PLoS ONE: Egr-1 Aktivering af Cancer-Afledte ekstracellulær blærer Fremmer endotelcellemigration via ERK1 /2 og JNK Signaling Pathways

Abstrakt

Forskellige pattedyrsceller, herunder kræftceller, kaste ekstracellulære vesikler (EVS), også kendt som exosomer og mikrovesikler, i omgivende væv. Disse elbiler spiller roller i tumorvækst og metastase ved at fremme angiogenese. Men den detaljerede mekanisme for, hvordan cancer-afledte EVs fremkalde endotelcelleaktivering fortsat ukendt. Her giver vi bevis for, at tidlig vækst respons-1 (Egr-1) aktivering i endotelceller er involveret i den angiogene aktivitet af colorektal cancer celleafledte EVs. Både RNA-interferens-medieret nedregulering af Egr-1 og ERK1 /2 eller JNK-inhibitor væsentligt blokeret EV-medieret Egr-1-aktivering og endothelcellemigration. Desuden lipid tømmerflåde endocytose hæmmer effektivt blokeret endotel Egr-1-aktivering og migration induceret af kræft-afledte elbiler. Vores resultater antyder, at Egr-1-aktivering i endotelceller kan være en central mekanisme er involveret i den angiogene aktivitet af cancer-afledte EVs. Disse resultater vil forbedre vores forståelse vedrørende proangiogene aktiviteter elbiler i forskellige patologiske tilstande, herunder kræft, hjerte-kar-sygdomme, og neurodegenerative sygdomme

Henvisning:. Yoon YJ, Kim DK, Yoon CM, Park J, Kim YK, Roh TY, et al. (2014) Egr-1 Aktivering af Cancer-Derived ekstracellulær Vesikler Fremmer endotelcellemigration via ERK1 /2 og JNK signalveje. PLoS ONE 9 (12): e115170. doi: 10,1371 /journal.pone.0115170

Redaktør: Shilpa J. Buch, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juni 24, 2014, Accepteret: November 19, 2014; Udgivet: 12. december, 2014

Copyright: © 2014 Yoon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Mid-karriere Forsker Program gennem NRF tilskud finansieret af MEST (nr 2014023004), BK21 Plus (10Z20130012243) finansieret af Undervisningsministeriet , Korea, og National Research Foundation Korea (2011 til 0.030.049). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskellige typer af pattedyrceller, såsom cancerceller, makrofager, endothelceller, blodplader, og epitelceller frigiver ekstracellulære vesikler (EVS) i omgivelserne fra plasmaet og endosomale membran rum [1] – [4] . Disse mammale elbiler, også kendt som exosomer og mikrovesikler, er sfæriske dobbeltlagede proteolipids med en gennemsnitlig diameter på 40-250 nm og er beriget med forskellige bioaktive bestanddele, herunder proteiner, lipider og genetisk materiale [1] – [9]. Voksende beviser har afsløret, at elbiler spiller pleiotrope funktioner i intercellulær kommunikation:. Elbiler stimulere recipientceller ved aktivering af en receptor og overførsel af membranproteiner, signalmolekyler, mRNA’er, og miRNA [4] – [9]

elbiler er ofte blevet omtalt som “cellulær støv”, skønt celler kaste elbiler enten konstitutivt eller på reguleret måde [1] – [9]. Endvidere er de proteiner, mRNA’er eller miRNA i EVT afviger i sammensætning afhængigt af tilstandene af donorceller [1], [4]. For nylig afslørede vores gruppe, at proteiner af human colorectal cancer celleafledte EVs er indbyrdes forbundne via fysiske interaktioner og klynge i funktionelle moduler er involveret i EV biogenese og funktion [4], [10]. Endvidere sekretionen af ​​elbiler er en universel cellulær proces forekommer fra simple organismer (Archea eller gramnegative og grampositive bakterier) til komplekse flercellede organismer, hvilket antyder, at denne EV-medieret kommunikation evolutionært er konserveret [9], [11] – [13]. Tilsammen tyder disse resultater på, at elbiler spiller forskellige roller i intercellulære kommunikation [6], [10]. Imidlertid er de patofysiologiske roller elbiler ikke helt forstået.

