PLoS ONE: MicroRNA-200C modulerer ekspression af MUC4 og MUC16 ved direkte Målretning deres kodende sekvenser i human pancreas Cancer

Abstrakt

Transmembrane muciner, MUC4 og MUC16 er forbundet med tumor progression og metastatisk potentiale i human pancreas adenocarcinom. Vi opdagede, at MIR-200C interagerer med specifikke sekvenser i den kodende sekvens af MUC4 og MUC16 mRNA’er, og evaluerede den regulerende karakter af denne forening. Kræft i bugspytkirtlen cellelinjer S2.028 og T3M-4 transficeret med miR-200c viste en 4,18 og 8,50 fold nedregulering af MUC4 mRNA, og 4,68 og 4,82 fold nedregulering af MUC16 mRNA i forhold til mocktransfekterede celler. En signifikant reduktion af glycoprotein-ekspression blev også observeret. Disse resultater indikerer, at MIR-200C overekspression regulerer MUC4 og MUC16 muciner i bugspytkirtelkræftceller ved direkte målretning mRNA kodende sekvens af hver, hvilket resulterer i reducerede niveauer af MUC4 og MUC16 mRNA og protein. Disse data antyder, at ud over at regulere proteiner, der modulerer EMT, MIR-200C påvirkninger ekspression af celleoverflade muciner i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Radhakrishnan P, Mohr AM, Grandgenett PM, Steele MM, Batra SK, Hollingsworth MA (2013) MicroRNA-200C modulerer ekspression af MUC4 og MUC16 ved direkte Målretning deres kodende sekvenser i human kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (10): e73356. doi: 10,1371 /journal.pone.0073356

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: 19 Jul 2013; Udgivet: 25 oktober 2013

Copyright: © 2013 Radhakrishnan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud fra National Cancer Institute: SPORE (1P50CA127297), tidlig påvisning Research Network (5U01CA111294), Alliancen af ​​Glycobiologist for påvisning af kræft og kræft Risk (5U01CA128437), Tumor mikromiljø Network (U54 CA163120), og R01CA57362 . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er små (~ 20-22 nukleotider) ikke-kodende RNA’er, der regulerer genekspression ved interaktion med enten den 3 ‘utranslaterede region (3’UTR) eller kodende region af target mRNA’er. Ekspression af målrettede genprodukter påvirkes af miRNA induceret mRNA nedbrydning eller inhibering af translation [1]. Ændret ekspression af miRNA i cancerpatienter resulterer i tumorfremmende og tumor undertrykke funktioner. For eksempel, miR-155, miR-17-5p og miR-21 har kendt onkogene aktiviteter [2,3], hvorimod, miR-15a, miR-16-1, lad-7 og miR-145 fungerer som tumorsuppressorer [ ,,,0],4-9]. Det er blevet vist, at MIR-200C differentielt udtrykkes i pancreascancer, hvor høj ekspression var forbundet med bedre overlevelse og lav ekspression er associeret med ringere overlevelse [10]. Overekspression af miR-200C hæmmer kræft celle invasion ved modulerende faktorer vigtige i EMT [10]. Ektopisk udtryk for miR-200C inducerer højere niveauer af E-cadherin i bryst- og bugspytkirtelkræftceller ved direkte målretning af transskription faktor 8 (TCF8 /ZEB1), en negativ regulator af E-cadherin [11-14]. Derfor celler med høje niveauer af MIR-200c har en mere epitel- og mindre mesenkymale fænotype der kan have indflydelse metastase. For nylig, overekspression af MIR-200c blev vist at inhibere melanom tumorprogression og medikamentresistens [15].

afvigende ekspression af mucin-glycoproteiner er forbundet med kræft i bugspytkirtlen progression til metastase. De transmembrane muciner, MUC4 og MUC16, er aberrerende overudtrykt i mange adenocarcinomer, herunder human pancreascancer [16-18]. Den MUC4 mucin er et stort glycoprotein ved epitelceller udtrykkes i en række væv. MUC4 udtrykkes ikke i de normale pancreas, men udtrykkes afvigende i en høj procentdel af præmaligne og maligne læsioner på bugspytkirtlen [16,19]. MUC4 fremmer kræft vækst og metastase dels gennem interaktion med HER2 oncoproteinet [20,21]. MUC16 (CA125) er en høj molekylvægt mucin glycoprotein normalt udtrykkes i okulær overflade, luftveje og reproduktive organer, der indeholder epitelceller [22]. CA125, en epitop på MUC16, anvendes som en tumormarkør til detektion af ovariecancer i sera fra patienter [23] og MUC16 påvirkninger ovariecancer vækst og metastase [24]. Øget ekspression af MUC16 er også observeret i human bugspytkirtelkræft [17,18], og vi har for nylig vist, at der er forøget ekspression i metastatiske læsioner af bugspytkirtlen kræftpatienter [25].

