PLoS ONE: En indirubin Derivat, indirubin-3′-monoxim Undertrykker Oral Cancer tumorigenese via nedregulering af Survivin

Abstrakt

Oral cancer er den fjerde mest almindelige dødsårsag af kræft i taiwanske mænd. Indirubin-3′-monoxim (I3M), en potent cyclin-afhængig kinase inhibitor, har terapeutiske virkninger i andre cancerceller. I denne undersøgelse, vi udført

in vitro

assays til at teste cellelevedygtighed, cellecyklusprogression, apoptose, celle migration og invasion i denne kræfttype. Desuden ved anvendelse af en oral tumorigen dyremodel undersøgte vi målgen og protein-ekspression ved hjælp af real time qPCR, immunoblotting og immunhistokemisk farvning. Vores resultater viser, at I3M har en antiproliferativ virkning i begge Cal-27 og HSC-3 orale cancercellelinier, og at behandlingen af ​​Cal-27 og HSC-3-celler med I3M resulterer i apoptose gennem aktivering af cytochrom

c

. Desuden I3M afbryder cellecyklussen i Cal-27-celler på en dosis-afhængig måde ved standsning celler i G2 /M-fasen. Vi fandt også, I3M undertrykker migration og invasion i Cal-27-celler ved at inhibere ekspressionen af ​​fokal adhæsion kinase, urokinase-plasminogenaktivator-inhibitor, og matrixmetalloproteinase 9. Desuden har vi identificeret survivin som et målprotein i I3M-behandlede orale cancerceller . Ved anvendelse af en oral cancer musemodel, viser vi, at topisk påføring af en klæbende gel sammensat af I3M og poly (vinylalkohol) (I3M /PVA) har dosisafhængig anti-tumorfremkaldende virkninger. Efter behandling blev ekspressionen af ​​survivin protein og mRNA nedreguleres i kræft væv. Endvidere blev plasma survivin niveauer reduceres også i I3M-behandlede mus. Disse resultater antyder, at topisk anvendelse af I3M, et lægemiddel syntetiseret fra indirubin, som findes i Qing-Dai – har terapeutisk potentiale til behandling af oral cancer

Henvisning: Lo WY, Chang NW (2013) An indirubin Derivative. , indirubin-3′-monoxim Undertrykker Oral Cancer tumorigenese gennem nedregulering af Survivin. PLoS ONE 8 (8): e70198. doi: 10,1371 /journal.pone.0070198

Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: May 1, 2013; Accepteret: 16 juni 2013; Udgivet: 13 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Lo, Chang. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne vil også gerne takke The National Science Council (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-MY3), The Taiwan Department of Health, China Medical University Hospital Cancer Research center of Excellence ( DOH102-TD-C-111-005) og Kina Medical University Hospital (DMR-96-043) til at understøtte dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral pladecellekræft (OSCC) tegner sig for ca. 90% af orale maligniteter. Ca. 274.000 nye tilfælde diagnosticeres årligt i hele verden, og trods forbedrede diagnostiske og terapeutiske metoder, patienter har kun en 50% overlevelsesrate over 5 år [1]. Rygning, betel-quid tygges, alkoholrelaterede, og røgfri tobak udgør de væsentligste risikofaktorer for kræft i mundhulen. Aktuelle behandlingsmuligheder for kræft i mundhulen omfatter kirurgi, strålebehandling, og kemoterapi, selv om 5-årige overlevelsesrate for kræft i mundhulen er stadig en af ​​de laveste blandt almindelige maligne neoplasmer [2]. Oral cancer er den sjette mest almindelige kræftform i Taiwan og den fjerde mest almindelige dødsårsag af kræft blandt taiwanske mænd siden 2006 [3]. Derfor er identifikation af nye midler og nye mål for behandling af oral cancer er nødvendig for at forbedre kliniske behandling af denne sygdom.

