PLoS ONE: Identifikation af varianter i Primary og tilbagevendende glioblastoma Ved hjælp af en kræft-specifikt gen Panel og Whole Exome Sequencing

Abstrakt

glioblastoma (GBM) er en aggressiv, ondartet hjernesvulst typisk resulterer i patientens død inden for et år efter diagnosen; og dem, der overlever ud over dette punkt normalt til stede med tumor tilbagefald inden for to år (5-års overlevelsen er 5%). Den genetiske heterogenitet GBM har gjort den molekylære karakterisering af disse tumorer et område af stor interesse og har ført til identifikation af molekylære undertyper i GBM. Tilgængeligheden af ​​sekventering platforme, der er både hurtig og økonomisk kan fremme vedtagelsen af ​​tumor sekventering i det kliniske miljø, der kan føre til identifikation af klinisk handlingsrettede genetiske mål. I denne pilotundersøgelse, der består af triplet prøver af normalt blod, primær tumor, og tilbagevendende tumor prøver fra tre patienter; vi sammenlignet evne Illumina hele exome sekventering (ExomeSeq) og Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (CCP) for at identificere somatiske varianter i patient-parret primære og tilbagevendende tumor prøver. Tretten gener viste sig at havnen varianter, hvoraf størstedelen var eksklusivt til de ExomeSeq data. Overraskende blev kun to varianter identificeret af begge platforme og de blev placeret i

PTCH1

og

NF1

gener. Selvom foreløbig karakter, dette værk fremhæver store forskelle i variant identifikation i data fra de to platforme. Yderligere undersøgelser med større prøvestørrelserne behov for yderligere at udforske forskellene mellem disse teknologier og øge vores forståelse af den kliniske anvendelighed af panel baserede platforme i genomisk profilering af hjernetumorer

Henvisning:. Virk SM, Gibson RM, quinoner-Mateu ME, Barnholtz-Sloan JS (2015) Identifikation af varianter i Primary og tilbagevendende glioblastoma Ved hjælp af en kræft-specifikt gen Panel og Whole Exome Sequencing. PLoS ONE 10 (5): e0124178. doi: 10,1371 /journal.pone.0124178

Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: Februar 7, 2015; Accepteret: 19 februar 2015; Udgivet: 7. maj 2015

Copyright: © 2015 Virk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Illumina hele exome sekventering data er tilgængelige fra The Cancer Genome Atlas: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga. TCGA id’er, der anvendes i denne analyse var: TCGA-0957 (UH1), TCGA-1389 (UH2), TCGA-4065 (UH3). For at sikre overholdelse af retningslinjer for beskyttelse af data fra mennesker, Ion AmpliSeq data er tilgængelige fra forfatterne på anmodning og fra The Ohio Brain Tumor Neuro-onkologiske sygdomme holdleder Dr. Andrew Sloan: [email protected] .

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (www.nih.gov) 5R25CA094186 SMV, National Institutes of Health HHSN261201000057C og NIH /NCI 2P30 CA043703-23 ​​JSB

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma (GBM) er den hyppigst forekommende primære hjernetumor hos voksne [1].. Selvom betragtes som en sjælden kræft, med en incidensrate på 2 til 3 tilfælde pr 100.000 mennesker i USA, denne tumor bidrager uforholdsmæssigt til kræft sygelighed og dødelighed [1, 2]. Aktuel standardbehandling for GBM patienter er kirurgisk resektion af primær tumor efterfulgt af adjuverende strålebehandling og kemoterapi (dvs. “Stupp” protokol) [3]; Men på trods af aggressiv behandling, GBM går igen i mange patienter inden for to år [4]. På grund af denne høje sandsynligheden for fornyet, er det bydende nødvendigt, at vi får en bedre forståelse af de genetiske og molekylære forandringer, der sker efter primær tumor resektion og behandling. Denne information kan være afgørende for udviklingen af ​​nye behandlinger med potentiale til at øge overlevelsen af ​​GBM patienter.

De genetiske forskelle mellem primære og tilbagevendende tumorer er endnu ikke fuldt karakteriseret, som har begrænset udviklingen af ​​en effektiv målrettet behandlingsformer til at bekæmpe tilbagevendende GBM [5]. Mutationer i specifikke gener er blevet vist at være fremherskende i GBM sager [6, 7]. På grund af kendte inter- og intra- individuelle heterogenitet i GBM [8, 9], er der gjort en betydelig indsats for at ikke kun identificere individuelt muterede gener, men at udvikle klassifikationssystemer at karakterisere tumorer ved molekylær undertype [10, 11]. Det endelige mål er at bruge tumor klassificering som en molekylær diagnostisk redskab eller en prognostisk indikator for samlet overlevelse, i sidste ende fører til opdagelsen af ​​nye behandlingsstrategier.