angiogenese, dannelsen af ​​nye blodkar fra allerede eksisterende kar, er en kompleks og flertrins proces, der involverer vedhæftning, migration, invasion, proliferation og differentiering af endotelceller [14], [15]. Denne neovaskularisering forekommer under forskellige normale og patologiske tilstande [14]. F.eks angiogenese er afgørende for tumorvækst og metastase ved at tilvejebringe oxygen og næringsstoffer til voksende tumor [15]. I tumor mikromiljø, en heterogen population af celler, herunder cancerceller, endotelceller, fibroblaster og immunceller modulerer et gunstigt klima for tumorvækst og invasion [16] – [18]. Disse cancer og stromale celler udskiller vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2), tumornekrosefaktor-α (TNF-α), og IL-6 i det omkringliggende område og disse faktorer bidrager til tumorassocieret angiogenese [16] – [19].

Ud over disse proangiogene opløselige faktorer, de celler, der omfatter tumorvævet udskiller elbiler i det ekstracellulære miljø, og disse skur elbiler spille flere roller i tumorvækst og metastase ved at fremme angiogenese, tumorinvasion, og immun escape [4] – [8], [20] – [23]. Efter den første rapport om de angiogene aktiviteter elbiler afledt af HT1080 human fibrosarkom og DU-145 humane prostata carcinomaceller [5], flere undersøgelser bekræftede, at elbiler er afledt af kræftceller, fibroblaster og cancer stamceller fremmer

in vitro

og

in vivo

angiogenese [4], [8], [24] – [28]. Disse angiogene aktiviteter af elbiler er medieret af vesikulær lipid (r), proteiner, herunder receptorer og tetraspanin proteiner, mRNA, og miRNA. Men den detaljerede mekanisme for, hvordan elbiler fremkalde angiogen aktivitet er ikke blevet grundigt undersøgt.

Tidlig vækstrespons-1 (Egr-1), en umiddelbart tidlig gen og et zinkfinger transkriptionsfaktor, spiller en afgørende rolle i angiogenese [29] – [32]. Foruden serumeksponering, kan Egr-1 hurtigt og forbigående induceret af cytokin, vækstfaktor og miljøbelastninger, herunder hypoxi, fluid forskydningsspænding, og karlæsion [33], [34]. Egr-1 regulerer ekspressionen af ​​proangiogene gener, såsom VEGF, FGF2, og IL-6 i endotelceller eller TNF-α i makrofager [31], [34] – [36]. Inden tumorvævet, kan endotelceller, cancerceller, fibroblaster, og tumor-infiltrerende makrofager udtrykker Egr-1. Endvidere mikrokarrør tætheder i tumorvæv opnået fra Egr-1-deficiente mus er lavere end dem opnået fra vildtypemus [37] og fartøj-lignende struktur dannelse i tumorvæv blev undertrykt af DNAzymer, der er målrettet Egr-1-mRNA [31] , hvilket antyder, at Egr-1 spiller væsentlige roller i tumorvækst og angiogenese. I denne henseende har flere undersøgelser rapporteret, at Egr-1-ekspression i cancerceller, endotelceller og makrofager er relateret til tumorprogression [32], [36] – [38]. Kollektivt, disse resultater tyder på, at Egr-1 spiller en vigtig rolle i tumor-associerede angiogenese og tumor progression.

I denne rapport har vi bevis for, at Egr-1 aktivering i endotelceller bør være en central mekanisme er involveret i angiogene aktivitet af cancer-afledte elbiler. Vi fandt, at Egr-1-aktivering af kolorektal cancer celleafledte elbiler fremmet endotelcellemigration via ERK1 /2 og JNK signalveje og lipidklump endocytose.

