PLoS ONE: Trametinib med eller uden Vemurafenib i BRAF Muterede Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

V-Raf musesarcoma Viral Oncogene Homolog B (BRAF) muteret lungekræft er relativt aggressiv og er modstandsdygtig over for i øjeblikket tilgængelige behandlinger. I en nylig fase II studie for patienter med BRAF-V600E ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), BRAF V600E hæmmer viste tegn på aktivitet, men 30% af denne udvalgte gruppe skred under behandling, hvilket tyder på et behov for at udvikle alternative strategier. Vi testede to forskellige muligheder for at forbedre effektiviteten af ​​vemurafenib (BRAF V600E inhibitor) i BRAF muteret NSCLC. Den første mulighed var tilføjelsen af ​​erlotinib at vemurafenib at se, om kombinationen forudsat synergi. Den anden var at fremkalde MEK hæmning (nedstrøms RAF) med trametinib (MEK-inhibitor). Vi fandt, at kombinationen af ​​vemurafenib og erlotinib ikke var synergistisk til inhibering af p-ERK-signalering i BRAF-V600E celler. Vemurafenib forårsagede betydelig apoptose, G1 anholdelse og opregulering af BIM i BRAF-V600-celler. Trametinib var effektivt som et enkelt middel i BRAF muterede celler, enten V600E eller ikke-V600E. Endelig kombinationen af ​​vemurafenib og trametinib gav et lille men signifikant stigning i apoptose samt en betydelig opregulering af BIM sammenlignet med enten enkelt middel. Således antyder muligheden for at udnytte en kombinatorisk tilgang til forvaltning af denne gruppe af patienter. Vigtigere, trametinib alene forårsagede opregulering af p-AKT i BRAF ikke-V600 muterede celler, mens denne virkning blev ophævet med kombinationen. Dette fund tyder på, at, vil kombinationen af ​​en MEK-inhibitor med en BRAF inhibitor være mere effektive i kliniske omgivelser for patienter med BRAF muterede NSCLC

Henvisning:. Joshi M, Rice SJ, Liu X, Miller B, Belani CP (2015) Trametinib med eller uden Vemurafenib i BRAF muterede ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10,1371 /journal.pone.0118210

Academic Redaktør: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: 10. september 2014 Accepteret: 9. januar 2015; Publiceret: 23 feb 2015

Copyright: © 2015 Joshi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

et flertal af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er diagnosticeret på et senere tidspunkt og i øjeblikket tilgængelige behandlinger, herunder kemoterapi og strålebehandling synes at være utilstrækkelig i at slå denne dødelige sygdom. Tilstedeværelsen af ​​en aktiverende mutation i den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) er forbundet med høje svarprocenter og forbedret progressionsfri overlevelse (PFS) med anvendelse af EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) [1-3]. Erlotinib og gefitinib er første generation TKI’er der forårsager reversibel inhibering af tyrosinkinasedomænet af EGFR. Erlotinib blev oprindeligt godkendt til klinisk brug i avanceret NSCLC i linjen indstillingen sekunder på grundlag af positive resultater fra fase 3 BR.21 forsøg [4]. Fase 3-forsøg, ligesom OPTIMAL (erlotinib versus kemoterapi som førstevalg til behandling af patienter med fremskreden EGFR-mutation-positive ikke-småcellet lungekræft) [5] og iPass (Iressa Pan Asia Study) [6], har vist klare forbedringer i svarprocenter og progressionsfri overlevelse (PFS) med første generations TKI’er i linjen indstillingen først i forhold til traditionelle platinbaseret kemoterapi. Dette har allerede ført til anvendelse af EGFR TKI’er som en første-line behandling for patienter med NSCLC huser et sensibiliserende EGFR mutation i modsætning til standard kombinationskemoterapi. På samme måde kan BRAF (v-Raf murine sarkom viral onkogen homolog B1) mutation også køre tumor udvikling i NSCLC. Mutationer i

BRAF

gen har en frekvens på ~2-3% i NSCLC [7,8]. En V600E mutation på exon 15 omfatter ca. 50% af alle BRAF mutationer mens ikke-V600E BRAF-mutationer udgør resten 50% [9].

