PLoS ONE: Nanonets Saml Kræft Secretome fra pericellulært Space

Abstrakt

Identifikation nye kræft biomarkører er vigtig for tidlig detektion af kræft, da det kan reducere dødeligheden. Den cancer secretome, indsamling af alle makromolekyler secerneret af en tumorcelle, ændrer sin sammensætning i forhold til normalt væv, og denne ændring spiller en vigtig rolle i observationen af ​​cancer progression. Indsamling og nøjagtig analyse af kræft secretomes kunne føre til opdagelsen af ​​hidtil ukendte biomarkører og dermed forbedre resultaterne af kræftbehandlingen. Vi opdagede uventet, at enzym-instrueret selv-samling (EISA) af et D-peptid hydrogelator resultater i nanonets /hydrogel omkring kræftceller, der overudtrykker ectophosphatases. Her viser vi, at disse nanonets i stand til hurtigt at indsamle proteiner i pericellulære rum (dvs. nær overfladen) af kræftceller. Fordi de sekretoriske stoffer er på deres højeste koncentration nær celleoverfladen, at anvendelsen af ​​pericellulære nanonets indsamle kræft secretome maksimerer udbyttet og kvaliteten af ​​prøver, reducerer præ-analytiske variationer, og giver den dynamiske profilering af secretome prøver. Således er denne nye tilgang har et stort potentiale i at identificere den heterotypisk signalering i tumor mikromiljøer derved forbedre forståelsen af ​​tumor mikromiljøer og fremskynde opdagelsen af ​​potentielle biomarkører i kræft biologi. Data er tilgængelige via ProteomeXchange med identifier PXD003924

Henvisning:. Zhou R, Kuang Y, Zhou J, Du X, Li J, Shi J, et al. (2016) Nanonets Saml Cancer Secretome fra pericellulært Space. PLoS ONE 11 (4): e0154126. doi: 10,1371 /journal.pone.0154126

Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA

Modtaget: August 31, 2015; Accepteret: April 9, 2016; Udgivet: 21 April, 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde er delvist støttet af National Institutes of Health (R01CA142746), Kenneth Rainin Foundation, og en National Science Foundation tilskud (DMR-1.420.382). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

som kræft er en af ​​de mest kostbare og dødelige sygdomme for folkesundheden (f.eks NIH anslår, at de samlede omkostninger for kræft i 2008 var $ 201,5 milliarder [1]), tidlig påvisning af kræft, som regel resulterer i mindre omfattende behandling og bedre overordnede resultater, er en optimal løsning til væsentligt minimere omkostningerne og redde liv. Faktisk har betydelig indsats fokuseret på opdagelsen af ​​kræft biomarkører. Mens secretome defineres som indsamling af alle makromolekyler secerneret af en celle, kræft secretome afviger i sammensætning fra secretome af normalt væv på grund af specifikke genetiske mutationer i cancerceller. I princippet kræft secretome er en guldgrube af kræft biomarkører. [2] Men den endelige identifikation af kræft biomarkører stadig en stor udfordring, fordi proteinerne i kræft secretome, de vigtigste bestanddele af tumor mikromiljøer, [3,4] er

dynamisk og kompleks

. Desværre, konventionelle metoder (fx betinget medier (CM)) indsamle kræft secretome har deres begrænsninger og kan ikke rumme den dynamik og kompleksitet kræft secretome. Under vores forskning i enzymkatalyseret dannelse af supramolekylære nanofibrils, [5-12] vi uventet opdaget, at nanonets /hydrogel af en lille D-peptid selektivt dannes i pericellulære rum af visse cancerceller på grund af deres overekspression af ectophosphatases [12,13 ]. Fordi D-peptider modstå fordøjelse ved hjælp af proteaser, D-peptid baseret nanonets /hydrogel er stabil og kan fælde secernerede molekyler (Fig 1A-1C). Således pericellulært dannelsen af ​​D-peptidbaserede nanonets /hydrogel tilbyder en ny mulighed i prøvetagning proces ved at udnytte biologiske forskelle mellem kræft og normale celler.