Materialer og metoder Salg

Cell kultur

Humant colorektal adenocarcinom (SW480), colorektal carcinom (HCT116), lungeadenocarcinom (A549), og fibrosarkom (HT1080), og normal bronchieepithelceller (BEAS-2B) celler blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. Human neuroblastom (SH-SY5Y) og prostatacarcinom (PC3-celler) blev holdt i MEM (Invitrogen) suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. SW480, HCT116, A549, HT1080, SH-SY5Y, PC3, og BEAS-2B blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1S) blev dyrket i endotelvækstfaktor Medium-2 (EGM-2; Lonza, Walkersville, MD, USA) [5]. Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) blev isoleret fra frisk leveret navlestrenge og opretholdt som tidligere [39] beskrevne. HUVEC’er blev dyrket i medium 199 (Invitrogen) suppleret med 20% FBS, 3 ng /ml FGF2 (R GAPDH omvendt, 5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3 ‘; EGR1 fremad, 5’-CCGCAGAGTCTTTTCCTGAC-3 ‘; EGR1 omvendt, 5’-AGCGGCCAGTATAGGTGATG-3 ‘. HMEC-1s (2 × 10

5 celler) udplades i 6-brønds celle-dyrkningsplade blev behandlet med elbiler (1 ug /ml, 2,0 ml) i 0,5, 1, 1,5, 2 og 4 timer. RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). For real time RT-PCR, blev total RNA (100 ng) amplificeret med en One Step SYBR RT-PCR Kit (Takara Bio, Tokyo, Japan) under anvendelse af en LightCycler 2.0 PCR-system (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Amplifikation blev udført ved at opvarme prøverne til 50 ° C i 2 minutter, derpå ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af gentagne cyklusser ved 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 10 sek og 72 ° C i 10 sek, for i alt 45 cykler. Den sammenlignende Ct metode blev anvendt til relativ kvantificering af target genekspression mod denne af en husholdning gen, GAPDH [40].

Egr-1 nukleare translokation

HMEC-1s blev udsået i 24- såvel celle-dyrkningsplader (Corning Inc.) med dækglas (Fisher Scientific) ved en densitet på 5 x 10

4 celler per brønd og lodes binde natten over. Celler blev behandlet med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml, 0,5 ml), fikseret med 4% paraformaldehyd, og inkuberet med kanin-anti-Egr-1-antistof (Cell Signaling Technology, Hitchin, England) efterfulgt af AlexaFluor488 ged anti kanin-IgG-antistof (Invitrogen). Kerner blev modfarvet med Hoechst (Sigma-Aldrich). Billeder blev visualiseret under en FV1000 Olympus konfokalmikroskop (Olympus) og erhvervet hjælp FV1000-ASW 3.0 software (Olympus). Procentdelen af ​​Egr-1-positive celler blev kvantificeret ved at tælle cellerne med co-lokaliseret fluorescens signaler.

For at undersøge effekten af ​​signalering inhibitorer (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA) eller methyl- β-cyclodextrin (MβCD; Sigma-Aldrich) på Egr-1 nuklear translokation, blev HMEC-1s behandlet med ERK1 /2-inhibitor (PD98059, 20 uM), p38 MAPK inhibitor (SB203580, 10 uM), JNK-inhibitor (SP600125, 20 uM), Akt inhibitor (BML-257, 20 uM), eller MβCD (10 mM) i nærvær eller fravær af SW80-afledte elbiler (1 ug /ml).

