PLoS ONE: VE-Cadherin-Uafhængig Cancer Cell Inkorporering i det vaskulære endotel Precedes Transmigration

Abstrakt

Metastase er ansvarlig for 90% af kræftdødsfald. Under metastase, tumorceller bryde væk fra den primære tumor, ind i blodet og lymfekar, og bruge dem som motorveje til at rejse til fjerne steder i kroppen til at danne sekundære tumorer. Cancer cellemigrering gennem endotelet og ind basalmembranen repræsenterer et kritisk trin i den metastatiske kaskade, men det er ikke godt forstået. Denne proces er godt karakteriseret for immunceller, der rutinemæssigt der vandrer gennem endothelet til steder med infektion, inflammation eller skade. Tidligere studier med leukocytter har vist, at dette skridt er meget afhængig af aktivering status endotel og subendotele substrat stivhed. Her anvendte vi en tidligere fastsatte

in vitro

model af endotel og levende celler, for at observere cancercelle transmigration og sammenligne denne proces til leukocytter. Interessant cancercelle transmigration indbefatter et yderligere trin, som vi kalder “indbygning”, ind i endotelcelle (EF) monolag. Under denne fase, cancerceller fysisk fortrænge EC’er, der fører til dislokation af EF VE-cadherin væk fra EF junctions grænser cancerceller, og spredes i monolag. I nogle tilfælde EC’er fuldstændigt løsnes fra matrixen. Endvidere cancercelle inkorporering sker uafhængigt af aktiveringen status og subendotele substrat stivhed for brystkræft og melanomceller, en bemærkelsesværdig forskel fra den proces, hvorved leukocytter vandrer. I mellemtiden, pancreascancer celle inkorporering var afhængig aktiveringsstatus af endotelet og ændres på meget stive subendotele substrater. Kollektivt, vores resultater giver mekanistiske indsigt i tumor celle ekstravasation og viser, at inkorporering er en af ​​de tidligste trin

Henvisning:. Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza H (2014) VE-Cadherin-Uafhængig Cancer Cell inkorporering i det vaskulære endotel Precedes Transmigration. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10,1371 /journal.pone.0109748

Redaktør: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, USA

Modtaget: 30. maj 2014; Accepteret: 10. september 2014 Udgivet: 2 oktober 2014

Copyright: © 2014 Hamilla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en National Institutes of Health National Research Service Award F31NS068028 (KMS) og en Human Frontier Science Project Award RGP0058 /2011 ( HAE). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Neurologiske Lidelser eller National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft metastaser opstår, når tumorceller fragment fra den primære tumor, indtaste blod- og lymfekar, og spredes til fjerne kropslige organer. Denne proces er en af ​​de vigtigste medvirkende faktorer til dødsensfarlige i kræft [1], [2]. Når metastatiske cancerceller har indtastet blodstrømmen, skal de krydse endotelcelle (EF) barriere før invaderer vævet under i et trin kendt som ekstravasation. Mest tumor celler anholdes af ikke-specifik binding af koagulationsfaktorer og størrelse begrænsning i kapillære beds [3]. I nogle tilfælde har specifikke ligander på tumorceller blevet korreleret med en forøget metastatisk potentiale [4] – [6]. Hidtil har betydelig forskning været dedikeret til at analysere de biokemiske og molekylære evner kræftceller [7] – [9], men den underliggende mekanisme for kræft celle ekstravasation gennem endotel forbliver stort set ukendt. Cancerceller er blevet observeret at migrere gennem EF cellelegemet [10] og gennem endotheliale celle-celle kryds uden at ødelægge EF laget [11]. modstridende forskning har imidlertid også vist, at kræftcellerne ikke forlader endotel intakt efter ekstravasation [10], [12] – [14]. Det er vigtigt at bemærke, at disse undersøgelser anvendte forskellige tumorcellelinjer samt forskellige EF linjer og