Deep (næste generation) sekventering revolutionerer vores forståelse af somatiske ændringer forekommende i cancer-genomet. Undersøgelser der sammenligner flere tumortyper er at kaste lys over både forholdet mellem genetiske mutationer og kræft type, samt dysreguleret veje, der er fælles på tværs af kræft eller specifikke for delmængde af cancertyper [12-14]. Selvom Illumina (Illumina, San Diego, CA) dyb sekventering platform er den nuværende leder i klinisk kræftforskning [15], andre teknologier såsom Ion Torrent (Life Technologies, Carlsbad, CA) [16] er egnede til bredere screeningsmetoder baseret på reduceret sekventering tid og omkostninger per prøve [17]. I denne undersøgelse evaluerede vi evnen af ​​Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Life Technologies, Carlsbad, CA) for at identificere varianter i tredobbelte prøver (matchede blod, primære og tilbagevendende tumorer) fra tre GBM patienter og sammenlignet resultaterne til hele exome sekventering data opnået ved hjælp af Illumina platformen fra Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet [18].

Materialer og Metoder

Undersøgelse patienter og prøve behandling

GBM patienter blev prospektivt ansat som del af den igangværende Ohio Brain tumor Study (OBTS), et prospektivt studie af primære benigne og maligne hjerne tumor patienter fra de fire store akademiske centre i staten Ohio. Skriftligt samtykke blev modtaget fra alle patienter i løbet af deres tilmelding til OBTS, som fandt sted inden prøvetagning. Alle mennesker protokoller og procedurer blev godkendt af Institutional Review Board ved University Hospitals Case Medical Center, Cleveland, Ohio. Forbehandling blodprøver sammen med primære og tilbagevendende lynfrosset tumorvæv (triplet prøver) blev indsamlet fra tre voksne patienter. Figur 1 giver et overblik over procedurer, der anvendes i denne undersøgelse. Væv blev nedfrosset inden for 15 til 30 minutter efter resektion. Prøver og kliniske oplysninger blev indsamlet og arkiveret i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af The Cancer Genome Atlas [18] og tumor renhed blev åbnet af histologiske gennemgang af bord certificeret neuropathologist. To snit blev taget fra hver patientprøve (3 prøver /patient X2) og en samling af triplet prøver fra alle tre patienter blev sekventeret på hver af de to sekventering platforme.

Sekventering for AmpliSeq CCP prøverne blev gjort ved hjælp af Ion 318 Chip og hele exome sekventering blev præfabrikerede hjælp af Genome Analyzer II eller HiSeq 2000, begge fra Illumina.

Blod blev trukket ind PAXgene DNA-rør og DNA ekstraheret ved hjælp PAXgene Blood DNA (Qiagen , Valencia, CA). Totalt DNA blev isoleret fra lynfrosset hjerne tumorprøver ved hjælp af Maxwell 16 DNA Purification kit (Promega, Madison, WI). DNA blev kvantificeret ved anvendelse NanoDrop ND-100 (Thermo Scientific, Waltham, MA) og qubit’en 2,0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). Patient-parret triplet DNA-prøver fra tre patienter blev sekventeret ved brug (i) hele exome sekventering på Illumina GA-IIX eller HiSeq 2000 [ExomeSeq] (figur 1) som en del af The Cancer Genome Atlas-projektet, som beskrevet i [18] og ( ii) Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Ion AmpliSeq CCP, Life Technologies). Til dette blev fire amplicon pools per prøve, der dækker 409 gener impliceret i kræft kvantificeret (2100 Bioanalyzer DNA 7500, Agilent Technologies), tilberedt og beriget for sekventering på Ion Sphere Partikler (ISP’er) ved hjælp af Ion OneTouch 200 Skabelon Kit v2 (Life Technologies ) i Ion OneTouch ™ 2 System (Life Technologies). Templatede internetudbydere blev kvantificeret (qubit’en 2.0, Life Technologies) og indlæses i en ion 318 chip (Life Technologies), der skal sekventeres på Ion PGM hjælp af Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (Life Technologies). Den gennemsnitlige belastningseffektivitet i Ion Torrent PGM var 88% i alle ni Ion 318 chips med et gennemsnit på 5,9 millioner læser per prøve. Individuelle prøver gennemsnit over 5,8 mio kortlagt sekvens læser, med en gennemsnitlig læse længde på 109 basepar. Den gennemsnitlige mål dækning i Ion Torrent PGM var 315x og 377x for blod og tumor prøver hhv. I tilfælde af TCGA Illumina hele exome sekventering, den gennemsnitlige target dækning var 121x og 138X for blod- og tumorprøver hhv. Signalbehandling og base kald af sekvens data genereret fra Ion Torrent PGM blev udført med Torrent Analyse Suite-version 3.4.2. Høj kvalitet læser (en kvalitet score 20) fra FASTQ filer genereret fra Ion Torrent PGM Server blev trimmet af adapter, stregkode, og primersekvenser forudgående tilpasning til det humane genom samlingen 19 (Hg19) sekvens