RNA-interferens-medieret nedregulering af Egr -1

Lille interfererende RNA (siRNA) i Egr-1 (Bioneer, Daejeon, Sydkorea) til en slutkoncentration på 50 nM blev transficeret ind HMEC-1s ved hjælp Welfect-Q (Welgene, Taegu, Korea). Ikke-nedregulering scrambled siRNA blev anvendt som negativ kontrol. Efter 48 timer blev cellerne anvendt til real-time RT-PCR-analyse for at bestemme niveauet af Egr-1-mRNA-ekspression, Egr-1 translokation assays nukleare og scratch sårhelende assays. SiRNA sekvenser var som følger: scrambled siRNA, 5′-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 ‘; Egr-1 siRNA-1, 5’-CAGUAUCAUCUCCAUCAUA-3 ‘; Egr-1 siRNA-2, 5’-AGUUUGCCAGGAGCGAUGA-3 ‘; Egr-1 siRNA-3, 5’-GUGCAAUUGUGAGGGACAU-3 ‘.

EV uptake

SW480-afledte elbiler blev mærket med Dil (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, SW480-afledte elbiler (100 ug) blev inkuberet med Dil (1 uM) i 15 minutter ved 37 ° C og centrifugeret ved 100.000

g

i 2 timer ved 4 ° C (type 90 Ti rotor med fast vinkel med en K-faktor 126,4). Disse pellets, Dil-mærkede EVs, blev vasket med phosphatbufret saltvand, og efter ultracentrifugering ved 100.000

g

i 2 timer ved 4 ° C (type 90 Ti rotor med fast vinkel med en K-faktor 126,4), blev resuspenderet i phosphatbufret saltvand. HMEC-1s blev forbehandlet uden eller MβCD (10 mM) i 0,5 time og derefter inkuberet med Dil-mærkede SW480-afledte elbiler (1 ug /ml, 0,5 ml) i 1 time. Celler blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd og kerner blev farvet med Hoechst (Sigma-Aldrich). Billeder blev visualiseret under en FV1000 Olympus konfokalmikroskop (Olympus) og erhvervet hjælp FV1000-ASW 3.0 software (Olympus).

statistiske analyser

Alle værdier er angivet som middelværdi ± standardafvigelse

P

værdier blev beregnet ud fra envejs eller tovejs variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni korrektion, baseret på sammenligninger med de relevante kontrol- testet på samme tid prøver.

Resultater

SW480-afledte elbiler fremmer

in vivo

in vitro

angiogenese

elbiler frigivet af SW480-celler blev oprenset fra kultursupernatanter ved en kombination af differential centrifugering , ultrafiltrering under anvendelse af en 100-kDa hulfibermembran, ultracentrifugering på saccharose puder, og iodixanol densitetsgradienter som rapporteret [8]. I overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [8], de oprensede elbiler havde en densitet på ~1.098 g /mL og nærede CD81 og CD63, EV markørproteiner (fig. 1A). Men disse oprensede elbiler ikke indeholde GM130 (en

cis

-Golgi protein) og cytochrom

c

(en mitokondrie protein, der findes i apoptotiske legemer): Disse to proteiner er velkendte ikke- vesikulære proteiner (fig. 1B). Vi først viste, at elbiler er afledt af SW480 humane kolorektal adenocarcinom celler induceret

in vivo

neovaskularisering (Fig. 1C og 1D). Når SW480-afledte EVs inden Matrigel blev injiceret subkutant i mus, var en massiv dannelse af CD31-positive fartøj-lignende strukturer observeret (fig. 1C). I modsætning hertil blev der ingen tilsyneladende kardannelse detekteret i Matrigel uden elbiler. EVT signifikant inducerede en 10,4-fold forøgelse i CD31-positive område i Matrigel sammenlignet med den ubehandlede kontrol (fig. 1D).