in vitro

metoder, så det er muligt, at forskellige kombinationer af forskellige typer af tumorceller og EC’er kan føre til divergerende mekanismer på ekstravasation. Der er tre foreslåede metoder for kræft celle migration gennem endotel: (a) cancerceller kan migrere gennem EF krop [10], (b) kræftceller kan fremkalde EF apoptose [10], [13] og (c) kræftceller kan migrere gennem endotheliale celle-celle kryds uden permanent at ødelægge EF laget [11]. I de seneste år har forskningen også vist, at cancerceller også udøve kræfter på EC’er der skubber dem dybere ind i den ekstracellulære matrix under transmigration [15], [16], og at endotelet forbedrer cancercellen migration [17]. Disse resultater antyder, at cancer migration gennem endothelet er en kompleks proces, som kræver yderligere undersøgelse for at belyse dets mekanistiske kurs.

Leukocytter rutinemæssigt der vandrer gennem endotelet og underliggende lag af vaskulaturen at nå væv steder med inflammation, infektion, eller tilskadekomst. Dette er en velkarakteriseret proces, der bygger på lokaliserede biokemiske signaler. I leukocyt-trafik, endothelium fungerer som en selektiv barriere, som i høj grad reducerer invasion rate [18]. Under et immunrespons, kemokinet tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) fremstilles ved stromale celler, og den lokal eksponering af EC’er for TNF-α opregulerer adhæsionsmolekyler, såsom intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) på overfladen af endotel. Endvidere foruden molekylære ændringer, TNF-α også i væsentlig grad ændrer de strukturelle egenskaber af endotelet, som inducerer blødgøring, actin justering, og en stigning i den samlede permeabilitet [19], [20]. En yderligere faktor, der forbedrer leukocyt transmigration er den subendotele substrat stivhed og mekaniske egenskaber af endotel. Disse varierer i løbet af vaskulær homeostase og i patologiske tilstande [19]. Neutrofiler kan mechanosense deres mikromiljø [19], [21] – [24], og neutrofil transmigration stiger som subendotel substrat stivhed øges som følge af EF myosin let kæde-kinase (MLCK) -medieret kontraktile kræfter [19]. Alle disse ændringer i EF-monolag lette leukocyt transmigration under et immunrespons.

Da leukocytter rutinemæssigt der vandrer gennem EF lag, antages det, at metastatiske cancerceller kan dele mange af de samme mekanismer. Men disse mekanismer endnu, der skal undersøges nærmere. For eksempel er inddragelsen af ​​kemokiner i tumor-endotel interaktioner og deres virkninger på kræft celle migration ikke godt forstået [25]. Endnu mere, kan de betydelige molekylære og strukturelle ændringer, der finder sted i endotel følgende TNF-α behandling forbedre metastatisk cancer celle transmigration. Det er fortsat også ses hvordan kræftcelle ekstravasation varierer med subendotel substrat stivhed. Som observeret med leukocytter [19], er det muligt at kræftcelle transmigration kan stige med stigende substrat stivhed. Cancerceller er også blevet observeret at skubbe EC’er i den ekstracellulære matrix under ekstravasation, hvilket indikerer, at de mekaniske egenskaber af ECM kan spille en vigtig rolle. Taget sammen indikerer disse resultater, at både aktiveringsstatus af endotelet og subendoteliale substrat stivhed kan påvirke cancerceller ekstravasation.

I dette arbejde, en

in vitro

model af det vaskulære endotel [19 ], [26] – [28] blev anvendt til at udforske cancercelle transmigration og hvordan denne proces kan sammenlignes med leukocyt ekstravasation. Vores resultater viser, at en af ​​de tidligste trin i ekstravasation af metastatisk brystkræft celler er inkorporering i EF monolag, som i væsentlig grad forstyrrer EF barriere og fysisk fortrænger EC’er, nogle gange fører til fuldstændig fjernelse af ECS fra monolag. I modsætning leukocyt transmigration, går cancercelle inkorporering ikke afhænge af aktiveringsstatus af endotelet eller subendotel substrat stivhed for melanomceller og brystcancerceller. Interessant pankreatisk celle inkorporering afhænger aktiveringsstatus af endotelet og subendotele stivhed. Sammen vore resultater indikerer, at metastatisk brystcancer celle ekstravasation involverer et yderligere trin med inkorporering i endotelet, som ikke forekommer ved leukocyt ekstravasation.