(A) Dephosphoryleringen af ​​forstadiet bliver til hydrogelator nær celleoverfladen (dvs. pericellulært rum) ved ectophosphatases. (B) Den selv-samling af hydrogelators danner netværk af nanofibrils. (C) Illustration af beslaglæggelse af kræft secretome af nanonets /hydrogeler dannet i pericellulære rum af kræftceller. (D) rutediagram for anvendelse af den pericellulære nanonets /hydrogel at indsamle proteiner i cancer secretome.

Vores undersøgelse viser, at inden for 2-4 timer, den pericellulære nanonets /hydrogel ikke blot samler mere af de samlede udskilte proteiner fra HeLa-celler end konditionerede medier gør (fx medier dyrket med kræftceller i 24 timer), men reducerer også præ-analytiske variationer og tillader den tidsmæssige profilering af kræft secretome prøver. Som en kraftfuld teknik til hurtig og selektiv indsamling af kræft secretome, brug af nanonets af D-peptid dermed fungerer som en tiltrængt generel prøveudtagningsmetode i pericellulære rum, hvor sekretoriske stoffer er på deres højeste koncentrationer. Inden for denne tilgang med pericellulære nanonets, vores undersøgelse af de tidsmæssige profiler af kræft secretome giver også indsigtsfulde indblik i den dynamiske karakter af kræft secretome, hvilket kan være et nyttigt redskab, når det anvendes sammen med andre kvantificeringsmetoder (f.eks SILAC), og i sidste ende afslører klinisk værd kræft biomarkører til påvisning og behandling af cancer. Desuden kunne den tilgang, der er etableret i dette arbejde bidrage til at udvikle nye metoder til at indsamle sekretoriske signalstoffer (fx exosomer [14] og miRNA [15])

in vitro

in vivo

, i sidste ende bringe ny forståelse til kræft biologi og klinisk pleje.

Eksperimentelle procedurer

Byggesten af ​​nanonets /hydrogel

Baseret på vores tidligere forskning på dannelsen af ​​de pericellulære nanofibre /hydrogel på kræftceller, [12] brugte vi et par af forstadie /hydrogelator til enzymatisk dannelse af pericellulært nanonets /hydrogel via selvsamling. Forløberen for hydrogelator er en naphthalen (NAP) udjævnede tripeptid bestående af D-aminosyrerester og er phosphoryleret i tyrosinrest Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (PO

3H

2) (1

s). Efter dephosphorylering, forstadiet bliver til Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (1), som selv samler sig i vandig fase til dannelse af en hydrogel. [16] overekspression af ectophosphatases af cancerceller muliggør selv- samling af en omkring cellerne til at danne netværk af nanofibrils (dvs. nanonets). I vores tidligere arbejde [12], vi har vist, at pericellulære nanonets dannes på overfladen af ​​HeLa-celler i 2 timer af inkubation med 1

s (400 ug /ml). Vi fulgte vores tidligere procedure ved at opløse forløber en

s i Hedeselskabet

2O med justering af pH til 7,4 ved tilsætning af 1 N NaOH til at producere stamopløsningen.

Indsamling af nanonets /hydrogeler eller medium i komplet medium

3 × 10

5 i HeLa-celler i 2 ml komplet MEM-medium blev podet i en 35 mm petriskål. Efter 24 timers inkubation blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med 2 ml frisk komplet MEM-medium en gang. Til opsamling af nanonets /hydrogeler, 1 ml komplet MEM-medium indeholdende 1

s ved 400 ug /ml (fortyndet fra en 20 x stamopløsning af 1

s i PBS-buffer, fremstillet umiddelbart før brug) blev tilsat for at erstatte dyrkningsmediet. Efter 2 timers inkubation ved 37 ° C, blev skålen anbragt i et 4c rum i 5 minutter. Skålen blev vippet og ophidset til at indsamle de løsrevne nanonets /hydrogeler i medium. Ved hjælp af en bred munding transfer pipette, vi samlet mediet i et 1,5 ml eppendorfrør og centrifugeret ved 7500 rpm i 1 minut. Suspensionen medium blev omhyggeligt fjernes med en 200 uL pipette råd til de nanonets /hydrogeler (Fig 1D, også to klip af video (S1 Video og S2 Video) registrering indsamling af nanonets og medium kan findes i de understøttende filer) for gel elektroforese. Til opsamling af medium, til cellerne sattes 1 ml komplet MEM-medium uden 1

s, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 2 eller 24 timer. 100 pi af mediet blev opsamlet efter inkubation. For hvert af forsøgene blev prøven stammer fra samme batch af celler. Både nanonets /hydrogeler og mediet blev straks frosset ved -80 ° C efter samlingen. Den ekstra kontrol eksperiment 2h_N ingen celler og dynamiske profilering eksperimenter følger samme procedure for indsamling nanonets /hydrogel. Detaljerne i disse forsøg er beskrevet i S1 Filer.

SDS-PAGE

18 uL af hver prøve blev blandet med 12 pi 2X Laemmli lastning buffer. Opløsningerne blev blandet og inkuberet ved 95 ° C i 5 min. 15 pi af opløsningen blev anvendt til SDS-PAGE. Færdigstøbt 4-20% gel i Tris-HCI (10 godt, 30 ul) blev anvendt. Gelen blev kørt ved en konstant spænding på 200 V.

massespektrometrianalyse og databasesøgning

I proteinmasse analyse blev gelen farvet med Coomassie. Hver bane blev skåret i tre sektioner med molekylvægt svinger på: 250-80 (250-75); 80-40 (80-37); 40-10 kDa. Gelen blev udskåret med så lidt overskydende tomme gel som muligt, og blev anbragt i en mikro-centrifuge rør med ddH

2O. Prøverne blev opbevaret i Eppendorf-rør og sendt til Taplin massespektrometri Facility (TMSF fra Harvard Medical School) til analyse. Billederne af gelen før excision af gel bands blev indsendt (fotokopi og elektronisk) sammen med prøven. Prøven fremstilles for protein massespektrometri er 10 ug per bane. Masse-spektrometri og protein identifikation blev udført af TMSF.

Alle proteiner blev identificeret ved SEQUEST (databasen søgealgoritme, https://thompson.mbt.washington.edu/sequest) fra massen spec resultater og forudsagde fragmentering mønster af peptidet. Den SEQUEST output oplysninger blev givet af TMSF, herunder peptidsekvenser, XCorr (cross korrelation), ΔCn (delta korrelation), antal unikke og samlede peptider og samlede spektrum tæller. De SEQUEST resultat filer konverteres til gyldige PRIDE XML til forelæggelse for offentligt tilgængelige PRIDE database ved PRIDE konverter [17]. De massespektrometri proteomics data er deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE [18] partner repository med datasættet identifier PXD003924 og 10,6019 /PXD003924.

Resultater

Tid for kompatibilitet indsamling og celle af nanonets

for at vælge den optimale inkubationstid for indsamling af nanonets blev HeLa-celler inkuberet med 1

s i 3 til 9 timer, og mængden af ​​tubulins (en markør for autolyse af celler) [ ,,,0],19] i nanonets blev sammenlignet med det samme volumen (20 pi) af CM opsamlet efter 24 h inkubation. De indsamlede efter 3 eller 6 h inkubation nanonets indeholder mindre tubulin end opsamlet efter 24 CM (Fig A i S1 Fig), hvilket tyder på, at de indsamlede inden for 6 timer inkubation nanonets indeholder færre proteiner fra autolyse. I et andet eksperiment, tester vi levedygtigheden af ​​celler efter nanonet samling (4 h inkubation med 1

s), og opdager, at koldt chok og mellemstore fjernelse næppe fremkalde en ændring i cellernes levedygtighed (Fig B i S1 Fig). Disse resultater bekræfter, at kuldechok at indsamle nanonets inden 6 timer inkubation med cellerne er velegnet til opsamling af secretome.

