

Patienter og integrativ screening strategi

Vi studerede 132 ubeslægtede AC-i eller AC-II patienter, der tidligere rekrutteret på forskellige italienske institutioner. DNA og RNA blev ekstraheret som tidligere beskrevet [25]. Alle undersøgelsens deltagere gav skriftligt informeret samtykke efter verbal rådgivning og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité ved University of Chieti. Tumor MSI og IHC analyser blev udført i probander med tumordata prøver. Alle patienter, uanset resultaterne af tumor MSI og IHC-analyser, undergik screening for kimlinie nucleotidsubstitutioner i MMR-gener som beskrevet nedenfor. Probander negative for patogene nukleotidsubstitutioner blev yderligere testet for udvidede germline omrokeringer i

MSH2

,

MLH1

EPCAM

, efterfulgt af screening for kimcellelinje

MSH2

og

MLH1

promotor methylering. ASE analyser af MMR-gener blev udført hos patienter med tilgængelige RNA og heterozygot for mindst én allelisk markering, uafhængigt af resultaterne af de ovennævnte screeninger. Patienter negative på de ovennævnte analyser blev testet for

APC

og

MUTYH

sekvens varianter som beskrevet nedenfor. Variationen data identificeret i denne undersøgelse er blevet forelagt for International Society for Mave Arvelige Tumorer (Insight, https://www.insight-group.org/variants/database/) database.

Screening for kimcellelinje nukleotid substitutioner i MMR-gener

Patienter blev oprindeligt screenet for sekvens varianter i

MSH2

MLH1

anvendes enkelt konformationspolymorfisme (SSCP) analyse eller denaturering gradient gelelektroforese (DGGE) . Alle tilfælde negative ved SSCP eller DGGE blev yderligere screenet for varianter i

MSH2

,

MLH1

MSH6

ved denaturering højtryksvæskekromatografi (dHPLC) og automatiseret sekventering, som opdaget et par yderligere mutationer undslap ved den indledende screening (data ikke vist). For at forudsige potentielle skadelige virkninger af nye VUS brugte vi følgende

i silico

værktøjer: PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), støvtætte (http: //finkæmme. jcvi.org/), HSF (https://www.umd.be/HSF/), bananflue (https://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), Mutation Taster (http: //www. mutationtaster.org/), Alamut (https://www.interactive-biosoftware.com). Vi brugte også MAPP-MMR (https://mappmmr.blueankh.com/) og PON-MMR (https://bioinf.uta.fi/PON-MMR/) forudsigelse algoritmer, der var specifikt valideret til missense varianter i MMR-gener .

Analyse af udvidede germline omrokeringer i

MSH2, MLH1

EPCAM

Genomisk

MSH2

MLH1

omlejringer blev screenet ved multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) i 78 patienter negative ved indledende analyse for patogene sekvens varianter eller med VUS. Bekræftelse af omlejringer blev opnået ved ikke-fluorescerende multiplex-PCR koblet til HPLC (NFMP-HPLC) eller ved lab-on-a-chip teknologi til analyse af kopital variationer (LOC-CNV), som tidligere beskrevet [28,29] . Da den oprindelige udgave af

MSH2 /MLH1

MLPA kit (SALSA P003, MRC-Holland, Amsterdam, Holland) anvendte ikke omfatter sonder svarende til

EPCAM

, vi udviklet 3 nye NFMP -HPLC assays for screening og bekræftelse af genomiske omlejringer påvirker 3′-enden af ​​

EPCAM

og intergeniske

MSH2

–

EPCAM

region (tabel S1). Disse analyser blev udført i en delmængde af 33 tilfælde med VUS eller negativt på tidligere screeninger og for hvem DNA ikke var opbrugt i tidligere analyser. Breakpoint analyse blev udført som beskrevet tidligere [28,29].