Materialer og metoder Salg

Fremstilling af polyacrylamid gel substrater

Tynde polyacrylamidgeler blev fremstillet på dækglas ifølge fremgangsmåden først beskrevet af Wang og Pelham [29] og beskrevet i detaljer i vores tidligere publikationer [19], [23], [30] – [33]. Kort fortalt blev 280 kPa (15% acrylamid + 1,2% bis-acrylamid) og 0,87 kPa (3% acrylamid + 0,1% bis-acrylamid) geler oprettet og overtrukket med 0,1 mg /ml fibronectin (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [19]. Karakterisering af Youngs modul af gelerne blev udført ved atomic force mikroskopi og dynamisk mekanisk analyse, mens analyse af overflade-bundet fibronectin blev opnået ved immunfluorescens [23], [32]. For eksperimenter med glas, 22 × 22 mm dækglas (Fisher Scientific) blev overtrukket med 0,1 mg /ml fibronectin i 2 timer ved stuetemperatur.

Cellekultur

Humane umbilical vene endotelceller (Lifeline Cell Technology) blev dyrket som tidligere beskrevet [34]. MDA-MB-231 metastatiske brystcancerceller (ATCC) og A375 melanomceller (ATCC) blev dyrket i DMEM, 10% FBS og 1% penicillin streptomycin. SW1990 bugspytkirtelkræftceller (ATCC) blev dyrket i DMEM, 10% FBS, og 50 ug /ml gentamicin. HUVEC’er (passager 2-5, 4 × 10

5 samlede) blev udpladet på fibronectincoatede dækglas eller polyacrylamidgeler og dyrket i ca. 48 timer, på hvilket tidspunkt et monolag dannet. Celler blev behandlet med kontrolmedium eller 25 ng /ml tumornekrosefaktor-α (TNF-α) for de sidste 24 timer før forsøg. I nogle forsøg blev HUVEC’er transficeret med VE-cadherin-GFP (VEcadGFP) under anvendelse af et adenovirus (ADV), der blev modtaget som en generøs gave fra Dr. William Luscinskas (Harvard Medical School). Dr. Luscinskas laboratorium har tidligere beskrevet en metode til konstruktion af VEcadGFP plasmidet og overføring til en adenovirus ekspressionsvektor [35]. HUVEC’er blev udpladet på fibronectincoatede polyacrylamidgeler eller dækglas og givet 1-2 timer at sprede sig, og 3 pi ADV-VEcadGFP blev tilsat til cellerne med 2 ml medier pr substrat. HUVEC’er blev derefter dyrket til monolagsformation som beskrevet ovenfor. Monolag blev vasket med PBS før tilsætning yderligere HUVEC’er eller tumorceller (1 x 10

5 celler i alt) til den apikale overflade af 22 × 22 mm monolag. At skelne mellem HUVEC-celler i monolag og de yderligere tilsatte celler til monolaget, tilføjede HUVEC’er eller MDA-MB-231-celler blev farvet med den lipofile DiIC

16 farvestof (1 uM) i suspension i 5 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af centrifugering og en PBS vask.

live-cell imaging og analyse

live-celle mikroskopi blev afsluttet i et lukket mikroskop etape inkubator ved 37 ° C, 5% CO