Danggui Long Hui Wan er en forbindelse fra traditionel kinesisk medicin, der bruges til behandling af kronisk myeloid leukæmi [4], og den aktive bestanddel synes at være Qing Dai (

indigo Naturalis Salg), som indeholder høje niveauer af indigo farvestof. Desuden har anti-leukæmiske aktivitet af denne ingrediens er blevet tilskrevet den rød-farvede indigo isomeren indirubin. Indirubin og dets derivater kraftigt inhiberer væksten af ​​forskellige humane cancerceller, hovedsagelig gennem cellecyklusstop (ved G2 /M eller G1-fasen) efterfulgt af apoptose [5], [6]. Det er blevet bestemt, at indirubin derivater er stærke inhibitorer af cyclinafhængige kinaser (CDK’er), glycogensyntasekinase-3β [7], c-Src-kinase og STAT3 signalering [8], [9]. Ud fra følgende betragtninger indirubin selv har ringe opløselighed, en lav udnyttelsesgrad, og betydelig gastrointestinal toksicitet, syntetisk indirubin-3′-monoxim (I3M) har bedre farmakologiske egenskaber og reduceret toksicitet. Endvidere sammenlignet med indirubin, I3M inhiberer mange yderligere proteinkinaser samt STAT3 signalering, og det har vist sig at have anti-proliferative virkninger i vaskulære glatte muskelceller [10] – [12]. For nylig indirubin-3′-oxim også blevet rapporteret inducerer mitokondriel dysfunktion og udløser vækstinhibering og standsning af cellecyklus i humane neuroblastomceller [13]. Derfor er I3M betragtes som en af ​​de mest potente indirubin derivater til behandling af cancer.

Survivin er en kritisk determinant for celleoverlevelse, og det fungerer både ved at regulere celledeling og inhibere apoptose [14]. Som medlem af inhibitoren af ​​apoptose (IAP) familie af proteiner, blev survivin oprindeligt karakteriseret som et fysisk caspaseinhibitor, hvilket giver en cytobeskyttende trin nedstrøms for død receptoren og mitokondriel apoptose [15]. Imidlertid er det nu kendt, at X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) er den eneste sande fysiologiske inhibitor af caspaser 3, 7 og 9 [16]. Trods manglende strukturelle motiver, der medierer caspase binding, kan survivin inhibere aktiv caspase 9 gennem samarbejde med hepatitis B virus X-interagerende protein [17]. Endvidere sammenslutningen af ​​survivin med XIAP fører til en synergistisk inhibering af caspase 9-aktivering [18]. Mange undersøgelser har vist, at survivin overudtrykkes i forskellige humane cancere og er forbundet med generelt dårlig prognose [19]. Mere specifikt survivin ekspression korrelerede med dårlig prognose og kemoresistens i oral cancer [20] – [22]. Desuden hæmning af survivin i forskellige hoved og hals kræft øger anti-tumorigene aktiviteter flere cytotoksiske og målrettede behandlinger [23].

Med udgangspunkt tidligere undersøgelser, vi havde til formål at undersøge, hvilken rolle survivin med hensyn til I3M behandling i kræft i mundhulen. I denne undersøgelse viser vi, at I3M har flere anti-tumorigene aktiviteter, og at det kan inhibere celleproliferation, migration og invasion, mens på samme tid at fremme apoptose, i orale cancerceller. Brug immunblotting og real-time qPCR-analyse, fandt vi, at survivin ekspression blev nedreguleret i cancer cellelinje Cal-27 efter I3M behandling, identificere survivin som en potentiel mediator af de anti-tumorigene aktiviteter I3M. Endelig har vi bekræftet, at I3M hæmmer survivin udtryk og viser anti-tumorigen aktivitet i en mundtlig tumorgenese musemodel. Vores resultater tyder på, at I3M undertrykker kræft i mundhulen tumorigenese ved at mediere aktiviteten af ​​survivin.

Materialer og metoder

Etik Statement

protokol, der bruges til den eksperimentelle mus blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Kina Medical University (IACUC godkendelse nr. CMU-99-26-N). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer (Affidavit af Godkendelse af Animal Brug protokol, No. 98-33-N) er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) Kina Medical University (Taichung, Taiwan).