Højere mængden og kvaliteten af ​​den secretome indsamlet af nanonets

For at vise, at pericellulære nanonets kan hurtigt samle sekretoriske proteiner, vi gennemfører 3 eksperimentelle indstillinger for samme inkubationstid 2h: først, pericellulære nanonets indsamlet fra HeLa-celler behandlet med 1

s i komplet dyrkningsmedium (2h_N); sekund, det komplette medium inkuberet med HeLa-celler (2h_CM) til sammenligning; og endelig det komplette medium behandlet med 1

s og 0,1 U alkalisk phosphatase uden HeLa-celler (2h_N ingen celler) som en kontrol. Uden yderligere forarbejdning, vi direkte anvender elektroforese til prøverne. De selv-samlet nanonets dissocierer til monomer 1 ved blanding med Laemmli loading buffer. På grund af sin lille molekylvægt (643 Da), 1 kører ud af gelen og har ringe negativ virkning på farvningen eller den yderligere protein analyse af gelen. Som vist i figur 2A, trods bliver maskeret af serumproteiner (hovedsagelig bovine albuminer), sølvfarvning af SDS-PAGE af begge forsøg med 2h_N og 2h_CM afslører, at 2h_N har mørkere plet end 2h_CM gør. Billede J [20] Analysen viser, at båndene i begge forsøg, ved 300, 160 og 13 kDa har alle naturligvis højere tæthed i 2h_N end i 2h_CM, som illustrerer, at der er flere proteiner i disse bånd i 2h_N (Fig 2B) . Men bandet ved 55 kDa, som primært består af bovin albumin fra dyrkningsmediet, har højere tæthed i 2h_CM end i 2h_N i forsøg I og har tilsvarende tæthed i 2h_CM og 2h_N i retssagen II. Disse resultater antyder, at de yderligere proteiner indsamlet af nanonets er de sekretoriske proteiner fra HeLa-celler frem for serumproteiner fra kulturmediet. Som vist i fig 2C, den massespektrometri af tandem-proteinet viser mere

samlede peptider

unikke peptider Salg (peptid, som kun findes i ét protein i human proteomanalyse) i 2h_N (1995 og 963 (trial i), 1952 og 990 (trial II)) end i 2h_CM (1401 og 603 (trial i), 1593 og 714 (trial II)) og 2h_N ingen celler (1209 og 784). Derudover 2h_N indeholder også betydeligt flere

totale proteiner

identificerede proteiner

(proteinet med 2 eller flere unikke peptider) end 2h_CM og 2h_N ingen celler gør (figur 2D). Disse resultater er enige med den observation i sølvfarvet SDS-PAGE som 2h N indeholder flere proteiner end CM kollektioner.

(A) Silver farvet SDS-PAGE viser proteinerne i HeLa secretome indhentet fra de pericellulære nanonets efter 2 h inkubation af forstadierne med cellerne (2h_N) og opsamlet ved centrifugering af konditioneret medium efter 2 h inkubation (2h_CM). Et stykke af hydrogel (Gel) indlæses til SDS-PAGE og farvet som baggrund. (B) Relativ massefylde af protein bånd af 2h_N og 2h_CM i de to forsøg på molekylvægt på 300, 160, 55, og 13 kDa. (C) I henhold til protein LC-MS /MS, antal samlede peptid og unik peptid observeres fra proteiner fra HeLa secretome opnået i 2h_N, 2h_CM, og proteinerne i 2h_N ingen celler. (D) Antal total protein og identificeret protein (unikt peptid nummer ≥2) [21,22] observeret fra protein LC-MS /MS i HeLa secretome opnået i 2h_N og 2h_CM i to forsøg og proteiner i 2h_N ingen celler. (E) Korrelation af de unikke peptid hits af proteiner påvises i 2h_N fra de to forsøg. (F) Korrelation af de unikke peptid hits af proteiner påvises i 2h_CM fra de to forsøg. (G) Sammenligning af identificerede proteiner mellem 2h_N og 2h_CM (de anførte proteiner identificeret i begge forsøg med 2h_N eller 2h_CM). HeLa secretome rapporteret i litteraturen [23] tjente som reference. (H) Analyse af de 122 proteiner identificeret i begge forsøg med 2h_N. Den subcellulære placering oplysninger af proteinerne blev indsamlet fra UniProt. (I) Lagkagediagrammer repræsenterer molekylære funktionelle profiler af proteinerne i secretome indsamlet af pericellulære nanonets fra HeLa-celler 2h_N og dyrkningsmedium efter 2h inkubation 2h_CM. De forudsagte sekretoriske egenskaber af proteiner blev analyseret af Secretome 2.0 og den funktionelle klassificering blev analyseret ved PANTHER.