2 og 55% fugtighed under anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus IX71). Billeder blev taget med enten en QImaging Retiga-SRV charge-coupled device (CCD) digital kamera (QImaging Corporation) ved hjælp IPLab software (Becton, Dickinson and Company), eller med en en QImaging Rolera-MGI CCD digitalkamera (QImaging Corporation) ved hjælp Slidebook software (version 4.2.0.9, intelligente Imaging Innovations). Fasekontrast, differential interferens kontrast (DIC), og /eller fluorescens timelapse billeder blev taget med enten en 20 × /0,45 NA Ph1 objektiv eller en 60 × /1,42 NA olie mål. Fraktionen af ​​inkorporerede celler (HUVEC’er eller MDA-MB-231) blev beregnet ved at dividere antallet af celler, der blev inkorporeret på ethvert tidspunkt under timelapse sekvens med det samlede antal af fase-hvide celler over monolaget i den indledende ramme af sekvens. Den tid til at færdiggøre inkorporering blev beregnet ved hjælp af forskellen mellem det tidspunkt, hvor cellen først begyndte at sprede sig ind i monolag og det tidspunkt, hvor cellen nået maksimum sprede område i monolag.

Interferens refleksion mikroskopi

interferens refleksioner mikroskopi (IRM) blev anvendt til at detektere overflade-til-overflade interferens mellem lysstråler reflekteres fra substratet /medium-grænsefladen, og dem fra medium /celle grænsefladen, som beskrevet i vores tidligere arbejde [36] – [38] . Ved denne teknik intensiteten af ​​lyset er et mål for nærhed af cellen til glasoverfladen, således at områder af membranen nærmest overfladen er mørke og dem længere væk synes lysere. Derfor IRM er en optimal metode, når de evaluerer cellulær vedhæftning, vedhæftning, og spredning adfærd [36] – [38]. Til spredning eksperimenter, 1 x 10

5 MDA-MB-231-celler blev udpladet på 22 × 22 mm fibronectincoatede dækglas i HUVEC medier, hvilket resulterer i observation af enkeltceller. Til disse eksperimenter et omvendt mikroskop (Olympus IX71) med en 60 x /1.42 NA olie objektivlinse og en 100 W kviksølvlampe (Olympus, anvendes ved bølgelængde 561) blev anvendt i kombination med et CCD-kamera (Retiga SRV kamera, QImaging) for billedoptagelse. Eksperimenter blev udført i et lukket mikroskop kammer, der holdes dyrkningsbetingelser ved 37 ° C, 50% fugtighed og 5% CO

2. Under cellespredning blev én ramme registreret hvert 5. sekund over en periode på 1 μhour for N = 5 uafhængige forsøg. Til statistiske evalueringer af spredning områder, blev billeder analyseret med ImageJ (National Institutes of Health) software. Cellelokaliteterne grænser blev sporet i hånden og området blev beregnet under anvendelse ImageJ rutiner. Områder i MDA-MB-231 celler spreder sig til en HUVEC monolag blev også spores i hånden og sammenlignet med enkelte celler spreder på endotel-fri dækglas.

Konfokal Imaging

I alt 1 × 10

5 MDA-MB-231-celler blev transficeret med 10 pi CellLight Actin-GFP (Life Technologies) ifølge producentens protokol og fik lov at inkubere i 24 timer. Efter 24 timer inficeres MDA-MB-231-celler blev indført til et konfluent HUVEC monolag og fik lov til at inkorporere i 15 timer. Efter inkorporering blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet under anvendelse Texas-Red Phalloidin (Invitrogen). Z-stack billeder blev indsamlet ved anvendelse af et Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop med en 63 x olie mål.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev gennemført ved anvendelse af en Student t-test mellem par af data, eller ved anvendelse af ANOVA for grupper af data, hvor P 0,05 angivne statistisk signifikans. Efter ANOVA blev multiple sammenligninger udført under anvendelse Tyrkiets ærligt signifikant forskel kriterium. Alle målinger er rapporteret her i formatet gennemsnit ± standardafvigelse.