Reagenser og cellekultur

indirubin, I3M, dimethylsulfoxid (DMSO), thiazolyl blå tetrazolium (MTT), trypanblåt, triton X-100, og penicillin /streptomycin blev indkøbt fra Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA).

den menneskelige oral cancer cellelinje Cal-27 og cellelinie HSC-3 blev købt fra Bioresource Indsamling og Research center (BCRC), fødevareindustrien forskning og udvikling Institute (FIRDI) (Hsinchu, Taiwan). Celler blev udpladet i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Gibco) og DME /F-12 (Gibco) suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin, 100 ng /ml streptomycin og 1% glutamin ved 37 ° C [24 ], [25].

MTT assay

Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse af et MTT-assay. Celler blev podet i plader med 96 brønde i en koncentration på 1000 celler /brønd. Seks brønde blev analyseret for hver eksperimentel behandling. Efter at cellerne var behandlet med 0, 5 eller 10 uM indirubin eller I3M (opløst i 0,1% DMSO) i 0, 24 eller 48 timer, 20 pi MTT-reagens (5 mg /ml; Sigma) blev tilsat til hver brønd , og cellerne blev derefter inkuberet i 3 timer. Reaktionen var stoppet ved fjernelse af MTT reagenset. DMSO (150 pi) blev derefter tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Absorbansen blev målt ved 570 nm. Virkningerne blev også vurderet ved celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Alle målinger blev udført tredobbelt.

Fremstilling af subcellulære fraktioner og immunoblotting af cytochrom c

Celler blev udpladet i 10 cm skåle og behandlet med variabel I3M dosis i 24 timer. Efter inkubationen blev cellerne høstet, resuspenderet i celleekstrakt buffer (20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 mM dithiothreitol), der indeholder 250 mM sucrose og proteasehæmmer blanding (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) og homogeniseret. Homogenaterne blev centrifugeret to gange ved 1.000 x

g

i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse kerner og ubrudte celler. Supernatanterne blev derefter centrifugeret ved 10.000 x

g

i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne fra de 10.000 ×

g

centrifugering er benævnt “cytosolisk fraktion”. De cytosoliske proteinprøver (30 g) blev adskilt på 12% SDS-PAGE geler og immunolabeled med anti-cytochrom

c

(1:1000) og anti-β-actin (1:1000) primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Den anden peberrodsperoxidase-mærket antistof blev inkuberet med blots, efterfulgt af vask. Kemiluminescerende signaler blev påvist under anvendelse SuperSignal West Femto- kemiluminiscerende substrater (Pierce) ifølge producentens anvisninger.

mitokondrie piller fra den første 10.000 ×

g

centrifugering blev resuspenderet i celleekstrakt puffer indeholdende 250 mM sucrose at beskytte mitokondrier med 20 slag ved anvendelse af en homogenisator. Homogenater blev centrifugeret ved 750 ×

g

for 3 x 10 minutter ved 4 ° C for at fjerne snavs og kerner. Supernatanten blev derefter centrifugeret ved 15.000 ×

g

i 20 minutter; pelleten, som indeholdt “mitokondrier fraktion”, blev lyseret i SDS lysepuffer; og 30 ug mitokondrielle proteiner blev underkastet immunoblotanalyse som ovenstående beskrivelser.

Annexin V /PI-farvning

Cal-27-celler (10

5) blev podet i hver brønd i en 6-brønds plade og behandlet med enten DMSO eller 10 uM I3M i 24 timer. Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (Strong Biotech Corporation, Taiwan) blev anvendt til bestemmelse af procentdelen af ​​apoptotiske celler. Kort fortalt blev de høstede celler vasket med PBS og centrifugeret ved 200 ×

g

i 5 min. Cellepellets blev resuspenderet i farvning buffer og farvet med annexin V-FITC og PI i 15 minutter ved 25 ° C ifølge producentens anvisninger. Celleprøverne farvet under anvendelse af disse reagenser kunne opdeles i tre populationer: apoptotiske celler (markeret med grøn fluorescens), døde celler (markeret med rød eller gul fluorescens som følge af en kombination af rød og grøn fluorescens), og levende celler (som viser lidt til ingen fluorescens). Cellerne blev analyseret ved anvendelse af en Tali ™ Billede cytometer (Invitrogen). Den Tali ™ Billede cytometer indfanger 20 billeder af en plettet prøve, automatisk analyserer billeder med digitalt billede-baserede celletælling og fluorescens-afsløring algoritmer, og viser en præcis kvantitativ analyse af levende, døde, og apoptotiske cellepopulationer. Alle målinger blev udført tredobbelt.