(A, B) elbiler frigivet af SW480-celler blev oprenset fra kultursupernatanter af en kombination af differentialcentrifugering, ultracentrifugering på saccharose puder, og iodixanol densitetsgradienter. Hver fraktion af iodixanol densitetsgradienter blev analyseret ved Western blotting til at opdage CD81 og CD63, markørproteiner af elbiler (A). De rensede elbiler i fraktion 3 blev analyseret ved Western blotting til at opdage ikke-EV markørproteiner (GM130 og cytochrom

c

). SW480-afledte helcellelysat (WCL; 10 ug) og SW480-afledte elbiler (EVS; 10 ug) blev fyldt til Western blotting-analyse (B). (C, D) Matrigel i nærvær eller fravær af SW480-afledte elbiler (20 ug) blev injiceret subkutant i C57BL /6-mus. Efter 7 dage, hel-mount farvning af Matrigel med anti-CD31-antistof blev udført (n = 5). Repræsentative konfokale Z-stack fotografier af hele underlag farvet for CD31 (grøn) er vist i panel C. Scale søjler repræsenterer 100 um. Fluorescensintensiteter af CD31-farvning af Z-stakken planet af Matrigel blev målt som beskrevet i fremgangsmåderne (D). (E) vandrende aktivitet af SW480-afledte elbiler blev bedømt ved en ridse sårheling assay. Konfluente HMEC-1s blev ridset og behandlet med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml); så antallet af migrerede celler i det blottede område blev evalueret efter 12 timer (n = 3). (F) proliferative aktivitet af SW480-afledte elbiler (1 ug /ml) blev vurderet ved at vurdere mitose markør PH3. Efter 24 timer blev den PH3 og kerner farvet med anti-PH3 antistof og Hoechst, henholdsvis og evalueret af konfokal mikroskopi. Procentdelen af ​​PH3-positive celler i HMEC-1s blev kvantificeret ved tælling af cellerne med co-lokaliserede fluorescenssignaler (n = 3). Som en positiv kontrol blev HMEC-1s behandlet med EGM-2 medium suppleret med forskellige angiogene faktorer såsom EGF, FGF2, VEGF, og IGF1. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001; N. S., ikke signifikant.

Vi næste undersøgt proangiogen aktivitet af SW480-afledte elbiler på humane endotelceller, HMEC-1s

in vitro

. Scratch sårhelende assays viste, at elbiler inducerede en 4,1-fold stigning i antallet af migrerede endotelceller i det blottede område sammenlignet med den ubehandlede kontrol (fig. 1E). Endvidere elbiler stimulerede proliferationen af ​​endotelceller: procentdelen af ​​PH3-positive celler steg 8,9 gange i forhold til den for de ikke-stimulerede celler (Fig 1F.). Den positive kontrol, EGM-2 suppleret med forskellige angiogene faktorer såsom EGF, FGF2, VEGF, og IGF1, inducerede også både endothelcellemigration og proliferation. De vandrende og proliferative aktiviteter af SW480-afledte elbiler blev også observeret i andre endotelceller, HUVEC’er (data ikke vist). Derfor er vores data viser, at SW480-afledte elbiler har

in vivo

in vitro

angiogene aktiviteter.

SW480-afledte elbiler inducerer Egr-1 aktivering i endotelceller

Egr-1 spiller en afgørende rolle i tumorassocieret angiogenese [29] – [32]. Vi undersøgte således muligheden for aktivering af endotel Egr-1 ved SW480-afledte EVs (fig. 2). Real time RT-PCR-analyser afslørede, at behandling med SW480-afledte elbiler forårsagede hurtig og transient stigning af Egr-1-ekspression på det transskriptionelle niveau i humane endotelceller, HMEC-1S og HUVEC’er (fig. 2A). Vi anvendte HMEC-1s i de følgende forsøg. Desuden elbiler fra andre humane cancerceller (HCT116 colorektalt carcinom, A549 lunge adenocarcinom, HT1080 fibrosarcoma, PC3 prostatacarcinom og SH-SY5Y neuroblastom) også inducerede Egr-1 mRNA-ekspression i humane endotelceller, EVT fra normale humane bronchiale epithelceller (BEAS-2B) ikke (fig. 2B). Vi yderligere undersøgt Egr-1 aktivering efter stimulering af SW480-afledte elbiler. Elbiler inducerede hurtig og kortvarig ekspression og nuklear translokation af Egr-1 protein i HMEC-1s; den maksimale virkning blev observeret ved 1 time efter EV behandling (fig. 2C og 2D). Tilsammen cancer-afledte elbiler inducerer Egr-1-aktivering ved at øge dets ekspression og nuklear translokation i endotelceller. Disse iagttagelser antyder, at Egr-1-aktivering kan være kritisk til modulering EV-induceret angiogenese.