BRAF mutant NSCLC menes at være aggressiv og vise resistanceto eksisterende behandlinger [10]. Vemurafenib er en oral BRAF inhibitor selektivt for V600E mutation og har vist sig at være effektive til behandling af avancerede melanomapatienter med samme mutation. Der er beviser for, at BRAF-hæmmere, der anvendes alene i NSCLC med BRAF-V600E positive mutation, demonstrere kun en beskeden fordel uden komplette responser, 40% delvis respons, og 30% med sygdomsprogression under behandlingen [11]. Virkningen af ​​MEK (MAPK /ERK-kinase) inhibering i BRAF mutant NSCLC er ikke undersøgt grundigt og en nylig undersøgelse viste, at kombinationen af ​​en BRAF inhibitor (dabrafenib) og MEK-inhibitor (trametinib) var også effektive til behandling fremskreden melanom [12 ]. Trametinib er en oralt tilgængelig MEK-inhibitor for nylig godkendt af Food and Drug Administration (FDA) til brug i behandling af metastatisk melanom patienter med BRAF-V600E og BRAF-V600K mutationer, baseret på resultaterne af et klinisk forsøg af Flaherty

et al.

, viser en signifikant fordel i både progressionsfri og samlet overlevelse [13].

i prækliniske indstilling, receptor (RTK) hæmning har en dominerende indflydelse på undertrykkelse af phosphoinositid 3-kinase (PI3K ) signalvejen. En af resistensmekanismer for RTK inhibering i KRAS mutant cellelinier er gennem aktivering af Ras-signalvejen [14]. En coloncancercellelinie med en BRAF V600E mutation blev vist at undslippe vemurafenib inhibering ved at aktivere epitheliale vækstfaktorreceptor (EGFR); imidlertid behandling af disse celler med vemurafenib og en EGFR-inhibitor forhindret vemurafenib modstand og induceret apoptose [15]. Vi hypotesen, at mutation i BRAF vej forårsager hyper-aktivering af ERK og dermed ville kombinere EGFR hæmning med BRAF hæmning være til gavn. Vi har også sat sig for at afgøre, om MEK-inhibitor trametinib ville bevidstgøre BRAF muterede vildtype (WT) EGFR NSCLC celler til BRAF hæmning af vemurafenib. Vi antager, at BRAF-V600E celler har begrænset følsomhed over for BRAF inhibitor på grund af aktivering af MAPK-vejen [12]. Derfor kunne trametinib forbedre effektiviteten af ​​en BRAF inhibitor i BRAF muteret NSCLC. Resistens over for BRAF inhibitorer medieres via flere mekanismer inducerer reaktivering af MAPK-vejen [16-19]. Trametinib målretter MEK, som er nedstrøms for BRAF i MAPK-vejen. Derfor kombinerer trametinib med en BRAF inhibitor, enten vemurafenib eller dabrafenib, ville være mere effektiv. Vores mål var at undersøge, om trametinib og vemurafenib kunne samarbejde om at undertrykke ERK /MAPK signalvejen i BRAF mutant NSCLC cellelinjer. Vi sammenlignede effekten af ​​enkelt stoffer, vemurafenib eller trametinib, som i kombinationen af ​​vemurafenib plus trametinib i BRAF muteret NSCLC cellelinjer, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] og H1755 [non-V600E, G469A BRAF mutant, WT EGFR ].

Materialer og metoder

Cellelinjer, reagenser og antistoffer

A549, H460, H1755 blev indhentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manasse, VA). Betragtninger blev HCC364 cellelinie fås fra Dr. Adi F. Gazdar forskning laboratorium, University of Texas, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, streptomycin og penicillin ved 37 ° C med 5% CO

2. BRAF V600E og G469A mutationer i HCC364 og H1755 celler henholdsvis blev bekræftet ved hjælp af et snapshot fragment analysemetode i henhold til den protokol udviklet af Su et al. (S1 Fig.) [21]. Antistoffer blev erhvervet fra Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Erlotinib, vemurafenib og trametinib blev opnået fra Selleckchem (Houston, TX).

Cell spredning og langsigtede vækstmuligheder analyser

Celler blev podet ved 1×10

4 celler per brønd i en 96 brønds vævskulturplade. Den følgende dag blev celler behandlet med erlotinib, trametinib, vemurafenib eller kombinationer som anført i figurteksterne. Dimethylsulfoxid (DMSO) blev anvendt som en vehikelkontrol. Celleproliferation blev målt 48 eller 72 timer efter lægemiddelbehandling under anvendelse af en celle Titer 96 vandigt ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega, Madison WI) i overensstemmelse med producenternes protokol. Relativ levedygtighed blev beregnet for hver brønd ved at subtrahere baggrunden absorbans før normalisering til vehikelkontrol behandlede brønde.