Cellecyklusanalyse

Cal-27-celler blev behandlet med 0, 2,5, 5 eller 10 uM I3M, og efter 24 timer blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS). Cellerne blev fikseret natten over med kold 70% ethanol og derefter farvet med en cyklus PI opløsning bestående af 2 mg /100 ml PBS CAT PI, 1 × PBS, 10 mg /ml RNase A, og 5% Triton X-100. Efter inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke, blev en FACScan flowcytometer anvendes til påvisning fluorescensaktiveret celler. Alle målinger blev udført tredobbelt.

Migration bestemmelse

Cal-27-celler (10

6 celler /brønd) blev udpladet i 6-brønds plader og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter “såret” ved at skrabe individuelle brønde med en pipettespids. Cellerne blev inkuberet med DMEM-medium (uden FBS) enten med eller uden indirubin og I3M (10 uM). Celler blev fotograferet ved hjælp af fase-kontrast mikroskopi (100 × forstørrelse). Den migreringsevnen af ​​cellerne blev vurderet ved at måle bredden af ​​sår. De migration afstande på cellerne blev afledt af forskellene mellem bredder af sårene ved 0, 24, og 48 timer.

Transwell kultur for invasion analyser

invasive evner af kræft celler behandlet med eller uden I3M blev undersøgt ved anvendelse af membranen Transwell dyrkningssystemet. Kort fortalt, vi bruges Transwell membraner (8 um porestørrelse, 6,5-mm diameter; Corning Costar Corporation) coatet med Matrigel for assayene. Celler (1 x 10

4 celler) blev podet i de øvre brønde på præcoatede Transwells med I3M (0, 2,5, 5 eller 10 uM). De lavere Transwells indeholdt det samme medium. Efter 24 eller 48 h inkubation blev celler fra de øverste brønde og de Matrigelcoatede membraner pensles med en vatpind, fikseret med methanol og farvet med en 20% Giemsa-opløsning (Sigma). Cellerne blev talt under anvendelse af lysmikroskopi (200 x forstørrelse). Tre uafhængige forsøg blev udført tredobbelt

immunblotting

In vitro undersøgelser:.

Efter hver behandling blev celler isoleret til bestemmelse af proteiner associeret med vandrende og invasive funktioner, herunder P21 (20 kDa) og P53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology), survivin (human, 16 kDa), matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), fokal adhæsionkinase (FAK, 125 kDa ), u-PA (34 kDa), og p-p38 (Santa Cruz Biotechnology). Prøver blev ekstraheret fra de isolerede celler (med eller uden I3M behandling), adskilt på 12-15% SDS-PAGE geler og overført til PVDF-membraner. blev påvist kemiluminescerende signaler som beskrevet ovenfor for cytochrom

c

. Signalerne blev taget til fange og kvantificeret ved hjælp af ChemiGenius Bio Imaging System (Syngene)

In vivo undersøgelser:.

Plasmaprøver (40 pg protein) blev anvendt til at bestemme indholdet af survivin udskilles af den tumorer under anvendelse af immunoblotting og en survivin (mus) monoklonale antistof som beskrevet ovenfor. Vi brugte SwellGel® Blå Albumin Removal Kit (Pierce) at berige plasmaprøver.

Bioluminescent analyser af aaspase-3/7 og -9

En tidsafhængig undersøgelse af caspase-3 /7 og -9 aktiviteter blev udført i triplikater under anvendelse assaykits Caspase-Glo 3/7 og 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) på hvid mikroplade med 96 brønde. 10.000 celler per brønd blev podet og behandlet med 10 uM I3M til 12, 24 og 48 timer. Derefter blev caspaseaktivitet undersøgt ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev 100 pi af caspase-Glo-reagens tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. De tilstedeværelse af aktive caspaser fra apoptotiske celler vil spalte det syntetiske tetrapeptid, mærket med aminoluciferin i reagenset. Det frigivne aminoluciferin virker som et substrat for luciferaseenzymet, som måles ved hjælp af Synergy ™ 2 Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Winooski, Vermont).