(A) HMEC-1s og HUVEC’er blev inkuberet med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml) eller ubehandlet kontrol. mRNA blev isoleret fra ubehandlede kontrolceller eller celler behandlet med elbiler i 0, 0,5, 1, 2 og 4 timer og analyseret ved hjælp af real time RT-PCR (n = 3). Værdier repræsenterer Egr-1-mRNA /GAPDH mRNA normaliseret til ubehandlede kontrolceller. (B) HMEC-1s blev behandlet med elbiler (1 pg /ml) afledt af HCT116 colorektalt carcinom, A549 lungeadenocarcinom, HT1080 fibrosarcoma, PC3 prostatacarcinom, SH-SY5Y neuroblastom, og BEAS-2B normale bronchiale epitelceller i 0,5 timer ( n = 3). (C, D) I HMEC-1S, nuklear translokation af Egr-1-protein efter stimulering med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml) i 0,5, 1, 2, og 4 timer blev analyseret under konfokal mikroskopi (n = 3) . Kerner og Egr-1-proteiner blev farvet med Hoechst (blå) og anti-Egr-1-antistof (rød), hhv. Co-lokaliserede fluorescenssignaler (lilla) angiver translokationen af ​​Egr-1 ind i kernen. Repræsentative fotografier vist i panel C. Scale søjler repræsenterer 30 um. Procentdelen af ​​Egr-1-positive kerner blev bestemt ved at måle antallet af celler med nucleus colocalized signaler via den af ​​totale celler (D). Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. *

P

0,05; **

P

0,01; **

P

0,001; ns, ikke signifikant.

Egr-1 siRNA dæmper endotelcellemigration induceret af SW480-afledte elbiler

Vi næste undersøgte rolle Egr-1 i EV-induceret endotel migration celle hjælp siRNA. Når vi undersøgte tre Egr-1 siRNAs, fandt vi, at Egr-1 siRNA-1 mest effektivt reducerede Egr-1-mRNA-niveau i endotelceller men scrambled siRNA ikke vist denne inhiberende virkning (fig. 3A). Endotelceller behandlet med Egr-1 siRNA-1 effektivt blokeret EV-induceret Egr-1-aktivering (fig. 3B) og migration som observeret i scratch sårhelende assays (fig. 3C og 3D), mens scrambled siRNA viste ikke disse inhiberende virkninger . Således er vores resultater viste, at EV-induceret udtryk og nuklear translokation af Egr-1 i endotelceller bør bidrage til EV-induceret endothelcellemigration.

(A) HMEC-1s blev transficeret med 50 nM scrambled siRNA eller Egr-1 siRNA-1, Egr-1 siRNA-2, eller Egr-1 siRNA-3. mRNA’er blev isoleret fra cellerne efter 48 timer og niveauet af Egr-1-mRNA blev analyseret ved anvendelse real time RT-PCR (n = 3). (B) Nuklear translokation af Egr-1-protein efter stimulering med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml) i 1 time blev analyseret i scrambled siRNA (50 nM) eller Egr-1 siRNA-1 (50 nM) transficerede HMEC-1s (n = 3). (C, D) Konfluente HMEC-1s transficeret med scrambled siRNA (50 nM) eller Egr-1 siRNA-1 (50 nM) blev ridset og behandlet med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml); så antallet af migrerede celler i det blottede område blev evalueret efter 12 timer (n = 3). Antallet af migrerede celler i det blottede område af hver gruppe er vist i panel D. Scale bjælker repræsenterer 100 um. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001; ns, ikke signifikant.