Langsigtede vækst- assays blev udført ved at pode celler ved 1500 celler per brønd på en plade med 12 brønde. Lægemidler blev tilsat direkte til hver brønd den efterfølgende dag, og friske medier med lægemiddel blev tilsat efter 4 dage. Efter 7 dage blev cellerne vasket med PBS, fikseret i 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur (RT), inkuberet med 70% ethanol i 5 minutter, og derefter farvet med 0,1% trypanblåt i 60 minutter ved stuetemperatur. Efter affarvning i PBS tre gange blev brønde scannet. Bagefter blev farvestoffet solubiliseret i 1% SDS, og absorbansen blev målt ved 590 nm i tre 100 pi prøver fra hver brønd på en Synergy HT pladelæser (BioTek, Shoreline WA). Baggrund absorbans fra en brønd uden celler blev trukket fra eksperimentelle værdier, og eksperimentelle værdier blev normaliseret til køretøjets behandling.

immunoblotassay

Proteiner blev høstet fra celler i en lysis buffer indeholdende 40 mM Tris.Cl pH 7,6, 1% Triton X-100, 1% deoxycholat, 150 mM NaCl plus protease og phosphataseinhibitor cocktails (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 4 ° C i 30 min. Totalt protein blev kvantificeret med en BCA kit (Thermo Scientific, Waltham MA), og lige store mængder af protein blev delt gennem 10% SDS-PAGE geler, elektroblottet til PVDF, og blokeret med 5% NFDM. Blokerede membraner blev inkuberet natten over med primære antistoffer, med passende HRP-konjugeret sekundært antistof, før kemiluminescerende detektion.

Flowcytometri

Apoptose blev analyseret ved farvning af celler med FITC-mærket Annexin-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) og ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) før analyse på en Calibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose CA). Celler blev podet i tre eksemplarer på en 6-brønds plade, og de følgende dage celler blev behandlet med de angivne lægemidler. Paclitaxel blev anvendt som en positiv kontrol for apoptose eksperimenter. Fireogtyve til 48 timer efter behandlingerne, blev de flydende celler og adhærente celler høstet derefter farvet med Annexin-V-FITC og 7-AAD i 1x annexin V-binding buffer (BD Biosciences) i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Fluorescens blev målt med et flowcytometer, og resulterende data blev analyseret med WinMDI 2.8 software (The Scripps Institute, https://facs.scripps.edu/software.html).

Cellecyklusanalyse blev udført ved ethidium bromid farvning. Celler blev podet i tre eksemplarer på en 6-brønds plade dagen før lægemiddelbehandling. Efter 24 timer blev kernerne høstet og farvet i en hypotonisk lysis opløsning (7 mM natriumcitrat, 0,2% Triton X-100) med ethidiumbromid (50 ng /ml) og RNase A (50 ug /ml) i 30 minutter i mørk. Fluorescens blev målt på en Calibur flowcytometer. De indsamlede data blev analyseret ved hjælp ModFitLT 3.2 software (Verity Software House, Topsham ME).

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans af forskelle mellem to grupper eller blandt flere grupper blev analyseret med to-sidet uparrede Students t-test (for ens varianser) som gennemføres af Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Alle viste data er gennemsnit SEM af tredobbelte værdier fra tre separate forsøg. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001 sammenlignet med kontrolgruppen. Uafhængig Students t-test eller envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne de kontinuerlige variabler mellem de to grupper eller flere end to grupper. Resultater blev anset for at være statistisk signifikant ved p lt; 0,05. Den cytotoksiske synergi blev analyseret og afbildet grafisk med brug af CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge UK) og blev udtrykt som kombinationsindekset på LC99 (dvs. koncentration dødelig for 99% af cellerne). Yderligere bekræftelse blev opnået med i en 5×5 matrix ved hjælp af en CellTiter-Glo assay og Bliss additive model analyse.