Resultater

Inkorporering i endotelet er det første skridt i metastatisk cancer celle transmigration

MDA-MB-231 metastatiske brystkræftceller blev indført på den apikale overflade af en EF-monolag og overvåget som de interageret med endotel (film S1). Oprindeligt MDA-MB-231-celler blev lyse hvid og sfærisk i modsætning til den underliggende fase-formørket og affladet endotel (fig. 1A). Inden for nogle timer, begyndte MDA-MB-231 celler til at inkorporere i endotelet, i en proces, der lå i gennemsnit fra 40 til 60 minutter (fig. 1 B) og var visuelt forskellige fra neutrofil transmigration gennem endotelet (fig. 1C) . Specifikt viste det sig, at ECS støder op til stedet for iblanding fysisk blev fordrevet, skabe hulrum for MDA-MB-231 celle til spredes på det underliggende matrix (fig. 1A), mens neutrofiler presses gennem endotelet uden at forstyrre monolaget ( fig. 1C). Nogle EC’er løsrevet fra den underliggende matrix, rundet op og blev sfæriske efter inkorporering af MDA-MB-231-celler i monolaget (fig. 2). Ca. 25% af EC’er fritliggende efter cancercelle inkorporering (figur 2). Men inkorporering af MDA-MB-231 celler i endotelet forekom langsommere, med en mindre hældning af “sprede område vs. tid”, og havde en lavere endelig cellulær område sammenlignet med MDA-MB-231-celler spreder på en endothelium- fri fibronectin-coatede substrat (fig. 3D), hvilket indikerer, at endothelet ikke begunstigede inkorporering af cancercellen, men snarere samlet begrænset spredning område. Endvidere MDA-MB-231-celle-inkorporering i endotelet forekom langsommere, med en mindre hældning af “kumulativ inkorporering vs. tid”, i sammenligning med EC’er inkorporering i et monolag af EC’er (Fig. 3A). Det er således sandsynligt, at inkorporering af MDA-MB-231-celler i endotelet sker ved en anden mekanisme end native EC’er spredes til samme endotel. A375 melanomceller og SW1990 pancreatiske celler blev også introduceret til den apikale overflade af endotel. I lighed med MDA-MB-231-celler, melanomcellerne og pancreasceller begyndte at inkorporere i endotelet i en proces, der varede cirka 15 minutter og 50 minutter henholdsvis. A375 kræftceller indarbejdet i monolag på et langt hurtigere tempo i forhold til metastatiske brystkræftceller og deres inkorporering dynamik lignede, at af indfødte EC’er spredes til EF-monolag. A375 melanom celler havde en sidste brøkdel af iblanding, der lignede EC’er spreder sig EC’er, mens SW1990 kræftceller havde en meget lavere brøkdel af inkorporering i forhold til alle grupper (fig 3C). Endvidere konfokale billeder (Fig 4A) afslørede, at efter 15 timers inkorporering, MDA-MB-231 (grøn) celler forskydes EC’er (rød) ved spredning mellem tilstødende EC’er. Retvinklede projektioner viser, at MDA-MB-231 celler er faktisk breder mellem EC’er og ikke migrerer under dem under inkorporering (figur 4B).

(A) Fase kontrast billede af MDA-MB-231 celler (hvidt ) oven på en human navlevene endotel (HUVEC) monolag. Scale bar er 20 um. (B) MDA-MB-231-celle (sorte pile) begynder at indarbejde endotelet, som angivet ved dens ændring i fasekontrastmikroskopi fra lyse hvid til formørket. Scale bar er 20 um og gælder for alle billeder i panel B. tidsrum efter plating MDA-MB-231 celler på endotel vises i øverste højre hjørne af hvert billede i timer: minutter: sekunder format. Den endelige procentdel af inkorporering for dette forsøg var 95%. (C) fase kontrast billede sekvens af en neutrofil transmigrating gennem en TNF-α-aktiveret endotel. Scale bar er 20 um og gælder for alle billeder i panel C. tidsrum efter plating neutrofiler på endotel vises i øverste højre hjørne af hvert billede i timer: minutter:. Sekund format

fase kontrast (til venstre) og DiIC

16 fluorescens (højre) billeder af MDA-MB-231 celler udsået på en ubehandlet HUVEC monolag, på tidspunkter umiddelbart efter plating (øverst) og efter 16 timers interaktion med endotel (nederst ). Røde pile peger til fase-hvide blodlegemer, som ikke udsender fluorescens; disse er endotelceller, der er blevet tvunget ud af monolaget og således have løsnet og bliver afrundet. Scale bar er 25 um og gælder for alle billeder.