Kimcellelinje

MSH2

MLH1

promotor methylering

Bisulfit DNA konvertering blev udført i i 44 sager negative ved indledende screening for patogene sekvensvarianter og genomiske omlejringer ved hjælp af prægning DNA modifikation kit (Sigma, St. Louis, MO), i henhold til fabrikantens instruktioner. Screening for kimcellelinje

MLH1

promotor methylering blev udført ved methylering-specifik PCR (MSP) under anvendelse af en degenereret og en methylering primer designet af Suter et al [30]. Endvidere har vi designet en kontrol-PCR, hvor den degenererede primer, som anvendes til MSP blev parret med en primer specifik for methyleret DNA (Tabel S2). DNA fra SW48-cellelinien blev anvendt som positiv

MLH1

promotor methylering kontrol. Screening for kimcellelinje

MSH2

promotor methylering blev udført ved MSP anvendelse af primere specifikke for methylerede og ikke-methylerede alleler, som beskrevet af Chan et al [31]. Positive kontroller for

MSH2

promotor methylering blev opnået ved hjælp af kontrol DNA, der var blevet universelt methylerede hjælp S-adenosylmethionin (SAM) og M.SssI CpG methyltrasferase (New England BioLabs, Ipswich, MA).

ASE analyse

ASE analyser af

MSH2

,

MLH1

eller

MSH6

blev udført ved primerforlængelse i patienter med tilgængelige RNA og heterozygote i mindst én allelisk markering, uafhængigt af deres mutationsstatus. ASE-analyser blev udført som tidligere beskrevet under anvendelse af enten

32P-mærkede eller umærkede primere koblet til analyse ved Molecular Imager (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) eller ved DHPLC (Transgenomic, Omaha, NE), henholdsvis [23,25 ]. Tre ASE analyser udførtes både med

32P-mærkede primere og med DHPLC-baserede metode, der gav sammenlignelige resultater (Tabel S3). For hver ASE assay blev den gennemsnitlige forholdet opnået med gDNA skabeloner anvendes til at normalisere data genereret primerforlængelsesprodukter eksperimenter udført under anvendelse af cDNA-skabeloner. Disse normaliserede cDNA /gDNA forhold blev betegnet som ASE værdier. Baseret på tidligere studier, kun markerede ubalance i relativ allel udtryk svarende til det dobbelte ubalancer i allele nøgletal ( 1: 2 eller 2: 1-forhold, svarende til ASE værdier 0,5 eller 2, henholdsvis), blev konservativt betragtet bevis for en patogen ændring [23,25,26]. Disse ASE værdier afvige mere end 3 SD’er fra middelværdier observeret i heterozygote kontrol for to CRC prædisponerende gener, som vi tidligere har analyseret baseret på tilgængeligheden af ​​ASE markører hyppige i den italienske befolkning (ASE af

MLH1

i kontrol, betyde 1,04, SD 0,11, hjælp rs1799977, ASE af

APC

i kontrollen, betyder 1,25, SD 0,21, hjælp rs2229992) [24,25].

Samlet set ASE i

MLH1

,

MSH2

MSH6

blev målt ved hjælp af 8 tidligere beskrevne [23,25] og 3 nye analyser. Primere for nye analyser er beskrevet i tabel S4.

Tumor MSI og IHC analyser

Tumor blev udført på de samarbejdende institutioner, der rekrutteres patienterne. MSI blev analyseret i de fleste probander (93/102) med tumordata prøver, i henhold til internationale retningslinjer [32]. Immunhistokemisk udtryk for MSH2, MLH1 og MSH6 proteiner blev analyseret for 73/102 tilfælde med tumordata prøver som tidligere beskrevet [13].

Screening for

APC

og

MUTYH

nukleotidsubstitutioner

Den kodende sekvens og intronbaserede exon grænser

APC

og

MUTYH

blev analyseret ved direkte sekventering i 19 probander negative på MMR-gen screening. Disse patienter blev udvalgt baseret på tilgængelighed af DNA og af tilstedeværelsen af ​​mindst én polyp på diagnose i probander og /eller i deres pårørende.

Resultater

Flere metoder blev brugt til at analysere 132 ubeslægtede HNPCC patienter for patogene defekter i MFR og ikke-MMR-gener.