Vi rapporterer her, at miR- 200c interagerer med specifikke sekvenser inden den kodende sekvens af MUC4 og MUC16 mRNA og regulerer deres niveauer af ekspression. Højere udtryk for transmembrane muciner og tab af miR-200C er stærkt forbundet med metastatiske karakteristika kræftceller.

Materialer og metoder

Cellelinjer og kultur

Humane bugspytkirtelkræftceller Capan-1 (American Type Culture Collection, ATCC), S2.007, S2.013, S2.020, S2.028 [26], HPAF (Generøse gave fra RS Metzgar, afdeling for Mikrobiologi og Immunologi, Duke University Medical center, Durham. North Carolina), og T3M-4 (venlig gave fra Tetsuro Okabe, University of Tokyo, Japan) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Hyclone, Logan, UT, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Valley Biomedical Inc., Winchester, VA, USA), 100 ug /ml streptomycin og 100 enheder /ml penicillin (Mediatech Inc., Manassas, VA, USA) og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator.

microRNA isolation og Real time-PCR (RT-PCR) analyse af miR-200C

miRNA blev udvundet fra bugspytkirtelkræftceller bruger Mirvana miRNA isolation kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA). Ekspression af miR-200C blev kvantificeret ved hjælp af TaqMan MicroRNA assay kit (ABI, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.

miRNA-200C overekspression i S2.028 og T3M-4 bugspytkirtelkræft cellelinjer

Oligonukleotider af det primære udskrift af miR-200C blev klonet ind p

Lyddæmper

4.1-CMV-plasmidet (Ambion, Carlsbad, CA, USA) (tabel S1) for at etablere en stabil ekspressionsvektor. Celler blev podet ved 75 x10

3 celler per brønd (plade med 12 brønde) dagen før transfektion, og 1 ug plasmid blev transficeret ind i cellerne den følgende dag under anvendelse af lipofectamin LTX med PLUS reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Celler blev anbragt under selektion med G418 (200 ug /ml) 48 timer efter transfektion. Kloner blev efterfølgende opsamlet og analyseret for MIR-200C ekspression i S2.028 cellelinje (klon 7), mens et polyklonalt udvalgt population blev anvendt til T3M-4 cellelinie. Celler transficeret med scrambled sekvens indeholdende vektor fra kittet (Ambion, Carlsbad, CA, USA) tjente som en negativ kontrol. Ekspression af MIR-200C blev kvantificeret under anvendelse af TaqMan-MicroRNA assaykit (ABI, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. U6 rRNA blev anvendt som en intern kontrol. Den fold-ændring i ekspression blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode [27].

methylenblåt Cell Proliferation Assay

Cell proliferation blev analyseret ved hjælp af en methylenblåt celle farvestof som tidligere beskrevet [28]. S2.028 og T3M-4 kontrol- og MIR-200C udtrykkende celler blev talt og udpladet ved 2000 celler per brønd i en plade med 96 brønde og 200 pi totalvolumen otte gentagelser for hver tidsramme. På hvert tidspunkt (24, 48, 72 og 96 timer) medier blev fjernet, og cellerne blev vasket en gang med 150 pi Dulbeccos PBS og fikseret med 150 pi 10% formalin i 30 minutter ved stuetemperatur. Formalin blev fjernet, og cellerne blev farvet i 2 timer med 80 pi af 1% methylenblåt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fortyndet med 0,01 M boratpuffer, pH 8,5. Celler blev vasket med 150 pi af 0,01 boratpuffer, pH 8,5, fire gange. Methylenblåt blev ekstraheret med 100 pi 0,1 N HCl /ethanol (1: 1) og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Absorbans ved 650 nm blev bestemt ved spektrofotometrisk analyse. Tovejs ANOVA blev anvendt til at analysere den statistiske forskel mellem grupperne. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Real-time PCR (RT-PCR) analyse af mucin udtryk