Fremstilling af indirubin-3′-oxim /poly (vinyl alkohol) (I3M /PVA) adhæsiv lægemiddel

PVA (10 g; Sigma) blev suspenderet i varmt destilleret vand (100 ml, 90 ° C) og omrørt indtil fuldstændig opløsning. Efter polymeren syntes at være fuldstændig opløst, blev temperaturen og omrøringen opretholdt i yderligere 4 h for at sikre, at aggregatet ikke længere var til stede. Opløsningen blev afkølet til stuetemperatur, og I3M blev tilsat for at opnå 10 og 20 uM I3M /PVA lim drug blandinger.

Udvikling af 4-nitroquinolin-1-oxid (4-NQO) inducerede oral tumorigen musemodel

Vi evaluerede anti-tumorigen aktivitet I3M ved hjælp af en oral tumorigen model i Six uger gamle mandlige C57BL /6JNarl mus (kropsvægt: 21,6 ± 1,2 g). For at inducere den optimale dannelse af oral SCC’er, vi included0.2 mg /ml 4-NQO og 0,5 mg /ml arecolin i dyrenes drikkevand i 8 uger som vores tidligere publiceret [26]. Mus (n = 240) blev randomiseret til en af ​​fire grupper: blank gruppe (n = 60) modtog kun drikkevand; Carrier gruppe (n = 60), 10 uM I3M (n = 60) og 20 uM I3M (n = 60) grupper modtog både 4-NQO (200 ug /ml) og arecolin (500 ug /ml) for at udvikle OSCC dyr modeller. Efter den tidligere undersøgelse, blev deres drikkevand ændret hver uge, og musene fik adgang til vand på alle tidspunkter under arecolin /4-NQO behandling, før påbegyndelsen af ​​I3M behandlinger. Efter tumor-induktion-protokol, som varede i 8 uger [24], blev tunger og buccale områder af mus smurt med PVA alene (carrier gruppe) eller med enten 10 eller 20 uM I3M /PVA hver 2 dage i 20 uger ( 0,1 mg /g mus legemsvægt), som blev påbegyndt efter week8 (fig S1, figur 1 og 2). Lokalbehandlinger blev indledt på 08:00 og blev afsluttet inden for en time. De behandlede mus blev forbudt adgang til drikkevand og mad indtil 12:00 Alle mus blev vejet hver 4. uge. Musene (n = 10) blev aflivet hver måned fra hver gruppe efter uge 8; efter CO

2 behandling, et gennemsnit på 0,9-1,3 ml hjerte blod blev opsamlet fra hver mus, og deres tunger blev skåret hele (med tumorer), fast, indlejret, og sektioneret for hematoxylin og eosin farvning.

(A) De hæmmende virkninger af indirubin og I3M på Cal-27 og HSC-3 celleproliferation. Celler blev behandlet i 24 eller 48 timer med forskellige koncentrationer af indirubin eller I3M. Celleproliferation blev analyseret ved MTT-assay (øverst) og celletælling under anvendelse af et hæmocytometer (nederst). Dataene er præsenteret som gennemsnit ± S. D. værdier; Stjernerne betegne en statistisk signifikant forskel (

P

0,05). (B) Cal-27-celler (10

5) blev behandlet med 10 pM I3M i 24 timer, og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt under anvendelse af Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit. Dataene er præsenteret som middelværdi ± S.D. værdier (n = 3); Stjernerne betegne en statistisk signifikant forskel (

P

0,05) mellem I3M behandling og kontrolgrupper. (C) immunoblotter af proteinekstrakter (30 ug) isoleret fra cytosoliske og mitochondrierne fraktioner af Cal-27-celler behandlet med 0, 2,5, 5 eller 10 uM I3M i 24 timer. De viste resultater er repræsentative for seks uafhængige forsøg.