MSH2, MLH1 og MSH6 nukleotid varianter

Vi har registreret 41 tidligere beskrevet, og 15 nye MMR genvarianter (tabel 1 og tabel S5). Disse omfattede 27 tab-af-funktion nukleotidændringer (nonsense og rammeskift) indføring præmature termineringskodoner (PTC), 14 varianter placeret ved splejsningssteder, 3 i-ramme-deletioner og 12 missense-substitutioner. Otte af splejsningsstedet varianter blev verificeret eksperimentelt at associere med ændret splejsning, herunder 7 analyseret i tidligere undersøgelser [33-38] og 1 i den foreliggende undersøgelse (se nedenfor), mens 5 blev anset patogene er placeret ved de næsten invariante dinukleotider på intron ender (tabel 1 og tabel S5). To i-frame sletninger og 9 missense varianter blev rapporteret som patogene eller potentielt patogene baseret på

i silico

analyser, funktionelle assays, kvalitativ klassificeringen eller multifaktorielle forudsigelse model i tidligere rapporter [39-44], som angivet i tabel S5.

Patienter

AC

MSI

MMR defekt IHC

kønscellelinie defekter

et Vejviser

Salg nukleotid varianter og rearrangementer

ændret ASE

b

LCH-1IMSI-hMLH1

MLH1

c.301GA (p.Gly101Ser) GDLM- 2 # III-1IMSI-HMSH2

MSH2

c.942 + 3ATGDLM-7 # III-3IMSI-hMLH1 /MSH2

MSH2

Del exon 7LCH-8IMSI-HMSH2GDLV-11 # II-9IMSI- HMLH196 # 1636IIMSI-HMLH1GDLM-9 # II-2IMSI-HMSH2

MSH2

c.1549_1550delGCinsT (p.Ala517Tyrfs * 9)

MSH2

GDLG-18 # III-19IMSI-Hn.i.

MSH2

Del exon 3LCH-19IMSI-HMSH2

MSH2

c.2245GT (p.Glu749*)GDLG-20#II-1IMSI-HMLH1

MLH1

LCH-27IMSI-HMSH2

MLH1

GDLG-49#IV-2IMSI-HMSH2

MSH2

c.1024GA (p.Val342Ile) GDLV-52 # II-2IMSI-hMLH1

MLH1

LCH-57IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) LCH-58IMSI-HMSH2

MSH2

c.2005 + 3_2005 + 14del12LCH-59IMSI-HMSH2

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31) LCH-88IMSI-Hn.a.

MLH1

c .1731GA (p.Ser577Ser) LCH-93IIMSI-Hn.a.

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 19 # 719IIMSI-HMSH2

MSH2

c.1444dupA (p.Arg482Lysfs * 6) 297 # 875IMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 307 # 2619IMSI-hMLH1

MLH1

c.199GA (p.Gly67Arg) 309 # 3478IMSI-HMSH2

MSH2

Del exon 9-10.311 # 2042IMSI-Hn.i.

MLH1

c.731GA (p.Gly244Asp) 338 # 1489IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.382GC (p .Ala128Pro) 349 # 1581IMSI-HMSH2

MSH2

c.942 + 3AT363 # 2541IMSI-HMSH2

MSH2

Del exoner 9-10412 # 3342IIMSI-HMSH2

EPCAM

Del exon 3

– MSH2

exon 7 459 # 2809IMSI-HMSH2

MSH2

Del 5’upstream region – exon 8476 # R26IMSI-HMSH2

MSH2

Del exoner 1-6667 # 2412IMSI-HMSH2

MSH2

c.942 + 3AT668 # 2371IMSI-hMLH1

MLH1

c.545 + 3AG670 # 2413IMSI-hMLH1

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 727 # AAIMSI -HMSH2

MSH2

c.942 + 2TA814 # DGRIMSI-Hn.a

MSH2

c.. [376GγA (;) 2251G C] (p [Gly126Ser (;) Gly751Arg].) 986 # 3487IMSI-hMLH1

MLH1

c.1731 + 4AG 1068 # 3015IMSI-hMLH1

MLH1

c.1050delA (p.Gly351Aspfs * 16) 1070 # 2957IMSI-HMSH2

MSH2

c.2287G . C (p.Ala763Pro) 1080 # 2974IIMSI-Hn.a

MSH2

c.2089CT (p.Cys697Arg) 1251 # 3260IIMSI-HMSH2

MSH2

c.374C T (p.Gln125 *) 1256 # 3479IIMSI-HMSH2

MSH2

c.1786_1788delAAT (p.Asn596del) 1293 # 3286IMSI-hMLH1

MLH1

Del exon 61301 # 3323IIMSI-HMSH2

MSH2

c.2519_2530del12 (p.Val840_Cys843del) 1459 # 3324IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) LES1 # LPIIMSI-Hn.a.