Total RNA blev isoleret fra S2.028 og T3M-4 celler ved hjælp af TRI Reagent (Molecular Research center, Cincinnati, OH, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev syntetiseret ved hjælp Verso cDNA kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Analyse af MUC1, MUC4, MUC16 og GAPDH mRNA niveauer blev udført med SYBR Green PCR Master Mix (ABI, Carlsbad, CA, USA). De følgende primere blev anvendt til RT-PCR: MUC1, F-5-CTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTG-3; R-5- TGAACCGGGGCTGTGG CTGG-3; MUC4, F-5-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3; R-5-ATGGTGCCGTTGTAATT TGTTGT-3; MUC16, F-5-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA-3; R-5-ACCAGTGGGCAT TCCAGAAAGAGA-3; GAPDH, F-5-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3; R-5-ACCAA ATCCGTTGACTCCGACCTT-3. Hvert forsøg blev udført tredobbelt. Forskelle i mucin genekspression, udtrykt som fold-changes, blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCt fremgangsmåde under anvendelse af GAPDH som intern kontrol.

Immunoblotanalyse af Muciner

SDS-Agarosegelelektroforese blev anvendt til at analysere mucin ekspression som tidligere [29] beskrevne. Celler, der udtrykker MIR-200c eller et kodet kontrol blev høstet og protein blev ekstraheret under anvendelse NP-40 cellelyse-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, 1% NP-40, pH 8,0) suppleret med proteaseinhibitorer (Promega, Madison, WI, USA). Cellelysater (50-100 ug proteiner) blev resolveret på SDS (0,1%) – agarose (2%) gelelektroforese og overført til PVDF-membran. Membraner blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk pulver i Tris-bufret saltvand (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl) med 0,1% Tween 20, pH 7,4. Membranerne blev inkuberet med følgende primære antistoffer: MUC1 (AR20.5-Mouse IgG, Quest Pharmatech Inc, Edmonton, Alberta, CA), MUC4 (8G7- Mouse IgG, venlig gave fra Dr. Surinder K Batra, Institut for Biokemi og Molekylær biologi, UNMC), MUC16 (AR9.6R333 Mouse IgG, Quest Pharmatech Inc, Edmonton, Alberta, CA) og α-tubulin (Mouse IgG, Developmental undersøgelser hybridom bank, Iowa, USA) (1: 1000 fortyndinger med 5% ikke -fat tørt mælkepulver i TBS-T), natten over ved stuetemperatur. Membranerne blev efterfølgende vasket (3 x 10 min) med TBS-T ved stuetemperatur og probet med 1: 5000 fortyndet gede-anti-muse-HRP-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) i 1 time ved stuetemperatur og vasket 3 x 10 min med TBS-T. Signalet blev detekteret med Super signal

® West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). En densitometrisk kvantificering af MUC4 og MUC16 proteinbånd blev udført under anvendelse af ImageJ (NIH). Den gange ændring i proteinbånd intensitet (procent arbitrære enheder) blev beregnet ved at dividere protein tætheden af ​​MIR-200C udtrykkende celler ved proteinet tætheden af ​​vektor kontrolceller. Påvisning af alfa tubulin blev anvendt som en loading kontrol.

vektorkonstruktioner

ORF regioner MUC16 og MUC4 mRNA, som blev forudsagt til at interagere med MIR-200C blev syntetiseret og indsat i pMIR-RAPPORT

TM miRNA Expression Reporter vektorsystem (ABI, Carlsbad, CA, USA) under anvendelse af Spel og HindIII restriktionssites (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Vildtype og mutant MUC4 og MUC16 /MIR-200C interaktioner sekvenser blev syntetiseret og anvendt i denne undersøgelse (tabel S1). Mutationer i potentielt MIR-200C bindingssteder blev dannet ved nukleotid erstatning af vildtype-sekvensen til at inhibere MIR-200c binding. Insertion og orientering af fragmentet blev bekræftet ved sekvensanalyse. De plasmider blev betegnet pMIR-RAPPORT

TM-wild (MUC16 og MUC4 wt) og pMIR-RAPPORT

TM-mutant (MUC16 og MUC4 mt) (tabel S1).