(A) Cal-27-celler blev behandlet med I3M (0, 2,5, 5 eller 10 uM) i 24 timer. Efter behandling blev cellerne opsamlet, fikseret med methanol, farvet med propidiumiodid, og analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Dataene for hver prøve repræsenterer procentdelen af ​​celler, som findes i G0 /G1, S, og G2 /M-faser af cellecyklus. (C) Immunoblots viser ekspressionen af ​​cellecyklus-relaterede proteiner i I3M-behandlede Cal-27-celler. Totale cellelysater fremstilledes efter 24 timers behandling med I3M (0, 2,5, 5 eller 10 uM). Ekspressionen af ​​p53 og p21 blev bestemt ved anvendelse immunblotting.

β

actin blev anvendt som ladningskontrol i denne undersøgelse. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater.

Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (tidstro qPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy Mini Kit (QIAGEN) . RNA’et blev revers-transkriberet under anvendelse af SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Real-time kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af en LightCycler 480 maskine og SYBR Green I Master Kit (Roche Diagnostics) [27]. Primersekvenserne er anført i tabel S1.

Immunohistokemisk analyse

Vævsprøver blev fikseret i 4% paraformaldehyd (Merck) ved 4 ° C. Efter en kort vask med PBS blev prøverne overført til 30% saccharose i 0,01 M PBS i kryobeskyttelse. Vi pre-inkuberet (2 timer, 25 ° C) 8-um sektioner med 10% hesteserum og 0,3% Triton X-100 i PBS for at forhindre ikke-specifik binding. Snittene blev inkuberet med specifikke primære antistoffer, herunder kanin polyklonalt anti-COX2 (1:200; Abcam), kanin polyklonalt anti-survivin (1:50, Novus Biologicals), og TUNEL (1:100; QIA33 Calbiochem, Merck) til 1 time ved 37 ° C efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C. Sektionerne blev efterfølgende inkuberet (2 timer, 25 ° C) med et biotin-konjugeret sekundært antistof (1:200, Vector) efterfulgt af inkubering med et avidin-peberrodsperoxidase-kompleks (ABC-Elite)

. statistisk analyse

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Alle data er præsenteret som middelværdi ± S.D. værdier. Studerendes

t

-test blev anvendt til at analysere forskelle mellem behandlede og ubehandlede grupper. Dataene blev analyseret ved anvendelse af SPSS 12.0 softwareprogram.

P

-værdier. 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

I3M hæmmer kræft i mundhulen celledeling og inducerer apoptose

Indigo, indirubin, og I3M blev først testet for vækst-inhibition-aktivitet ved hjælp af de mundtlige kræftceller Cal-27 og HSC-3, og 50% hæmmende koncentration (IC

50) værdier for disse tre stoffer blev bestemt efter 24 timer lægemiddelbehandling (tabel S2). I3M var klart mere aktiv sammenlignet med indigo eller indirubin i begge cellelinier. Vi undersøgte derpå antiproliferative virkninger af forskellige koncentrationer af indirubin og I3M på HSC-3 og Cal-27-celler (Fig. 1A). MTT assays viste, at både 5 og 10 uM indirubin havde ingen tydelige antiproliferative virkninger på enten cellelinier efter 48 timers behandling. I modsætning hertil 10 uM I3M fremkaldte signifikante anti-proliferative virkninger på HSC-3-celler efter 48 timer, og begge 5 og 10 uM I3M udøvede anti-proliferative virkninger på Cal-27-celler. De tidlige stadier af apoptose blev kvantificeret ved hjælp af FITC-konjugeret annexin V og analyseret med en Tali ™ Billede Cytometer. I Cal-27-celler, 38,5% af cellerne var positive for annexin V efter 24 timers behandling med I3M (10 uM) sammenlignet med kun 5% af celler i kontrolgruppen (fig. 1B). Efter 24 timer I3M behandling, den dosisafhængige forøgelse af immunoblotting var tydelig i de cytosoliske fraktioner af cytochrom

c

(fig. 1B).