MLH1

c.731GA ( p.Gly244Asp) 298 # 668 /1584IMSI-HMSH2

MSH2

c.1077-2A C319 # 1004IMSI-HMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 350 # 1933IMSI-hMLH1

MLH1

c.676CT (p.Arg226 *) 360 # 2916IMSI-hMLH1 /MSH6

MLH1

c.1731 + 4AG

MLH1

903 # 2630IIMSI-HMSH2

MSH2

Del exon 31.218 # 3238IMSI-hMLH1

MLH1

DUP exons 2-31.515 # 3442IIMSI-HMSH2

MSH2

c.1255CT (p.Gln419 *) 334 # 1170IMSI-HMSH2

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

711 # 2495IIMSI-hMLH1

MLH1

c.1459CT (p.Arg487 *) 1205 # BAIIMSI-hMLH1

MSH2

c.1215CA (p.Tyr405 *) 1206 # GEIMSI-HMSH2

MSH2

c.1046CG (p.Pro349Arg) 357 # 2038IMSI-Hn.a.

MSH2

c. 2294delC (p.Ala765Valfs * 47) 600 # 2237IMSI-Hn.a.

MSH2

Del exoner 4-61138 # 3149IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 737 # 2838IMSI-Hn.a.

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) TO9726IMSI-Hn.a.

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE9804IMSI-Hn.a .

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2) GE9726IMSI-Hn.a.

MSH2

c.2536CT (p.Gln846 *) SI9744IMSI-Hn.a.

MSH2

c.942 + 3ATGE9914IMSI-Hn.a

MLH1

c.677 + 1GAF102IMSI-Hn.a

MLH1

c.546-2A … GSI9606IMSI-Hn.a

MLH1

c.911AT (p.Asp304Val)LCH-4IMSI-Hn.i.LCH-12IMSI-Hn.i.LCH-85IMSI-Hn.a.LCH-47IMSI-Hn.a.871#R08IMSI-Hn.a.GE0101IMSI-Hn.a.GE9801IMSI-Hn.a.GE9903IIMSI-Hn.a.LCH-6IMSSn.a.LCH-13IMSSn.i.LCH-79IMSSn.a.296#776IMSSn.i.303#2547IMSSn.i.308#1260IMSSn.i.

MUTYH

C. [1145G A] [1395_1397delGGA] (p.[(Gly382Asp)];[(Glu466del)]313#1381IMSSn.a.342#2803IMSSn.i.365#2192IIMSSn.a.368#2506IMSSn.i.369#2169IMSSn.a.370#3105IMSSn.i.

APC

c.1100_1101delCT (p.Ser367Cysfs*10)633#3114IMSSn.i.728#2509IMSSn.i.818#2543IMSSn.i.933#R14IMSSn.a.1165#3159IMSSn.i.1193#3187IMSSn.i.SV0001IMSI-Ln.a.TO9913In.a.MLH1705#3035In.a.MLH1

MLH1

c.1367C A (p.Ser456 *) 1008 # 2829In.a.MSH2

MSH2

c.1757C G (p.Ser586 *) 1077 # 2979In.a.MLH1

MLH1

c.453 + 1GA1420 # 3343IIn.a.MSH2

MSH2

c.868GT (p.Glu290 *) LCH-15In.ani

MLH1

c.1918CT (p.Pro640Ser) LCH-23IIn .ana

MSH2

Del exon 1GDLG-29 # III-8IIn.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) GDLG-31 # III-11In.ana