Mens 2h_N forsøg har 161 og 181 identificerede proteiner, kun 144 proteiner identificeret i 2h_N ingen celler forsøg, betydeligt mindre end ved tidligere forsøg med HeLa-celler. forventes Manglen på identificerede proteiner, fordi fraværet af HeLa-celler i denne kontrolforsøg ikke ville resultere i kræft secretome. De 2h_CM forsøg, på den anden side, har 128 og 108 identificerede proteiner, hvilket er lidt mindre end 2h_N ingen celler forsøg. En mulig forklaring på den enestående protein forskellen mellem nanonets og CM kunne være det potentielle koncentrere virkning nanonets. Det er muligt, at nanonets har visse affinitet til lav koncentration proteiner eksisterer i pericellulære rum og medium. Denne berigelse fra nanonets kan føre til nogle identificerede proteiner i resultaterne. Derudover analyserer vi overlapningen af ​​identificerede proteiner mellem 2h_N ingen celler, 2h_N og 2h_CM. Den gennemsnitlige overlapning mellem 2h_N ingen celler og 2h_N er 84 proteiner, 30% (89 proteiner, 30% for trail I og 79-proteiner, 29% til trail II). Den gennemsnitlige overlapning mellem 2h_N ingen celler og 2h CM er 63 proteiner, 37% (60 proteiner, 37% for trail I og 66 proteiner, 36% til trail II). Denne ekstra kontrol eksperiment viser, at selv om nanonets kan have en koncentrere effekt, de nanonets dannet på kræft celleoverfladen stadig fælde nok secretome at opveje den mulige indflydelse fra mediet berigelse.

For at evaluere den præ-analytiske variation mellem de to metoder, nanonets og CM, vi plotte de identificerede proteiner i de to forsøg (udført af forskellige operatører) af antallet af unikke peptider (dvs. antal unikke moderioner) [24] af proteinerne. Som vist i fig 2E og 2F, den lineære regression af de identificerede proteiner i de to forsøg med 2h_N har en R

2 værdi på 0,77, hvilket er betydeligt højere end for de to forsøg med 2h_CM (R

2 værdi = 0,47), hvilket viser reproducerbarheden mellem de to forsøg med 2h_N er meget højere end for 2h_CM. Desuden sammenligning af det unikke peptid antal proteiner observeret i både 2h_N og 2h_CM tyder på, at de fleste af disse proteiner har flere unikke peptider påvist i 2h_N end i 2h_CM, hvilket bekræfter, at pericellulære nanonets indsamle mere sekretoriske proteiner end CM gør.

Desuden 67 af de totale proteiner identificeret i begge forsøg med 2h_N (122 proteiner) og i begge forsøg med 2h_CM (81 proteiner) (fig 2G) er identiske (tabel A i S1 tabel). Ved at udforske protein-protein interaktion netværk [25] af disse 67 proteiner (S2 Fig), finder vi, at de fleste (50 proteiner; 75%) er aktinerne, serpiner, collagener, tubulins og deres interagerende proteiner. Trods cytosol i oprindelse, aktinerne, tubulins og serpiner er almindeligvis til stede i secretome af humane celler, herunder cancerceller, [26,27], der er enig med den karakteristiske af ukonventionelle protein sekretion. [27] Ud over disse 67 proteiner, 2h N indeholder 55 ekstra proteiner (tabel B i S1 tabel), og 45 af dem er angiveligt forbundet med udviklingen af ​​visse former for kræft. Blandt de 55 proteiner kun observeret i 2h N, har 50 af dem blevet observeret i secretome af andre cancerceller. Men kun 27 af de 55 proteiner er blevet dokumenteret i secretome af HeLa-celler (opnået fra ultra-filtreret CM af HeLa-celler inkuberet med serum-frit medium), [23]. På den anden side, 2h_CM har kun 14 yderligere proteiner, andre end de 67 delte proteiner (tabel C i S1 tabel). Disse resultater indikerer, at 2h_N er mere følsom med at indsamle sekretoriske proteiner end 2h_CM. Interessant kun 34,4% af de 122 identificerede proteiner i 2h_N er sekretoriske proteiner og det meste af resten er intracellulære proteiner, som kategoriseret efter UniProt. [28] feature-baserede forudsigelse viser imidlertid, at over 60% af proteinerne er sekretoriske proteiner, klassisk (ved SignalP [29]) og ikke-klassisk (ved SecretomP [30]) (fig 2H). Disse data svarer til de beviser fra observation af kropsvæske hvis secretome indeholder klassiske og ikke-klassiske sekretoriske proteiner, såvel som intracellulære proteiner. [31] På den anden side, det protein profil af 2h_N ingen celler (tabel I i S1 tabel) viser kun 35% af de samlede forudsagte sekretoriske proteiner. Dette resultat i høj grad svarer til den kendsgerning, at kun dyrkningsmedium proteiner opsamles uden indblanding fra HeLa celle secretome. Vi derefter brugt PANTHER [32] for at analysere data fra protein massespektrometri af prøver af 2h_N og 2h_CM. Mens de procentdele af de fleste kategorier af de identificerede proteiner er ret ens i de prøver af 2h_N og 2h_CM, de secretome proteiner indsamlet af nanonets viser højere procentdele af proteiner til katalytisk, antioxidant og bindende aktiviteter (Fig 2i). Ovenstående resultater validerer, at selv-samlet nanonets fungere som en mere nøjagtig og følsom metode til indsamling af kræft secretome end CM.