Resultater

Angivelse af p-ERK og p-AKT signaler i NSCLC celler

deregulering af både RAF /MAPK og AKT /mTOR signalveje menes at spille en afgørende rolle i carcinogenese og tumor progression i NSCLC [22]. Talrige komponenter af disse signalveje kan fungere som molekylære mål i kræftbehandling, men det er vigtigt at kende tilstedeværelsen af ​​disse aberrationer i cancerceller til klinisk implikation [23]. Vi først bestemmes baseline udtryk for fosforyleret (p) -Akt og p-ERK 1/2 i vores cellelinjer (fig. 1A). Phosphoryleret ERK signal blev påvist i alle 4-cellelinier, der anvendes i vore forsøg, hvilket tyder på, at ERK-vejen spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft i KRAS eller BRAF muterede celler. Lægemidler rettet mod denne vej kan vise sig virkningsfulde. Imidlertid blev p-AKT svagt påvist i BRAF muterede celler, HCC364 og H1755 sammenlignet med A549 og H460 cellelinjer, som vist i fig. 1A. Dette kan tyde på, at AKT signalvejen ikke kan spille så afgørende en rolle i BRAF muterede celler

A:. Western blot af phosphoryleret AKT og ERK-signalering i native ubehandlet cellelinjer ([+] muteret [-] vild type). Alle baner er fra samme gel og pause blev skabt til kun at omfatte relevante cellelinjer B: A549, H460, H1755 og HCC364 cellelinjer behandlet med D (DMSO) eller angivne stoffer, E (erlotinib), V (vemurafenib), og EV (erlotinib-vemurafenib) blev analyseret efter 72 timer ved en MTS-assay. IC50 for Vemurafenib i HCC364 var 0,8 uM. C: Western blot af forskellige NSCLC cellelinier, der viser ændringer i p-ERK, p-AKT og PARP med køretøjets D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 uM, V (vemurafenib) 1,6 uM, VE (erlotinib + vemurafenib) 1.6 /1.6, pM efter 24h behandling. D: Apoptose ved flowcytometri 48 timer efter behandling med D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 uM, V (vemurafenib) 1,6 uM, VE (erlotinib /vemurafenib 1,6 /1,6 uM). Western blot, post 48h, støtte PARP spaltning med V og EV i HCC364 men ikke H1755 celler.

Erlotinib og vemurafenib

Effekt af kombinationsbehandling med erlotinib og vemurafenib. Kombinationen af ​​en EGFR målrettet monoklonalt antistof (cetuximab) og BRAF (vemurafenib) hæmning havde vist effekt i tyktarmen kræftceller med BRAF mutation [15]. Vi har forsøgt at bestemme, om et lignende koncept med at kombinere BRAF og EGFR hæmninger kunne være effektive i NSCLC-cellelinier. A549, blev H460, H1755 og HCC364 celler behandlet med forskellige koncentrationer af erlotinib, vemurafenib, eller kombinationen af ​​erlotinib og vemurafenib (5-fold seriefortyndinger til enkelte midler og 2,5 gange fortyndinger på 1: 1 forhold af kombinationen). Celleproliferationsassays viste, at kun HCC364 celler følsomme over for vemurafenib og kombinationen af ​​vemurafenib og erlotinib var ikke effektiv (fig. 1B). H1755-celler var mindre følsomme over for vemurafenib og ingen signifikant synergi blev observeret med kombinationen af ​​erlotinib og vemurafenib. Vemurafenib var ineffektiv i KRAS muterede celler (A549, H460). Desuden blev den manglende synergi mellem erlotinib og vemurafenib bekræftet ved hjælp af BLISS metoden (S2 Fig.) [24].

onkogene signalændringer efter behandling i 24 timer med kombinationen af ​​vemurafenib plus erlotinib (1,6 uM /1.6 uM) blev analyseret ved immunblot-assay (fig. 1C). Vemurafenib faldt fosforylering af ERK i HCC364 celler blot uden en efterfølgende stigning i aktiverede AKT. Dette fund antydede, at den manglende synergi mellem erlotinib og vemurafenib set i proliferationsassays skyldes ERK-AKT forhold set i tyktarmskræft og er ikke repræsenteret i HCC364 celler. Dette er sandsynligvis ikke relateret til valget af EGFR inhibitor (cetuximab vs. erlotinib). Vemurafenib alene inducerede aktivering af ERK-signalering i ikke-BRAF muterede celler, A549 og H460. Ingen signifikant ændring i aktiveret ERK blev bemærket i H1755 celler efter vemurafenib behandling. Interessant observerede vi, at kombinationen af ​​vemurafenib og erlotinib resulterede i et fald i aktiveret AKT i KRAS muterede celler (fig. 1C).

Endelig har vi vurderet ændringer i apoptose efter erlotinib og vemurafenib behandlinger alene eller i kombination . HCC364 celler følsomme over for vemurafenib-induceret apoptose og PARP-spaltning, mens H1755-celler var resistente (Fig. 1D). Mekanismen af ​​apoptose blev vurderet ved immunoblot assays efter 48 timers behandling med vemurafenib og det forårsagede en stigning i BIM (pro-apoptotisk), sammenlignet med DMSO. Et fald i MCL-1 (anti-apoptotisk) blev også set med vemurafenib men ingen ændring blev set i BCL-xL (anti-apoptotisk), BCL-2 (anti-apoptotisk), BAK (pro-apoptotisk), og BAX ( pro-apoptotiske) i sammenligning med DMSO (S3 fig.).