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

LCH-86In.ana

MSH2

c.212-1G A83 # 3103In.ana

MLH1

Del exon1

MLH1

601 # 2307In.ana

MSH6

c.3013CT (p.Arg1005 *) 1157 # 834In.ana

MSH2

c.119delG (p.Gly40Alafs * 24) 324 # R10In.ana

MLH1

c.1896GA (p.Glu632Glu) 337 # 2224In.ana

MLH1

c.1989GT (p.Glu663Asp) 359 # 2578In.ana

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44) 463 # 3031In.ana

MLH1

c.1852_1854delAAG (p.Lys618del) 602 # 2416In.ana

MLH1

c.1011delC (s. Asp338Ilefs * 29) 985 # 2683In.ana

MLH1

Del exon 61074 # 3001In.ana

MSH2

c.1059delG (p.Asn354Thrfs * 3) 1200 # 3221In.ana

MSH6

c.738_741delAAAA (p.Lys246Asnfs * 32) GE0201In.ana

MSH2

Del exon16GE9911In.ana

MLH1

c.1011delC (p.Asp338Ilefs * 29) TO0012In.ana

MLH1

c.1888_1892delATTGA (p.Ile630 *) TO0225In.ana

MLH1

c.2040CA (p.Cys680 *) GE0410In.ana

MSH2

c.942 + 3ATGE0330In.ana

MSH2

c.1216CT (p.Arg406 *) 162 # 2696In.ana

MLH1

c.1559-2A GLCH-10In.a.n.i.LCH-16In.a.n.a.LCH-51In.a.n.a.LCH-53In.a.n.a.54#982In.a.n.i.314#1200In.a.n.i.353#1114In.a.n.a.455#2186In.a.n.a.1082#2982In.a.n.a.F435In.a.n.a.GE0002In.a.n.a.Table . 1. Oversigt over MSI, IHC og mutationsstatus i 132 HNPCC ubeslægtede patienter møde AC

na, data ikke er tilgængelige; ni, IHC ikke informative.aNovel varianter er med fed skrift. Germlinie MMR-gen defekter for nogle patienter er tidligere blevet rapporteret (se tabel 2 og tabel S3, S5, S6 og S7). Vi har detekteret også flere varianter tidligere rapporteret som ikke-patogene (se tabel S5) .bASE værdi 0,5 eller 2. CSV Hent CSV

Vi udførte

i silico

analyser til at udlede den funktionelle effekt af 4 varianter (3 missense og en intron), for hvilke sådanne oplysninger var tilgængelige fra tidligere rapporter. For tre roman missense varianter en skadelig virkning på protein funktion blev forudsagt af

i silico

værktøjer, herunder PON-MFR og MAPP-MMR (tabel S5).

I silico

værktøjer angivet en potentiel effekt på splejsning for romanen intron variant (

MLH1

c.1731 + 4AG) (se nedenfor) (tabel S5). En yderligere variant, det hidtil ukendte

MSH2

deletion i ramme (c.2519_2530del12, p.Val840_Cys843del), blev anset for potentielt patogene, fordi det fjerner 4 aminosyrerester højt konserverede i andre arter og er beliggende i ATPase-domæne af MSH2 protein, hvor variationer tidligere blev rapporteret at forårsage fejl i uoverensstemmelse binding eller frigive [45,46].

En patient (814 # /DGR) viste sig at bære to missense udskiftninger i

MSH2 Hotel (c.376GA og c.2251GC) forventes at være patogene (se tabel S5). Desværre, ingen slægtninge til denne patient var tilgængelige for gentestning og fasen af ​​de to varianter kunne ikke konstateres.

Samlet set screening for sekvens varianter i HNPCC gener tilladt påvisning af 56 forskellige udskiftninger med en konkret eller potentiel patogen betydning i 72 patienter, herunder 26 i

MLH1

(46,5%), 28 i

MSH2 Hotel (50%) og 2 i

MSH6 Hotel (3,5%) (tabel 1 og tabel S5).

Genomisk omrokeringer af MSH2, MLH1 og EPCAM

Screening af

MLH1

MSH2

af MLPA, efterfulgt af bekræftende tests bruger LOC-CNV og /eller NFMP-HPLC, indikerede tilstedeværelsen af ​​genomiske rearrangementer (herunder 14 sletninger og 1 overlapning) i 15 af de 78 patienter analyseres (19%) (tabel 1 og tabel S6). Genet påvirket af omlægning var

MSH2

i 10 probander (13%) og

MLH1

i 5 probander (6,5%).