Transfektion og luciferaseassays

pancreascancer (S2.028 og T3M-4) celler blev dyrket i en 6-brønds plade og forbigående transficeret ved 60-80% konfluens med plasmiderne angivet ovenfor under anvendelse af Lipofectamine

TM 2000-reagens (Invitrogen life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til fabrikantens instruktioner. Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse luciferasereportergen Bestemmelsessystemer (Promega, Madison, WI, USA), 48 timer efter transfektion. Luciferaseassays blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger på en 96-brønds plade-læser (Polar Star Optima Microplate Reader, Offenburg, Tyskland). Alle værdier blev præsenteret som gennemsnit ± SEM af relative luciferaseenheder (RLU) fra tre uafhængige forsøg udført in triplo. En uparret t-test (to-halet) udførtes til statistisk analyse under anvendelse af GraphPad Prism® version 5.0 program. Forskelle med en p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

miR-200c:. Udtryk profilering og overekspression i bugspytkirtelkræft cellelinjer

Vi undersøgte udtryk for miR-200C i 7 bugspytkirtelkræft cellelinjer ved kvantitativ real-time RT-PCR. Som vist i figur 1A, 5 bugspytkirtelkræft cellelinjer, herunder Capan-1, S2.007, S2.013, S2.028, og T3M-4, udtrykker højere niveauer af miR-200c end S2.020 og HPAF celler.

(A) udtrykket af miR-200C i syv bugspytkirtelkræftceller blev bestemt ved Real-time PCR. Hver prøve blev kørt i firdobbelte og fejlsøjler repræsenterer SD. S2.028 (B) og T3M-4-celler (C), der stabilt udtrykker det primære transkript af MIR-200C blev bedømt for MIR-200C ekspression af Real-time PCR. Hver måling blev udført i tre eksemplarer. Disse værdier blev normaliseret med intern kontrol U6 rRNA. Den fold stigning i transkriptniveauer end vektor kontrol udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse Den p-værdi blev bestemt ved anvendelse af t-test. Forskelle med en p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Den modne sekvens af MIR-200C blev syntetiseret og klonet ind i en ekspressionsvektor som beskrevet ovenfor (p

Lyddæmper

4.1-CMV-MIR-200C) og stabilt udtrykt i S2.028 celler og T3M-4. Kvantitativ RT-PCR-analyse af miR-200C-ekspression i S2.028-miR-200C celler viste en 3,68 dobling og T3M-4-miR-200C celler viste en 2,6 gange stigning i modne miR-200C-niveauer i forhold til vektor kontrol transficerede celler (figur 1B og 1C). Vi bekræftede, at det rekombinante modne form af MIR-200C var aktiv ved at observere nedregulering i ekspressionen af ​​ZEB1, et kendt mål for MIR-200c, i begge S2.028 og T3M-4-celler (figur S1).

Vi undersøgte også ændringer i celle spredning egenskaber for miR-200c udtrykker S2.028 og T3M-4 bugspytkirtelkræftceller. En betydelig reduktion i vækst i S2.028 MIR-200C blev observeret ved 72 og 96 timer (*** p 0,0001) sammenlignet med S2.028 vektor kontrolceller (Figur S2a). Men ingen ændring blev observeret, når T3M-4 MIR-200c blev sammenlignet med vektor kontrolceller til enhver tid testet (Figur S2B). Punkt

MUC4 og MUC16 ekspression undertrykkes af MIR-200C

Vi vurderede evne miR-200c at regulere membranbundne muciner ved at udtrykke miR-200C (p

Lyddæmper

4.1-CMV-miR-200C) i bugspytkirtelkræft cellelinier S2.028 og T3M-4. Der var en dramatisk reduktion af MUC4 protein i S2.028-miR200c (1,7 gange) og T3M-4-MIR-200C (4,46 gange) celler i forhold til kontrol-celler (figur 2A og 2B). Tilsvarende var der en signifikant reduktion i MUC16 protein (høj og lav molekylvægt isoformer) i S2.028-miR200c (18,1 og 5,9 gange henholdsvis) og T3M-4-MIR-200C (5,2 og 6,1 fold henholdsvis) celler i sammenligning med kontrolceller (figur 3A og 3B).

Lysater fra (A) S2.028 og (B) T3M-4-mIR-200C og respektive vektorkontrol transficerede celler blev separeret på SDS-agarosegelelektroforese underkastet til western blot med et anti-MUC4 antistof (venstre paneler) og signaler blev kvantificeret ved densitometri og analyseret ved anvendelse af ImageJ programmet (højre paneler). MIR-200C udtrykkende celler viste en signifikant reduktion af MUC4 protein sammenlignet med kontrolceller i (A) S2.028 og (B) T3M-4-celler. Påvisning af alfa tubulin blev anvendt som en loading kontrol.