Total proteiner fra tidsmæssige profil af kræft secretome registreret af nanonets

Den korte inkubationstid gør det muligt for pericellulære nanonets at registrere dynamikken i kræft secretome. Som vist i fig 3A, inkubere HeLa-celler i FBS-medium i forskellige tidsrum og derefter ændre mediet til FBS-frit medium indeholdende 1

s i yderligere 4 h inkubation producerer nanonet-indsamlet secretome af HeLa celler. Kontroleksperimentet bruger CM at indsamle secretome af HeLa-celler inkuberet i FBS-frit medium i 24 timer. [33] Ifølge protein massespektrometri-analyse af disse prøver (Fig 3B), mængderne af de samlede peptider og unikke peptider aftage fra N_0 prøven til N_8 prøve før trenden vender for N_12 prøve, som har en lidt større mængde af peptider end N_0 prøven. Selv CM giver de nyttige akkumulerende data for HeLa secretome efter standard 24 timers inkubering, er det naturligvis ikke i stand til at fange den dynamiske ændring af størrelsen af ​​proteinerne i secretome under 24 h inkubation.

(A) skema viser indsamling af nanonets fra HeLa-celler eksponeret i FBS-medium i forskellige tidsrum. Som en kontrol blev CM opsamlet fra HeLa-celler eksponeret i FBS-frit medium i 24 timer. (B) Antal af totale peptid og unikke peptider observeret i N_0, N_4, N_8, N_12, og CM ved protein massespektrometri. (C) Antal total protein og unik protein (unikt peptid nummer ≥2) [34,35] observeret i N_0, N_4, N_8, N_12, og CM ved protein LC-MS /MS. (D) Ændringen i unikke peptid antal flere væsentlige proteiner i secretome observeret i nanonets. (E) Ændringen i unikke peptid antal flere repræsentative proteiner (indsamlet i nanonets), der har høje unikke peptid hits observeret i MS protein profilering.

Kategorier af de proteiner forbliver globalt afbalanceret

Selv om visse individuelle proteiner i secretomes udviser betydelig variation, de funktionelle kategorier af proteinerne i secretome forbliver temmelig konstant. Vi bruger PANTHER at analysere data fra LC-MS /MS af disse prøver med præ-inkubationstider på 0 til 12 timer (Fig 4A, tabel H i ​​S1 tabel). De procentsatser for hver kategori af identificerede proteiner forbliver næsten konstant. Otte af ti (fig 4B) kategorier af secretomes viser den samme tendens i midlertidige ændringer-mængden af ​​proteiner oprindeligt falde i efterfulgt af stigende senere. Aktiviteten af ​​antioxidant og protein bindende transkriptionsfaktorer viser forskellige reaktioner på berøvelse af næringsstoffer (dvs. FBS gratis medium): antioxidant proteiner øges efter et kort interval (4 h) i næringsstoffer afsavn; proteinbindende transkriptionsfaktorer stige efter en median interval (8 h) næringsberøvelse. Interessant, disse to typer aktiviteter deler forholdsvis lave basislinjer i form af deres lille mængde af proteiner. Fordi den generelle tendens af sammensætningen af ​​proteiner er at forblive konstant til FBS-afsavn, den store variation af individuelle kategorier af små mængder af proteiner er usandsynligt at være forårsaget af forsøg på at opretholde proteostasis.