(A) Akkumuleret brøkdel af EC’er eller MDA-MB-231 celler (231), SW1990 (1990), og A375-celler indarbejdet i endotel som en funktion af tid efter udpladning. Datapunkter repræsenterer middelværdi ± SEM i mindst 3 uafhængige forsøg (N 20 celler for hvert eksperiment). (B) Sidste del af MDA-MB-231-celler inkorporeret i den ubehandlede eller TNF-α-behandlede endotel efter 15 timer. Søjler repræsenterer middelværdi, mens Fejlbjælkerne viser SEM af mindst 3 uafhængige forsøg. P 0,05 mellem disse værdier angiver, at der ikke er nogen statistisk forskel (N.S.). (C) Sidste del af MDA-MB-231 brystcancerceller, EC’er, A375 melanomceller og SW1990 pancreasceller inkorporeret i endotelet efter 15 timer. Søjler repræsenterer middelværdi, mens Fejlbjælkerne viser SEM af mindst 3 uafhængige forsøg. (*) Angiver signifikans (P 0,05) sammenlignet med EC’er. (D) Plot for spredning område versus tid afslører forskelle i spredning dynamik for MDA-MB-231-celler spreder på en fibronectin-overtrukne dækglas ( “enkeltceller”) eller til en ubehandlet endotel ( “i monolag”).

(a) en repræsentant MDA-MB-231 (grøn; actin-GFP) celle inficeret med GFP-actin er vist spredes til en HUVEC monolag (rød, Phalloidin). Retvinklede projektioner vises. (B) Skematisk viser, at en kræftcelle (grøn) forskyder EC’er (rød) ved spredning mellem tilstødende EC’er under inkorporering.

Aktivering af endotel af TNF-α påvirker ikke inkorporering dynamik brystkræft og melanom celler

aktivering af endotel er et vigtigt skridt i leukocyt vedhæftning kaskade, og vores tidligere arbejde har vist, at leukocyt transmigration er meget afhængig af aktivering status endotel [19], [28], [ ,,,0],30]. Aktivering af endotelet af TNF-a ikke kun opregulerer adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1 og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1), men øger også EF kontraktilitet [31] og reducerer EF barrierefunktion [20]. Derfor er vores næste mål var at bestemme, hvorvidt inkorporering af metastatiske brystcancerceller i endotelet krævede EC’er til at blive aktiveret. Interessant nok fandt vi, at den kumulative del af inkorporering over for tid af MDA-MB-231-celler var den samme, uanset om EC’er blev behandlet med TNF-α (Fig. 3A). Derudover endelige fraktion af celler, som inkorporeret i en TNF-α-aktiveret endotel efter 15 timer var ikke forskellig fra den fraktion inkorporeret i en ubehandlet endotel (fig. 3B). Endelig tidsforbruget til inkorporering (fra en afrundet kugle til en fladtrykt celle i endotel) var ikke afhængig af, om endotelet blev behandlet med TNF-α (fig. 5C). Svarende til brystcancerceller, den del af inkorporering af A375-melanomceller til EC’er var sammenlignelige, uanset om EC’er blev behandlet med TNF-α (Fig S1). Disse resultater tyder på, at nogle metastatiske cancerceller er i stand til at fuldføre de tidlige stadier af ekstravasation, selv i fravær af en inflammatorisk stimulus. Men den del af inkorporering efter 15 timer for SW1990 bugspytkirtlen celler var statistisk forskellige mellem ubehandlet EC’er og dem behandlet med TNF-α (figur S2). SW1990 celler indarbejdet i et langt hurtigere tempo og højere fraktion i TNF-α behandlet EC’er forhold til ubehandlet EC’er.