I3M inducerer cellecyklusstandsning stort set på G2 /M fase og øger p53 og p21

WAF1 udtryk

for at bestemme om I3M inducerer Cal-27 cellecyklusstop, vi brugte flowcytometri at analysere, hvordan stigende koncentrationer af I3M påvirke progression af cellecyklus. Behandling med I3M over 24 timer øget andelen af ​​Cal-27-celler, der forbliver i G2 /M-fase på en dosis-afhængig måde. Specifikt procentdelen af ​​G2 /M-fase celler steg fra 36,6% til 53,9% som respons på 10 uM I3M. Desuden har vi noteret en stigning i procentdelen af ​​G0 /G1-fase celler fra 11,4% til 21,4% (Fig. 2A). Det er kendt, at p53 undertrykker tumorvækst via cellecyklusstop eller udløsning apoptose. Derfor brugte vi immunoblotting at afgøre, om I3M behandling modulerer ekspressionsniveauerne af p53. Efter 24-h behandling med forskellige koncentrationer af I3M, Cal-27-celler udviste dosisafhængig stigning i p53-ekspression, med samtidige stigninger i p21

WAF1 proteinekspression samt, tyder på, at en af ​​de mekanismer, hvorved I3M udøver sin anti -proliferative virkninger kunne være medieret af p53 (fig. 2B).

I3M hæmmer kræft celle migration og invasion

For at undersøge, om I3M hæmmer Cal-27 celle invasion, vi udførte en sårheling assay . Som vist i fig. 3A, migration afstande var betydeligt reducerede i celler behandlet med 10 pM I3M sammenlignet med kontrollen og indirubin grupper. Dernæst gennemførte vi en Matrigel Transwell Assay at afgøre, om I3M påvirker også celle invasion. Vi fandt, at en 10-pM dosis af I3M signifikant inhiberede celleinvasion ved både 24 og 48 timer. Vi observerede også lignende resultater ved en lavere I3M dosis (5 uM) efter 48 timers behandling (fig. 3B). For at identificere de specifikke molekyler ramt af I3M, vi udførte immunoblotting analyse for at bestemme ekspressionsniveauerne af flere proteiner involveret i invasion og migration. Niveauerne af FAK, MMP-9, og urokinase-plasminogenaktivator (uPA) var signifikant reduceret efter I3M behandling i 6 timer. Imidlertid I3M inducerede en vedvarende aktivering af fosfor-p38 (fig. 3C). Disse resultater antyder, at ændringer i ekspressionsniveauer af FAK, MMP-9, og uPA spiller en rolle ved inhibering af invasion og migration observeret i I3M-behandlede Cal-27-celler.

(A) Inkubation af celler i fravær eller nærvær af 10 uM indirubin eller I3M blev udført i 0, 24 eller 48 timer. Cellerne blev fotograferet under fase-kontrast mikroskopi (100 × forstørrelse). Dataene er vist som procentdelen af ​​inhibering; Stjernerne viser en statistisk signifikant forskel (

P

0,05) mellem behandlings- og kontrolgrupper. (B) Celler (10

4) blev udpladet i det øvre kammer med I3M (0, 2,5, 5 eller 10 uM) og fik lov til at undergå migration i 24 eller 48 timer. Kvantificering af celler i det nedre kammer blev udført ved at tælle celler under × 200 forstørrelse. Procentdelen af ​​inhibering og kolonne middelværdier blev afledt fra 3 uafhængige eksperimenter. Stjernerne viser en statistisk signifikant forskel (

P

0,05) mellem behandlings- og kontrolgrupper. (C) Immunoblots viser ændringer i niveauerne pp38, FAK, MMP-9 og uPA proteiner forbundet med migration og invasion i Cal-27 celler efter 10-pM I3M behandling (n = 3).

Identifikation af survivin som et mål for I3M

en immunoblotting analyse viste både tids- og dosisafhængig nedregulering af survivin ved I3M (fig. 4A og 4B). Survivin udtryk var signifikant reduceret efter behandling med 10 pM I3M 12-48 t. Real-time qPCR viste også nedregulering af survivin mRNA niveauer i I3M-behandlede celler, hvilket antyder, at I3M undertrykker survivin ekspression på det transskriptionelle niveau (fig. 4C). For at undersøge nedregulering af survivin af I3M have nogen virkning på caspase-3/7 og -9 aktiviteter. Vi målte caspase-3/7 og -9 aktiviteter af 10 pM I3M behandling ved 12, 24 og 48 timer tid-punkt. Resultatet viser meget betydelig forøget i caspase-3/7 og -9 blev påvist aktiviteter efter 12 (94 gange og 131 gange), 24 (388 gange og 282 gange) og 48 timer (462 gange og 314 gange) af I3M eksponering . Således antyder disse data, at I3M ikke kun undertrykker survivin i Cal-27 celler, også påvirker den indre (mitokondrie-caspase-9) vej.