EPCAM

omrokeringer blev screenet ved NFMP-HPLC i patienter uden påviselige patogene varianter eller med VUS. Desuden

EpCAM

omlejringer blev evalueret i 3 patienter (476 # R26, 459 # 2809 og 412 # 3342), der er baseret på MLPA og NFMP-HPLC screening havde beviser for

MSH2

sletninger involverer første exon af genet (tabel S6). En af disse patienter (476 # R26) havde en sletning af

MSH2

exon 1-6 og NFMP-HPLC-baserede EpCAM analyser viste, at omlægning ikke strækker sig til

EPCAM-MSH2

intergeniske region (tabel S6). I en anden patient (459 # 2809), der tidligere er rapporteret at have en sletning spænder exons 1-8 af

MSH2

[28], viste EpCAM analyser at sletningen omfattede

MSH2

5 ‘opstrøms region, men skånet 3’-enden af ​​

EPCAM

(fig S1). I den tredje patient (412 # 3342) den sygdomsramte deletion alle

EPCAM

exoner indeholdt i EpCAM assays (exonerne 3, 8 og 9) (fig S1). Denne sletning forlænges til exon 7 i

MSH2

, som angivet af MLPA og NFMP-HPLC (tabel S6). Nej

EpCAM

omlejringer blev påvist i de andre patienter analyseret. Alle

MLH1, MSH2

EPCAM

omlejringer blev bekræftet ved mindst 2 uafhængige analyser baseret på MLPA, NFMP-HPLC eller LOC-CNV. I 9 tilfælde bekræftelse af omlejringer kan også opnås ved stoppunkt analyse eller RT-PCR (tabel S6), som tidligere rapporteret [28,29].

Kimcellelinje promotor methylering

Kimcellelinje MMR-gen promotor methylering blev analyseret i tilfælde negative ved første screening for patogene nukleotid varianter og genomiske omlejringer. CpG promotor methylering blev kun observeret med positive kontrol DNA (SW48 cellelinie til

MLH1

og universelt denatureret kontrol DNA til

MSH2

henholdsvis – data ikke vist).

Kimcellelinje ASE analyse

Blandt de 22 patienter, der kunne analyseres, vi observerede ændret kimlinie ASE af

MLH1

i 6 patienter og

MSH2

i 2 patienter (tabel 2 og tabel S7). Af disse patienter, 2 viste monoallelisk udtryk for

MLH1

(GDLV-52 # II-2 og 83 # 3103) og 6 havde markant skæve udtryk for

MLH1 Hotel (360 # 2916, GDLG- 20 # II-1, GDLG-31 # III-11 og LCH-27, gennemsnitlig ASE værdier 4,7, 2,01, 2,24 og 2,64, henholdsvis) eller

MSH2

(GDLM-9 # II-2 og 334 # 1170, gennemsnitlig ASE værdier 3,58 og 9,20, henholdsvis). De resterende patienter var beskedent uafbalanceret eller afbalanceret ASE (tabel 2 og tabel S7). ASE-værdier observeret i de 22 probander er afbildet i figur 1. For reference, er tallet skildrer også de værdier, som vi tidligere har målt i kontrolpersoner heterozygote for den hyppige c.655AG variant (rs1799977) af

MLH1

[ ,,,0],25].

Patienter

en

Patogene germlinie varianter

ASE analyse

Gene

ASE markør

Konsekvens

normaliseret ASE værdi (SE)

b

GDLM-2 # III-1

MSH2

c.942 + 3AT

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val1.00 (0,07) LCH-8

MSH2

c.984CTp. (=) 1,09 (0,07)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.97 (0,16) GDLG -18 # III-19

MSH2

Del exon 3

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.91 (0,10) LCH-27

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2. 64 (0,38) GDLG-31 # III-11

MLH1

c.954delC (p.His318Glnfs * 49)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val2.24 (0,07) LCH-51