(A) Akkumuleret brøkdel af MDA-MB-231 celler inkorporeret i endotelceller på en fibronectin-coated 0,87 kPa eller 280 kPa polyacrylamidgel, eller glas (50 GPa). Datapunkter repræsenterer middelværdi ± SEM i mindst 3 uafhængige forsøg (N 20 celler for hvert eksperiment). (B) Sidste del af MDA-MB-231-celler indarbejdet i (ubehandlet) endotel som en funktion af subendotel substrat stivhed. Søjler repræsenterer middelværdi, mens Fejlbjælkerne viser SEM af mindst 3 uafhængige forsøg. P 0,05 mellem disse værdier angiver, at der ikke er nogen statistisk forskel (N.S.). (C) Tid til MDA-MB-231-celler for at fuldføre inkorporering er uafhængig af de mekaniske egenskaber af substratet under de endotelceller. Endotelceller på fibronectincoatede dækglas (50 GPa) eller polyacrylamidgeler (0,87 kPa eller 280 kPa) blev efterladt ubehandlet (ingen TNF) eller behandlet med TNF-α (TNF). Ingen statistisk forskel i inkorporering blev målt som en funktion af subendotel substrat stivhed eller endotelcelle behandling (P 0,05).

Inkorporering er uafhængig af subendotel substrat stivhed for brystkræft og melanomceller

Vores tidligere arbejde har også vist, at leukocyt transmigration afhænger af de mekaniske egenskaber af substratet under endothelcellerne [19], [30]. Stivere subendotele matricer fremmer myosin let kæde kinase afhængig EF kontraktilitet, hvilket fører til intercellulære huller og forstærket leukocyt transmigration [19], [30]. Derfor er vores næste mål var at fastslå, om metastatisk brystcancer celle inkorporering i endotel var afhængig af subendotel substrat stivhed. I modsætning neutrofil transmigration, hvilket øger med subendotel substrat stivhed, dynamikken i MDA-MB-231-celle inkorporering i endotelet var ens for blød (0,87 kPa), mellemprodukt (280 kPa), og meget stiv (glas; 50 GPa) subendotele substrater (fig. 5A). Derudover endelige inkorporeret del af MDA-MB-231 ind i endotel var uafhængig af subendotel substrat stivhed (fig. 3B). og den samlede tid, der kræves for at gennemføre sjælevandring var uafhængig af subendotel substrat stivhed (fig. 5C). A375 melanom celler indarbejdet i bløde, mellemliggende, og meget stive subendotele matricer med lignende iblanding dynamik og endelig brøkdel af inkorporering til brystkræftceller (Fig S3). SW1990 pancreasceller vises en anden adfærd fra melanomceller og brystcancerceller (fig S4). Når SW1990-celler blev udpladet på bløde og intermediære substrater, de udviste en lignende grad af inkorporering dynamik og endelig del af inkorporering efter 15 timer (fig S4). Men når lov til at indarbejde på meget stive matricer (glas, 50 GPA), de viste en meget lavere brøkdel af inkorporering og langsommere optagelseshastigheden. Mens efterfølgende trin i den metastatiske kaskade kan afhænge af substratet stivhed, vores resultater viser, at de tidlige stadier af brystkræft celle ekstravasation og melanom ekstravasation forekommer uanset de mekaniske egenskaber af matrixen under endothelet mens pankreatisk celle inkorporering ændrer på meget stive substrater.

Endotelceller ikke udtrykker VE-cadherin langs grænserne med indbygget brystkræftceller

Vaskulær endotel cadherin (VE-cadherin) er en af ​​de vigtigste homofil adhæsionsmolekyler fra ECS udtrykt ved celle-celle grænser i et konfluent monolag. Integriteten af ​​endotel som en vaskulær barriere er stærkt afhængig af et velfungerende VE-cadherin adhæsionsmolekyler [39], [40]. Som EC’er inkorporeret i en sund sammenflydende endotel, GFP-VE-cadherin blev udtrykt af alle EC’er nabolande indarbejdet DiIC