(A) Temporal cirkeldiagrammer repræsenterer molekylære funktionelle profiler af kræft secretome indsamles efter FBS-afsavn for forskellige længder af tid: 0 (N_0), 4 (N_4), 8 (N_8) og 12 timer (N_12). (B) Handlingen repræsenterer tidsmæssige adfærd af forskellige kategorier af kræft secretome baseret på molekyle funktioner, under FBS-afsavn for forskellige længder af tid (0, 4, 8 og 12 h) og inkubation i konditioneret medium i 24 timer. (C) Plottet viser den svingende område (vist som standardafvigelse) på den tidsmæssige adfærd for kategoriserede secretomes.

For bedre at forstå de secretome tidsmæssige profiler i løbet FBS-afsavn, inkluderer vi også resultatet af 24 timers inkubering i konditioneret medium (CM) som reference (fig 4B). Som vist i figur 4B, mængden af ​​proteiner i CM er tæt på den gennemsnitlige mængde proteiner i secretomes under midlertidige ændringer (fra 0 til 12 timer). Dette resultat betyder, at de globale cellulære aktiviteter forventes at forblive afbalanceret under FBS afsavn. Desuden viser disse resultater, at 4 h inkubation med nanonets fører til minimal forstyrrelse af secretome. For at forstå den tidsmæssige ændring af secretome på en mere præcis måde, vi også beregne de relative mængder af proteiner (S3-S7 Figner) og standardafvigelsesværdier i hver kategori af proteiner. Som vist i fig 4C, fordelingen af ​​standardafvigelser af de permanente ændringer af hver kategori af protein varierer mellem protein kategorier. For eksempel, mens standardafvigelsen værdien af ​​de udskilte proteiner i kategorien af ​​strukturelle molekylær aktivitet og binding er større end 20, standardafvigelsen værdien af ​​de udskilte proteiner i kategorien af ​​antioxidant og proteinbinding transkriptionsfaktoraktivitet er lavere end 5. Denne skelnen i distributionen viser, at omfanget af svarene til FBS-afsavn varierer mellem hver kategori af sekretoriske proteiner. Disse resultater, således et nyttigt indblik i adfærd af kræftceller under næringsstof afsavn.

Relative ændringer af proteiner i hver funktionel kategori

Den relative ændring af mængden af ​​proteiner, på derimod viser en neutral skiftende profil secretome ved hjælp af klar forskel mellem hvert tidspunkt divideret med resultatet af en kontrolgruppe (24 timer inkubation i FBS-frit medium) i forsøgsperioden tidsperiode. Resultatet af relative ændring (RC-værdi) for hver secretome beregnes ved hjælp af følgende formel:. Sammenligningen af ​​tidsmæssige mønster forandring baseret på RC værdi for 69 udvalgte proteiner med betydeligt skiftende profiler er illustreret i figur 5. Da visse proteiner kan tilhøre mere end en kategori, oplysninger om den funktionelle kategori af hvert protein er inkluderet i zonekort. Den samlede vifte af RC værdier (fra -86% til 100%) afspejler de generelle tendenser for stabil sekretion af kræft celle under stimulus af FBS-afsavn. Adskillige proteiner udviser en stor RC værdi (PCBP1, ALDH7A1, PRMT1, CALD1, etc.). Dette fænomen skyldes sandsynligvis det lille antal detekterede unikke peptider i kontrollen. Dette resultat yderligere indikerer, at bruge nanonets i stedet for CM er en mere kraftfuld og velegnet metode til opsamling af kræft secretome.