(A) S2.028 og (B) T3M-4-miR200c og ​​respektive vektorkontrol transficerede cellelysater blev adskilt ved SDS-Agarosegelelektroforese og underkastet western blot med et anti-MUC16 antistof (venstre paneler). Båndintensitet blev kvantificeret ved densitometri og analyseret ved anvendelse af ImageJ programmet (højre paneler). blev observeret signifikante reduktioner i både høje og lave molekylvægt MUC16 proteinisoformer i miR-200c udtrykker S2.028 (A) og T3M-4-celler (B), end i forhold til vektor kontrol celler. α-tubulin blev anvendt som en belastning kontrol.

miR-200C mål transkriptionelt membranbundne muciner MUC4 og MUC16

Vi observerede også en betydelig reduktion af både MUC4 og MUC16 mRNA-niveauer i miR200c udtrykkende cellelinier. MUC4 transkripter blev reduceret 4.18 og 8.50 fold i S2.028-miR200c og ​​T3M-4-miR200c (figur 4A og 4B) sammenlignet med kontrolceller. MUC16 transkripter blev reduceret 4,68 og 4,82 gange i S2.028-miR200c og ​​T3M-4-miR200c sammenlignet med kontrolceller (figur 4C og 4D). Disse resultater viser, at MIR-200C regulerer ekspression af onkogen MUC4 og MUC16 transkription og translation.

QRT-PCR-analyse af MUC4 (A og B) og MUC16 (C og D) blev udført i vektor kontrol og miR -200c transficeret S2.028 (A og C) og T3M-4-celler (B og D). Den relative udtryk for MUC4 og MUC16 blev evalueret af 2

-ΔΔCt metode bruger GAPDH som en intern kontrol. MIR-200C udtrykkende celler (S2.028 og T3M-4) viste signifikant reducerede niveauer af MUC4 mRNA’er sammenlignet med vektor kontrolceller (A og B). Ekspression af MUC16 transkript blev reduceret i MIR-200C udtrykkende S2.028 og T3M-4-celler (C og D). Alle målinger blev udført tredobbelt. Den fold stigning i transkriptniveauer end vektor kontrol blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Forudsigelse af miR-200C bindende sekvenser på MUC4 og MUC16

Potentielle miR-200c målretning regioner i MUC4 og MUC16 udskrifter blev identificeret ved hjælp af RegRNA MicroRNA mål forudsigelse webserver (https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). RegRNA miRNA target forudsigelse identificeret høj sandsynlighed for MIR-200c binding til kodende sekvenser af MUC4 mellem basepar 820-842 (Exon-1) (figur 5A) (Figur S3) og ti forskellige regioner, herunder ni forskellige exoner inden MUC16 mRNA-sekvens (figur 5B) (figur S3). Disse data førte os til at afgøre, om miR-200c direkte kunne målrette MUC4 og MUC16 udskrifter inden de oversatte regioner.

Muligt miR-200c rettet mod regioner i MUC4 og MUC16 blev identificeret ved hjælp af RegRNA MicroRNA mål forudsigelse webserver ( https://regrna.mbc.nctu.edu.tw/index1.php). A, RegRNA miRNA target forudsigelse viser, at MIR-200C binder mellem basepar 820-842 i det første exon af MUC4. B, I MUC16 mRNA er miR-200c forudsagt at binde ni forskellige exons herunder E1, E3, E19, E39, E44, E49, E54, E64 og E73. Tallene angiver regionen af ​​mRNA’er der interagerer med miR-200c.