(A) En demonstration af tidsafhængig survivin nedregulering efter 10- pM I3M behandling af forskellige varigheder. Data er præsenteret som gennemsnit ± S. D. værdier (n = 3); Stjernerne viser en statistisk signifikant forskel (

P

0,05) mellem behandlings- og kontrolgrupper. (B) Den dosisafhængige af nedregulering af survivin efter I3M behandling i 12 timer. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± S. D. værdier (n = 3); Stjernerne viser en statistisk signifikant forskel (

P

0,05) mellem behandlings- og kontrolgrupper. (C) Cal-27-celler blev inkuberet med I3M (10 uM) i 0, 6, 12, 24, eller 48 timer. Vist er de relative genekspressionsniveauer for hver prøve i behandlingsgruppen (n = 6). De fede linjer angiver middelværdien forbundne procentdel af de individuelle behandlingsgrupper. T /C: behandlede gruppe (6, 12, 24, eller 48 h) /kontrolgruppe (0 h). (D) En demonstration af tidsafhængige caspase-3/7 og -9 upregulations efter 10-pM I3M behandling for 12, 24, og 48 timer.

I3M undertrykker 4-NQO /arecoline- inducerede oral cancer i mus

Vand forbrug blev rapporteret ugentligt i hver gruppe over 28 uger, blev tidsforløbet (4 uger /tidspunkt) er vist i figur S1. De forbrug blev observeret blandt forsøgsgrupperne. Mus tilbudt vand med 4-NQO (200 ug /ml) og arecolin (500 ug /ml), der forbruges mindre mængde vand før uge 8 (bærer, 10 uM, og 20M grupper) end emnets gruppe. Men den mindste mængde vand ved 20, 24 og 28. uge bæreren gruppen. Efter 8 uger, kropsvægten var lavere i bæreren gruppe mus (fig. 5A). Når 4-NQO og arecolin administrationer blev indstillet og mus fik ledningsvand ved uge 9, både vand indtag og kropsvægt hos mus forøget. Ved uge 12, 16, 20 og 24, var der ingen signifikante forskelle i kropsvægt blandt de fire grupper. I uge 28, kropsvægten var signifikant lavere i luftfartsselskabet end i nogen anden gruppe. Mus behandlet med bærer alene udviste en tidsafhængig stigning i både antallet og størrelsen af ​​deres tunge tumorer. Påfaldende, lokal behandling bestående af 10 eller 20 uM I3M /PVA gel smurt på tunger af musene undertrykt tumorigenese, med højere koncentrationer, der viser større effektivitet (fig. 5B).

(A) I mus eksperimenter kropsvægten blev ikke vist den betydelige forskellige blandt de fire grupper indtil 8. uge. Efter I3M eksperimenter, legemsvægten af ​​bæreren var væsentligt lavere end nogen andre grupper ved 28 th uge (

s

= 0,031, n = 10). (B) Oral cancer læsioner blev induceret på tunger af musene med 0,5 mg /ml arecolin og 0,2 mg /ml 4-NQO. Tabellen viser tumor tal og størrelser fra fire grupper (10 mus /gruppe /sampling).

I3M nedsætter survivin og COX-2-ekspression og samtidig øge andelen af ​​TUNEL-positive celler

in vivo

H & E farvning på forskellige tidspunkter viste, at 4-NOQ /arecolin eksponering øget SCC dannelse i carrier-behandlede mus. I modsætning hertil I3M faldt SCC dannelse efter 28 uger i en dosis-afhængig måde. Immunohistokemisk farvning viste høje niveauer af både COX-2 og survivin i SCC’er i carrier-behandlede mus efter 28 uger. Især I3M forårsagede dosisafhængige fald i survivin og COX-2-ekspression. En TUNEL assay blev udført for at vurdere niveauet af apoptose forekommende

in vivo

. [35].