Fra 0 til 4 timer, 42 ud af 69 proteiner (vist i farven rød til blå ) udviser positive RC værdier (fig 5), hvilket tyder på en stigning i mængden af ​​proteinet som respons på en mangel på næringsstoffer. Efter yderligere 4 timer, bliver den generelle tendens til et fald på sekretion, hvilket fremgår af negative RC værdier på 38 af 69 proteiner (vist i farve grå til sort). Under de anførte tidsrum på 8-12 timer og 12-16 timer sekretionen antyder også samme faldende mønster eftersom mængden af ​​sekretion udviser negative RC henblik 46 og 39 ud af 69 proteiner, henholdsvis gennem disse to perioder. En kategoriseret analyse (figur 5) for kræft secretome afslører, at de fleste af de proteiner i den samme funktionelle kategori sjældent deler en fælles tendens tidsmæssige profiler af sekretion ved stimulering. Men for de multifunktionelle proteiner (dvs. tilhører forskellige funktionelle kategorier), deres tidsmæssige profiler normalt udviser lignende tendenser over hele stimulation tid. For eksempel, de proteiner, grupperet i funktionelle kategorier af både bindende og katalytisk aktivitet, såsom MCM2, DHX9, DHX15, SNRNP200, alle viser et fald i overflod for første 4 timer og efterfølgende stigning i resten af ​​FBS-afsavn; men andre proteiner i kun én af disse to kategorier (enten bindende eller katalytisk kategori) viser næppe fælles træk. Dette tal er tilsyneladende unik for “multifunktionelle” proteiner. F.eks GCN1L1, PSMD2, og IQGAP1, som tilhører både katalytiske og enzymatiske aktiviteter, udviser den samme mængde sekretion stigning for de første 4 timer, følge af et fald. Dette fænomen var ukendt tidligere, og det er bestemt fortjener yderligere undersøgelser.

Den dynamiske ændring af visse specifikke proteiner

Da dynamiske ændringer af secretome af kræftceller har været tidligere uopnåelige, selvom der indeholder meget vigtige oplysninger, vi analysere ændringer i overflod af flere væsentlige proteiner i prøverne fra N_0 til N_12. Sammenligning af antallet af unikke peptid hits af disse proteiner hjælper med at etablere deres timelige profiler (Fig 3D og 3E). Som vist i fig 3D, mængden af ​​alfa-actin 2 (ACTA2) og beta-actin (ACTB) udviser ringe ændring over tid (fra nu 0-4 timer (N_0) til 12-16 timer (N_12)), og mængden af alpha-tubulin 1A (TUBA1A) og beta-tubulin 2A (TUBB2A) kun ændre lidt over tid, enig med den observation, at aktinerne og tubulins har en konstant tilstedeværelse i secretome af pattedyrceller. [26,27] tværtimod den mængder af både kollagen alpha-1 (XII) (COL12A1) og fibronectin (FN1) falde drastisk, dvs. kollagen alpha-1 (XII) forsvinder fra N_4 til N_12, og fibronectin er fraværende i N_8 og N_12. Mængden af ​​to enzymer, Serpin H1 (SERPINH1) og pyruvat kinase (PKM), også falde betydeligt fra N_0 til N_12. Disse resultater antyder, at klare den sult induceret af FBS-berøvelse, HeLa-cellerne signifikant nedsætter eller muligvis opsuget de ekstracellulære matrixproteiner og de udskilte enzymer til opretholdelse proteostasis. [36] Vi undersøgte også flere proteiner med høje unikke peptid hits ( fig 3E). Især mængden af ​​plectin (Plec) undergår den største ændring fra N_0 til N_12. Mens faldet i plectin fra N_0 til N_8 af HeLa-cellerne er sandsynligt med det formål at opretholde proteostasis, den pludselige stigning af plectin i N_12 indikerer en lindres frigivelse af exosom, [37] at aftale sult adfærd kræftceller, der forsøger at manipulere tumor mikromiljøer (dvs. stimulere stromale og endotelceller) at støtte deres progression [38,39] Der er en anden interessant observation:., mens mængden af ​​alle andre proteiner falde i en vis grad i mindst én prøve af nanonets, mængden af ​​pyruvat