ERK1 /2-og JNK signalveje er involveret i EV-induceret Egr-1-aktivering og migration i endotelceller

Vi næste undersøgt signalveje involveret i EV-medieret Egr-1-aktivering. ERK1 /2-inhibitor (PD98059) og JNK-inhibitor (SP600125) næsten fuldstændig undertrykt Egr-1 nuklear translokation i endotelceller efter stimulering med SW480-afledte EVs, men p38 MAPK inhibitor (SB203580) og Akt inhibitor (BML-257) havde ingen virkning (fig. 4A og 4B). Desuden har vi observeret, at PD98059 og SP600125 behandlinger næsten helt blokeret EV-induceret endotelcellemigration mens disse inhibitorer viste ingen tilsyneladende virkning på den basale migrering af endotelceller (fig. 4c og 4d). Desuden PD98059 eller SP600125 hæmmede næsten fuldstændigt de

in vivo

angiogene aktiviteter af SW480-afledte elbiler (fig. 4E og 4F). Alle disse observationer indikerede, at ERK1 /2-og JNK signalveje er afgørende for Egr-1-aktivering, endotelcellemigration og

in vivo

angiogenese. Salg

(a, b) HMEC-1s blev forbehandlet med signalering inhibitorer i 1 time og derefter stimuleret i 1 time med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml). Nuklear translokation af Egr-1-protein blev analyseret under anvendelse af konfokal mikroskopi (n = 3). Kerner og Egr-1-proteiner blev farvet med Hoechst (blå) og anti-Egr-1-antistof (rød), hhv. Co-lokaliserede fluorescenssignaler (lilla) angiver translokationen af ​​Egr-1 ind i kernen. Repræsentative fotografier er vist i panel A. Procentdelen af ​​Egr-1-positive kerner blev bestemt ved at måle antallet af celler med nucleus colocalized signaler via totale celler (B). (C, D) Sammenflydende HMEC-1s blev ridset og behandlet med SW480-afledte elbiler (1 ug /ml) i nærvær eller fravær af signalering inhibitorer; så antallet af migrerede celler i det blottede område blev evalueret efter 12 timer (n = 3). Repræsentative fotografier af konfokal mikroskopiske billeddannelse er vist i panel C, og antallet af migrerede celler i det blottede område af hver gruppe er vist i panel D. ERK1 /2-inhibitor, PD98059 (20 uM); p38 MAPK inhibitor, SB203580 (10 uM); JNK-inhibitor, SP600125 (20 uM); Akt inhibitor, BML-257 (20 uM). (E, F) C57BL /6-mus blev subkutant injiceret med Matrigel indeholdende SW480-afledte elbiler (20 ug) med PD98059 (20 uM) eller SP600125 (20 uM). Efter 7 dage, hel-mount farvning af Matrigel med anti-CD31-antistof blev udført (n = 5). Repræsentative konfokale Z-stack fotografier af hele underlag farvet for CD31 (grøn) er vist i panel E. Fluorescensintensiteter af CD31 i Z-stack planet af Matrigel blev målt som beskrevet i fremgangsmåderne (F). Scale barer i panel A, C og E udgør 30, 100 og 100 um, henholdsvis. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. ***

P

. 0,001

Endocytose inhibitor hæmmer Egr-1-aktivering og endothelcellemigration induceret af SW480-afledte elbiler

Som en potentiel involvering lipid raft endocytose i EV optagelse [41], [42], undersøgte vi rolle lipidklumper i EV optagelse af endotelceller. Dil-mærkede EV optagelse blev signifikant inhiberet efter behandling med MβCD (10 mM) (fig. 5A). EV-induceret endotelcellemigration i blottede zone blev fuldstændig blokeret af MβCD behandling (fig. 5B). Desuden endotelceller behandlet med MβCD blokerede fuldstændigt EV-induceret Egr-1-aktivering (fig. 5C og 5D).