MLH1

c.655AGp.Ile219Val0.84 (0,10) LCH-59

MLH1

c.1679delT (p.Phe560Serfs * 31)

MLH1

c. 655AGp.Ile219Val0.97 (0,11) GE9804

MSH2

c.1705_1706delGA (p.Glu569Ilefs * 2)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.09 (0,05) 96 # 1636

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.17 (0,06) 334 # 1170

MSH2

c.278_279delTT (p.Leu93Profs * 6)

MSH2

c.278_279delTTp.Leu93Profs * 69,20 (3,97) 359 # 2578

MLH1

c.1639_1643dupTTATA (p.Leu549Tyrfs * 44)

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.33 (0,04) 314 # 1200

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.01 (0,03) 1082 # 2982

MLH1

c.655AGp.Ile219Val1.07 (0,02)

MSH6

c.540TCp. (=) 1,10 ( 0,12) 83 # 3103

c

MLH1

Del exon 1

MLH1

c.655AGp.Ile219ValLoss af G alleleTable 2. Resultater af primerforlængelse ASE analyser udført i denne undersøgelse.

Ain tabel S7 vi opsummere resultaterne af ASE analyser for yderligere 8 patienter indgår i nærværende undersøgelse, hvis ASE resultater tidligere var blevet rapporteret [23,25] .bMarkedly ubalance ASE værdier er i fed .cFor denne patient PE analyse udført i den foreliggende undersøgelse bekræftede tab af ekspression for G-allelen tidligere vist ved cDNA-sekventering [28]. CSV Hent CSV

ASE værdier mellem de 2 stiplede linier svarer til mindre end dobbelt ubalancer i allele nøgletal (se metoder).

Tre patienter med ændret kimcellelinje ASE (GDLG-31 # III-11, 83 # 3103 og 334 # 1170) var kendt bærere af

MLH1

eller

MSH2

sletninger. Omvendt i 2 patienter med ubalanceret ASE indledende screening for patogene varianter ved SSCP eller DGGE var negativ, men efterfølgende re-analyse af DHPLC og sekventering identificerede en læserammeforskydning af

MSH2

(sag GDLM-9 # II-2) og en intron

MLH1

variant med en potentiel effekt på splejsning (sag 360 # 2916, se nedenfor) (tabel 1 og tabel S7). Samlet, varianter med en klar eller potentiel patogen rolle blev påvist i 5 af de 8 patienter med ubalanceret ASE (tabel 1 og tabel S7), mens der i 3 patienter (GDLG-20 # II-1, LCH-27 og GDLV-52 # II-2) ændret ASE var den eneste kønscellelinie defekt opdages [23,25].

analyse af en roman formodet splejsning variant

i silico

analyse af forskellige splejsning forudsigelse softwareværktøjer (se metoder) viste, at effekten af ​​romanen

MLH1

c.1731 + 4AG variant deles af 2 probander (360 # 2916 og 986 # 3487) var usikker. de foreslog imidlertid, at denne ændring kan påvirke splejsning ved at reducere styrken af ​​donor site (gennemsnitlig nedgang på 13%, range 7,4-22%). Tilgængeligheden af ​​cDNA i patient 360 # 2916 tilladt os at teste om c.1731 + 4AG variant var forbundet til en splejsningsdefekt. Denne ændring var undvigende ved første afprøvning af RT-PCR amplificeret cDNA fordi kun vildtype-transkripter blev afsløret ved direkte sekventering eller ved elektroforetisk analyse (data ikke vist). baseret på resultaterne af ASE-analyse viser en markant ubalance i allelisk ekspression (gennemsnitlig normaliseret allele forholdet 4,7, afledt fra radioaktive og DHPLC-baserede assays, tabel S3), vi hypotese imidlertid, at en ændret splejsning kan afsløres ved DHPLC. Som forudsagt, jo mere følsom DHPLC analyse tillod påvisning af en stor top med en retentionstid svarende til vildtype-transkriptet og en mindre top svarende til en mindre udtrykt kortere transkript. Sekventering bekræftede, at mindre udtrykte

MLH1

afskrift foretaget en out-of-frame exon 15 skipping (Figur S2).