Databehandling og Variant Identifikation

Før variant analysen blev FASTQ filer genereret fra begge platforme udsat for flere forbehandlingstrin. FASTQ filer blev tilpasset til det menneskelige genom reference Consortium bygge 37 (Hg19) ved hjælp af Burroughs-Wheeler Alignment algoritme som implementeret i BWA softwarepakken v.0.7.2, hvilket resulterer i produktionen af ​​BAM filer af justeret læser. Efter genom justering blev Genome Analysis Toolkit v.3.2.2 bruges til at justere læser omkring indsættelse /sletninger og kalibrere basis kvalitetsresultater for både ExomeSeq og AmpliSeq data. Den ExomeSeq læser blev udsat for duplikere mærkning og fjernelse før omlægningen og base rekalibrering trin. BAM-filer blev sorteret i koordinere orden og BAM indeksfiler blev genereret ved hjælp af Picard v.1.119. Variant kald blev udført i aligned læser parret af patientprøver, dvs, blod (normal) versus primær eller tilbagevendende tumor væv, ved hjælp MuTect v.1.1.4 [19] sammen med DbSNP 138. Varianter blev kommenteret med ANNOVAR v.111214 (http : //www.openbioinformatics.org/annovar/) og læs alignments blev visualiseret ved hjælp IGV v2.3.2 (https://www.broadinstitute.org/igv/). Variant analyse var begrænset til varianter forekommer i exome regioner.

Resultater

Patientdemografi og behandling

Blandt de tre patienter indgår denne undersøgelse, den gennemsnitlige alder var 45 år, og gennemsnitlige samlede overlevelse var 441 dage (tabel 1). Alle undtagen én patient var mandlige og alle var hvid (én patient også selv identificeret som Hispanic). Hver patient fik den samme behandling, som bestod af total resektion efterfulgt af adjuverende temozolomid og ekstern strålebehandling. Desuden alle patienter undergik en anden operation på tilbagefald. Renhed af primære tumorprøver var større end i tilbagevendende tumorprøver, der spænder fra 80-90% til 65-75% (tabel 1).

Varianter identificeret ved både ExomeSeq og AmpliSeq CCP

Da hele exome sekventering teknologier har kapacitet til at dække alle kodende gener i genomet, hvorimod enhver panel tilgang vil være begrænset til en delmængde af kodning genomet, for at gøre den mest hensigtsmæssige sammenligning mellem de to teknologier, vi begrænsede vores analyse til de 409 gener indgår i AmpliSeq panelet. Eftersom vi var mest interesseret i varianter indenfor kodende regioner, vi også fokus på analyse af varianter inden kun exons. Varianter blev identificeret i 13 (3%) af de 409 gener analyseret i denne undersøgelse. De fleste varianter blev fundet i ExomeSeq data og kun to genvarianter blev delt mellem de to platforme (Fig 2).

Gener indeholder varianter og de tilhørende sekventering platforme vist. De fleste varianter var forbundet med ExomeSeq data, og der var i alt 409 gener på AmpliSeq CCP.

Varianterne fundet af begge platforme var i generne

PTCH1

(patched 1) og

NF1

(neurofibromin 1). Detaljeret analyse af

PTCH1

variant afslørede tilsvarende dækning af det muterede base (Fig 3A) i både AmpliSeq og ExomeSeq data på 26 og 24 lyder henholdsvis; og AmpliSeq panelet havde en lavere procentdel (23% mod 38%) af læser indeholdende den alternative base. Den anden delte variant blev fundet i

NF1

gen (Fig 3B) og i dette tilfælde de to platforme afveg meget i form af læsning dækning af det muterede base. I ExomeSeq data, var der 38 læser dækker variant base og 18 (47%) indeholdt varianten; henviser 360 læser i AmpliSeq data omfattede base og 20% ​​(71 læser) indeholdt varianten.