miR-200c direkte rettet mod de kodende sekvenser af MUC4 og MUC16

Vi vurderede binding af miR-200c til formodede målsekvens ved kloning regionerne indeholdende humane MUC4 og MUC16 kodende sekvenser i pMIR-Luciferase reporter vektor (pMIR-MUC4 og MUC16 vægt). Negative kontroller blev fremstillet, hvori pMIR-MUC4 og MUC16 sekvenser blev muteret ved de formodede bindingssteder for MIR-200C og muciner (pMIR-MUC4 og MUC16 mt) (figur 6A). S2.028 og T3M-4 /MIR-200C-celler blev transient transficeret med plasmid-DNA’er koder vektor alene, vildtype MUC4 og MUC16 sekvenser i vektoren, og mutanttype MUC4 og MUC16 sekvenser i vektoren. Vi observerede, luciferase reporter aktiviteten blev signifikant undertrykt i både MUC4 og MUC16 i S2.028 og T3M-4 MIR-200C-celler transficeret med vildtypesekvensen vektorer sammenlignet med vektorkontrol transficerede celler (*** p 0,0001, MUC4-wt , MUC16-wt vs vektor kontrol) (figur 6B-E). Imidlertid viste celler transficeret med mutant sekvens indeholdende vektorer signifikant forøget luciferase reporter aktivitet (*** p 0,0001, MUC4-wt vs MUC4-mt; MUC16-wt vs MUC16-MT)., (Figur 6B-E)

(A) vildtype og muterede sekvenser af MUC4 og MUC16 blev klonet ind i pMIR-Luciferase-vektoren (pMIR-MUC4 wt og MUC16 vægt) og (pMIR-MUC4 mt og MUC16 mt) hhv. Vektorer, der udtrykker pMIR-Luc, pMIR-MUC4 vægt, pMIR-MUC16 vægt, pMIR-MUC4 mt og pMIR-MUC16 mt blev transficeret ind S2.028miR-200C (B og D) og T3M-4miR-200C-celler (C og E) og luciferaseaktivitet blev kvantificeret 48 timer efter transfektion. Resultaterne blev udtrykt som relative luciferaseaktivitet (middel ± SEM for tre uafhængige bestemmelser). Den p-værdien blev bestemt ved anvendelse af t-test (

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi demonstrerer for første gang, at en MIRR-200C mål højmolekylære mucin glycoproteiner af targeting deres kodende sekvens for nedbrydning eller translationel inhibering. Specifikt mIR-200C målretter MUC4 og MUC16 exonsekvenser at regulere mRNA og protein niveauer for hver af disse muciner. Vi har vist, at mIR-200C differentielt udtrykkes i bugspytkirtelkræftceller. Yu et al observeret en signifikant højere overlevelsesrate i bugspytkirtlen kræftpatienter med højere niveauer af miR-200c i forhold til dem med lavere niveauer af miR-200c [10]. Tidligere arbejde har også vist, at bugspytkirtelkræftceller overudtrykker miR-200C udviser reduceret invasion og øget niveauer af E-cadherin-mRNA, hvilket tyder på, at mIR-200C spiller en inhiberende rolle i pancreas cancervækst og invasion [10]. Overekspression af mIR-200C forøgede hastigheden for proliferation i SUIT-2, PANC-1 og KP-3 pancreascancer celler [10], men observerede vi reduceret proliferation af S2.028 miR-200C udtrykker celler, hvilket tyder på, at cellevækst egenskaber forskelligt reguleret af miR-200C er kontekstafhængig. MIR-200C er blevet beskrevet som en kraftig mester regulator af epitel-til-mesenkym overgang i bryst- og ovariecancer celler gennem ændring af ekspressionen af ​​ZEB1 og E-cadherin ved binding til 3’UTR’er og kørsel nedbrydning eller blokere translation af mål-mRNA’et [11-14]. Restaurering af miR-200C udtryk i meget aggressive bryst og ovariecancerceller væsentligt reduceret invasion, migration og lægemiddelresistens af disse tumortyper [30,31]. Disse rapporter tyder på, at indførelsen af ​​miR-200C til kræftceller kunne vende tumor progression og tilvejebringe en ny behandlingsstrategi

Et flertal af rapporter viser, at miRNA målrette den ikke-kodende 3’UTR af mRNA’er.; men de seneste rapporter vist, at miRNA også kan målrette kodende sekvenser af pattedyrgener. Vi rapporterer her, at MIR-200C mål exon kodende sekvenser i transkripter af højmolekylære mucin glycoproteiner MUC4 og MUC16 og reducerer mRNA og proteinekspression. Tilsvarende Huang et al, rapporteret, at MIR-181a er rettet mod et stort antal zinkfinger-gener ved at binde til deres kodende sekvenser [32] og Duursma et al rapporterede, at MIR-148 mål humant DNA methyltransferase 3b (DNMT3b) aminosyre-kodende regioner [ ,,,0],33]. Lad-7 miRNA målretter den kodende region af miRNA processerende enzym, Dicer [34]. Murine Nanog, Oct4 og Sox2 gener indeholder mange bindingssteder i exon kodende sekvenser for naturligt forekommende miRNA [35]. Disse rapporter tyder på, at miRNA målrette specifikke gen familier inden kodende områder.