16-mærket EF (fig. 6A, Film S2), hvilket indikerer, at tilsætning af nye EC’er på monolag ikke gjorde forstyrre integriteten af ​​EF kryds. Vi næste søgt at identificere mulige ændringer i VE-cadherin morfologi efter inkorporeringen af ​​MDA-MB-231 celler i endotel. Bemærkelsesværdigt EC’er nabo-inkorporeret DiIC

16-mærkede MDA-MB-231-celler ikke udtrykker GFP-VE-cadherin på grænser med MDA-MB-231 celler, men de fortsatte med at udtrykke GFP-VE-cadherin i kryds med andre EC’er (fig. 6B). Disse resultater viser, at den tidlige fase af cancercelle ekstravasation ikke kun påvirker VE-cadherin-afhængig celle-celle-adhæsion, men kan også give en lettilgængelig rute for ekstravasation for andre cirkulerende tumorceller.

DiIC16-mærket HUVEC’er (A) eller MDA-MB-231 (B) blev udpladet på endotelceller udtrykker VE-cadherin-GFP (VE-cad-GFP). Billeder blev fanget efter inkorporering af hver celletype. Scale bar er 10 um og gælder for alle billeder i denne figur.

Brystkræft celle inkorporering initierer ved dislocating VE-cadherin på endotel celle vejkryds

Før starten af ​​MDA- MB-231-inkorporering i endotelet, observerede vi intakt GFP-VE-cadherin på EF junction direkte under MDA-MB-231 celler (figur 7A;. røde pile, film S2). Dette var i direkte modsætning til de MDA-MB-231-celler, der er inkorporeret i endotelet på tidligere tidspunkter, hvor GFP-VE-cadherin blev ikke udtrykt af tilstødende EC’er (Fig 7A;. Gule pile). Det første skridt i inkorporering skabte en afbrydelse i GFP-VE-cadherin på EF krydset direkte under MDA-MB-231-celle, hvilket fører til dannelsen af ​​en lille (ca. 2 um

2) hul i EF krydset (Fig . 7B, rød pil). En anden lille hul undertiden dannet (figur 5B;. To røde pile), før det tomrum blev betydeligt større (~33 um

2 ved T = 06:35), og ryddet området for en del af kroppen af ​​EF. Endelig hvad der begyndte som et lille hul i GFP-VE-cadherin opformeret i et enormt hul i endotel, som blev besat af MDA-MB-231 celle (fig. 7B). Vi har også observeret en betydelig forskydning og omstrukturering af GFP-VE-cadherin på nærliggende EF-EF vejkryds (figur 7B;. Gule pile).

DiIC

16-mærkede MDA-MB-231 celler blev udsået på endotelceller udtrykker VE-cadherin-GFP (VE-cad-GFP). (A) Vist er forskellen interferens kontrast (DIC), DiIC

16 (rød) fluorescens, og VE-cadherin-GFP (grøn) fluorescens, og overlay billeder. På dette tidspunkt, har en MDA-MB-231 allerede er indarbejdet i endothelium (gule pile), og den VE-cadherin-GFP er stadig intakt i stedet lige under et andet MDA-MB-231-celle, der endnu ikke begyndt at indarbejde (røde pile). (B) Fluorescens timelapse sekvens af et DiIC

16-mærket MDA-MB-231-celle (rød) inkorporering i en endotel udtrykker VE-cadherin-GFP (grønt). Tidsrum efter udpladning MDA-MB-231 celler på endotelet er indikeret i det øverste højre hjørne af hvert billede i timer: minutter format. Scale bar i panel A (DIC billede) er 10 um og gælder for alle billeder i denne figur.

Diskussion

Kræft metastaser fortsætter med at være en førende dødsårsag i kræftpatienter [1], [2], og et af de kritiske trin regulerer metastase er ekstravasation fra vaskulaturen. Mens de mekanismer, der regulerer denne proces er uklare, er endotelet vides at spille en vigtig rolle, som enten en hindring for nogle kræftceller, eller en promotor for invasiv kapacitet i andre cancerceller herunder MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41].