NF1

var også en af ​​de fire varianter identificeret i en tilbagevendende tumor prøve

(A) Udsigt viste spændvidder chr9:. 98,209,620-98,209,640 af

PTCH1

; variant base er G til A mutation placeret i bunden 98.209.634 i primær tumor i patientens UH1. (B) Se viste spændvidder CHR17: 29,585,500-29,585,530 af

NF1

; variant er G til A mutation placeret i bunden 29.585.518 i tilbagevendende tumor i patientens UH3. Varianten base ligger mellem de to lodrette linjer krydser læser.

Varianter identificeret ved ExomeSeq men ikke af AmpliSeq CCP

Der var i alt 10 varianter i otte gener angiveligt inkluderet i AmpliSeq CCP, der kun blev identificeret af ExomeSeq tilgang. To af disse gener var

PTEN

(fosfatase og tensin homolog) og

TP53

(tumor protein p53), som begge blev fundet i de primære og tilbagevendende tumorer i patientens UH3. Begge disse gener ofte muteret i GBM og mange andre cancerformer. I den primære tumor, exon indeholder det muterede base i

PTEN

var bredt dækket af ExomeSeq læser og det muterede base blev dækket af 26 læser, 65% af som indeholdt varianten; imidlertid blev den samme exon kun delvist dækket af læser fra det AmpliSeq CCP (Fig 4A) hvoraf ingen dækkede muterede base. Ligeledes kan en mutation i

TP53

genet blev dækket af 98 ExomeSeq læser, 53% indeholdt varianten base, mens ingen AmpliSeq CCP læser dækket denne region af exon (fig 4B). Analyse af læse- dækning af

PTEN

TP53

i tilbagevendende tumor patient UH3 fundet en stigning i antallet af læser dækker variant base i forhold til den primære tumor for begge gener ved 68 og 121, henholdsvis. Med hensyn til den andel af læser dækker base, der blev også muteret, var der en reduktion for

PTEN

til 40% og for

TP53

andelen var næsten det samme som i primær tumor ved 54%. Desuden er AmpliSeq data for tilbagevendende tumor produceret en enkelt læser, der dækker den muterede base i

TP53

dette læste også indeholdt varianten.

De AmpliSeq data ikke producerer nogen læser dækker variant base i

PTEN

; Men en enkelt læser ikke vist i grafikken gjorde dække varianten base i

TP53

i tilbagevendende tumor. Data fra primære tumorer er vist. (A) Udsigt viste spændvidder CHR10: 89,653,700-89,653,900 af

PTEN

; variant er T til G-mutation placeret ved base 89.653.783. (B) Udsigt over

TP53

viser region CHR17: 7,578,400-7,578,600; variant er G til A mutation placeret ved base 7.578.475. Placeringen af ​​varianten basen med den lodrette linje krydser læser.

PIK3CG

(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat 3-kinase, katalytisk subunit gamma) gen blev den eneste genet findes at være muteret i mere end én patient, specifikt dette gen indeholdt to forskellige varianter og en af ​​hver var til stede i de primære tumorer i både uh1n og UH3 individer (tabel 2). Interessant nok blev to varianter identificeret i

LLP

(LIM domæne indeholdende foretrukne translokation partner i lipoma) genet, både i den primære tumor fra patient UH2 (tabel 2). Disse to varianter blev placeret i tilstødende baser. Undersøgelse af alle AmpliSeq CCP gener, der indeholdt varianter kun i ExomeSeq data afslørede

LLP

gen at have den største dækning med 1388 og 1403 lyder som dækker den første og anden variant, hhv. I begge tilfælde læser 80% af den var muteret.

Varianter udelukkende identificeret ved AmpliSeq CCP

I modsætning til de varianter er unikke for de ExomeSeq data, tre varianter i tre forskellige gener blev identificeret ved AmpliSeq CCP, men ikke af hele exome sekventering (fig 2 og tabel 2). Alle tre varianter blev fundet i primære tumorer i to patienter (UH1 UH2), specifikt i

DPYD

(dihydropyrimidindehydrogenase),

MCL1 Hotel (v-myc myelocytomatosis viral onkogen homolog 1, lungecarcinom afledt [avian]), og

TNK2

(tyrosinkinase, ikke-receptoren, 2) gener. Ingen af ​​de tre varianter unikke for AmpliSeq CCP blev betegnet som “dækket” af MuTect software, hvilket indikerer mindre end 80% magt til at opdage disse varianter på 0,3 allel fraktion.