Regulering af MUC4 og MUC16 af miR-200c kan være gennem virkninger på enten transkription eller translation. I begge celler linjer undersøgt her, blev MUC16 proteinniveauer reduceret i højere grad end MUC4. Denne øgede målretning af MUC16 af MIR-200C kan skyldes tilstedeværelsen af ​​ti forskellige MIR-200C bindingsregioner i MUC16 mRNA sammenlignet med den fælles bindingsområde i MUC4 kodende sekvens, øge muligheden, at antallet af målretning websteder i en udskrift påvirker følsomheden af ​​denne udskrift til miRNA regulering.

for nylig Ponnusamy et al rapporterede, at overekspression af MUC4 resultater i epitelial til mesenkymale overgang gennem nedregulering af E-cadherin og øget kræft celle migration og invasion i kræft i æggestokkene celler [36]. Disse resultater er i overensstemmelse med vores undersøgelse, som viser, at overekspression af mesenkymale at epitel fremme miR-200c ned regulerer ZEB1 og MUC4 i bugspytkirtelkræftceller.

MUC16 er stærkt overudtrykt i kræft i æggestokkene og moderat overudtrykt i bugspytkirtelkræft , men den rolle, MUC16 i bugspytkirtelkræft progression er ikke blevet grundigt undersøgt. Den signifikant reduceret niveau af MUC16 observeret i MIR-200C overudtrykker celler, sammen med den veldokumenterede rolle MIR-200C i multiple stadier af kræft progression antyder, at MUC16 kan spille en rolle i pancreas vækst cancercellen og metastase. Disse studier indikerer, at opregulering af muciner og nedregulering af MIR-200C forbedre cancercellelinjer maligne egenskaber og derved inducere pankreatisk cancervækst og metastase.

Flere undersøgelser har vist, at afvigende og forøget ekspression af MUC4 og MUC16 forekommer under pancreascancer progression til metastase [17-19,25]. For nylig, Mohr et al viste MIR-200C-ekspression blev reduceret i primære pancreatiske tumorvæv sammenlignet med nogle metastatiske steder [37]. Disse resultater understøtter generelt den hypotese, at udsving i miR-200c bidrager til regulering af ekspressionen af ​​MUC4 og MUC16 under pancreas tumor progression og metastaser.

Som konklusion, vores undersøgelse præsenterer den første bevis på, at MUC4 og MUC16 er reguleret på den post-transkriptionel niveau ved en miRNA, miR-200C, som direkte retter sig mod MUC4 og MUC16 inden for deres aminosyre kodende regioner. Disse resultater indikerer, at miR-200c kan have en potentiel hæmmende rolle i bugspytkirtlen vækst og metastase kræft og yderligere undersøgelser er nødvendige for at afgrænse de lovgivningsmæssige forhold mellem membranbundne muciner og miR-200c.

Støtte oplysninger

figur S1.

QRT-PCR-analyse af ZEB1. Overekspression af MIR-200C reducerede signifikant ekspressionen af ​​ZEB1 i både (A) S2.028 og (B) T3M-4-celler. Den fold stigning i transkriptniveauer end vektor kontrol blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse En p-værdi på mindre end 0,05 anses for at være statistisk signifikant

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s001

(EPS)

figur S2.

Celleproliferationsassay. S2.028 (A) og T3M-4 (B) (MIR-200C og vektor kontrol) celler proliferation til forskellige tidspunkter blev målt ved methylenblåt assay. Two Way ANOVA blev anvendt til at opnå statistisk signifikans (***, s 0,001; ns, ikke-signifikant)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0073356.s002

(EPS)

Figur S3 .

Forudsigelse af miR-200C bindingssteder i muciner. Potentielle miR-200C bindingssteder i membranbundne muciner (MUC4 og MUC16) udskrifter blev identificeret ved hjælp af RegRNA MicroRNA mål prædiktor webserver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0073356.s003

(EPS)

tabel S1.

Liste over oligonukleotider anvendt til MIR-200C-ekspression og luciferase assay system.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073356.s004

(DOCX)

Tak

Vi takker Dr. David Kelly for ekspert teknisk bistand i luciferaseanalyse

.