Diskussion

Deep sekventering metoder har revolutioneret mange biologiske og biomedicinske områder med kræft, især diagnostik og behandlingsstrategier, er en af ​​de mest påvirket [20, 21]. Stor indsats er blevet placeret på sekventering hele genomer eller hele exomes at identificere kritiske cancer-associerede mutationer, der kunne drive personlige og målrettede behandlinger [22]. Desværre, selv om adgang til dybe sekventering teknologi er steget betydeligt i de seneste par år, fortsat relativt høje omkostninger ved sekventering og kompleksiteten af ​​analysen har foranlediget udviklingen af ​​mere overkommelige instrumenter og metoder, sammen med en forenkling af antallet af gener til analyseres. Den Ion AmpliSeq CCP blev udviklet for at sekventere all-exon dækning af 409 gener impliceret i kræft, altså over 50% af Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Gene Census (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/census ). I denne pilotundersøgelse brugte vi AmpliSeq CCP til sekvens matchede blod, primær og recidiverende tumorer fra tre GBM patienter og sammenlignede resultaterne til hele exome sekventering data opnået ved hjælp af Illumina platformen fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) projekt.

Samlet set blev der få gener sig at indeholde varianter i denne undersøgelse (13 gener), og blandt dem, blev kun to varianter i fællesskab identificeret ved de to sekventering tilgange (ExomeSeq og AmpliSeq CCP). En variant i

PTCH1

genet blev identificeret i den primære tumor fra patient UH1. Denne tumorsuppressorgen funktioner i Hedgehog signalvejen og har været show skal muteret i pædiatrisk medulloblastom [23]. Den anden variant var i genet

NF1

(også en tumor suppressor), som koder for neurofibromin 1-protein og er en hyppigt muteret gen i GBM [18]. Disse to varianter var de eneste to der er omfattet af MuTect software, der effektivt gør

PTCH1

NF1

de mest pålideligt identificerede varianter i AmpliSeq CCP data.

Der var også lidt overlapning af varianter mellem individuelle patient og tumortyper. Det eneste gen identificeret som variant i mere end én patient var

PIK3CG

, der var muteret i primære tumorer fra patienter UH1 UH3. Dette gen indeholdt forskellige varianter i de to tumorer og var kun til stede i ExomeSeq data. Generne

PTEN

TP53

indeholdt de eneste genvarianter identificeret i både den primære og tilbagevendende tumorer i den samme patient, UH3. Selvom begge gener er blandt de hyppigt muteret i GBM, disse varianter var også eksklusivt til ExomeSeq data. Yderligere inspektion af opstillingerne ved de variante baser afslørede kun delvis dækning af varianten indeholdende exonerne af AmpliSeq læser, som er en sandsynlig bidragyder til varianten ikke detekteres af dette panel.

Det var forventet, at der ville være forskelle i de varianter, identificeret fra ExomeSeq og AmpliSeq CCP data. I et forsøg på at begrænse disse forskelle, vi begrænset analysen til kun at omfatte gener, der var på gen liste over AmpliSeq CCP. De forskellige teknologiske tilgange sekventere et helt exome versus sekventering en fokuseret delmængde af kræftrelaterede gener, kan sandsynligvis resultere i at finde færre muterede gener ved hjælp af mere fokuseret tilgang, som observeret i denne undersøgelse. Et andet punkt at være opmærksomme på, er, at intratumoral heterogenitet er karakteristisk for mange kræftformer, herunder GBM. Analysen rapporteret her blev udført ved hjælp af to forskellige udskæringer fra hver patient tumor og vores observerede uoverensstemmelser i variant identifikation kunne følge af den iboende intratumoral heterogenitet i GBM.

Denne analyse dokumenterer, at generne

PTCH1

NF1

kan detekteres pålideligt i patientprøver, og at manglen på bred exon dækning kan påvirke variant påvisning i disse regioner. Generne indgår i AmpliSeq CCP blev udvalgt til at være repræsentative for et bredt udvalg af cancertyper og gen-paneler mere specifikke for hjerne og hjernetumorer kan forbedre variant opdagelse i GBM. Selv om et par undersøgelser har evalueret brugen dybe sekventering-baserede paneler til hurtig kræft genotypebestemmelse [23, 24], vores pilot undersøgelse viser potentialet for Ion AmpliSeq CCP til at bidrage til påvisning af mutationer i både grundforskning og klinisk kræftforskning. Yderligere undersøgelser, med et større antal prøver vil hjælpe os med at forstå de observerede mellem de to metoder forskelle og føje til vores nuværende forståelse af mutationer, der drev progression og tilbagefald i GBM.

Tak

forfatterne vil gerne anerkende de patienter, der deltog i The Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet og Andrew E. Sloan, MD, for hans støtte af universitetets Hospitals hjernesvulst biobank. De resultater, der offentliggøres her, er helt eller delvist baseret på The Cancer Genome Atlas projekt udarbejdet af NCI og NHGRI. Yderligere information om TCGA kan findes her: https://cancergenome.nih.gov/

.