Virkning af enkelt middel vemurafenib i BRAF muterede NSCLC cellelinier. blev fundet under anvendelse af en langsigtet vækst assay vemurafenib at være effektiv i BRAF-V600E muteret HCC364 celler og ikke i ikke-V600E BRAF muterede H1755 celler (Fig. 2A). Vi ønskede dernæst for yderligere at vurdere den molekylære mekanisme bag denne anti-tumor aktivitet. Vi analyserede ændringer i cellecyklussen 24 timer efter behandling med vemurafenib i både HCC364 og H1755-celler. I HCC364 celler, vemurafenib forårsagede en signifikant stigning i antallet af G1 celler med et efterfølgende fald i S-fase celler, støtte G1 standsning i V600E muterede celler. Vemurafenib, var imidlertid ineffektiv til at forårsage en G1 blokeret H1755 celler (fig. 2B). Immunoblotting viste ændringer i cellecyklusproteiner i HCC364 celler, efter vemurafenib behandling, herunder, nedregulering af CDK2 udtryk og opregulering af p21 og P27 udtryk (figur 2C.)

A:. Langsigtet vækst assay, 7 dage efter behandling med vehikel-D (DMSO), vemurafenib 50 nM, 500 nM, 5000 nM i både HCC364 og H1755-celler. HCC364 celler var mere følsomme over for vemurafenib. * P 0,05; *** P 0,001 sammenlignet med DMSO. B: Cellecyklus analyser ved flowcytometri 24 timer efter behandling med DMSO, V (vemurafenib) i HCC364 og H1755-celler. Cellecyklusfaser vist, er G1, S og G2 fase. V inducerer standsning af cellecyklus i HCC364 celler, som påvist ved en stigning i G1 og et signifikant fald i S-fase. C: Western blot ved 48 timer efter behandling understøtter beviserne for G1 arrest, der viser stigning i p27 og fald i CDK2 med V (vemurafenib) sammenlignet med D (DMSO). Ingen effekt blev set i H1755 celler. Alle baner til HCC364 og alle baner til H1755 er fra samme gel. Pausen er skabt for at fjerne erlotinib behandlede baner.

Trametinib og vemurafenib

Effekt af kombinationsbehandling med trametinib og vemurafenib. Behandling med en kombination af MEK-inhibitor og BRAF-hæmmer har været effektiv i fremskreden modermærkekræft med BRAF-V600-mutation, men effekten af ​​MEK-hæmmer eller dette tilsvarende kombination er ikke blevet udforsket i BRAF muteret NSCLC [12]. Vi analyserede hvis tilsætning af trametinib til vemurafenib ville vise nogen effekt i BRAF muterede celler, H1755 og HCC364. Trametinib var mere effektiv til at hæmme væksten efter syv dage i begge cellelinier sammenlignet med vemurafenib imidlertid kombinationen af ​​de to lægemidler ikke var signifikant forskellig fra trametinib alene (fig. 3A, B). Vi evaluerede forskelle i cellecyklus for både BRAF mutant NSCLC celler efter en 24 timers behandling med DMSO, vemurafenib, trametinib og kombinationen (fig. 3C). Både vemurafenib og trametinib var effektive til at forårsage G1 arrest som vist ved en betydelig stigning i G1-fasen og et fald i S-fase celler sammenlignet med DMSO behandling. Kombinationen var ikke mere effektivt end nogen af ​​de enkelte midler alene. Cellecyklusstandsningen observeret med flowcytometri i HCC364 celler blev bekræftet ved immunoblot assay for cellecyklusproteiner efter 24 timers behandling med respektive midler. Det viste nedregulering af CDK2 med opregulering af p21 og p27 med vemurfenib, trametinib og kombinationen sammenlignet med DMSO (fig. 3D). Der var dog ingen forskel bemærket i cellerne behandlet med trametinib, vemurafenib, eller kombinationen af ​​trametinib plus vemurafenib i udtrykkene for CDK2, p21 eller p27 i disse celler (fig. 3D). Derudover har vi ikke observere nogen forskel i pJAK2 og pSTAT3 udtryk (S4 Fig.) Interessant havde H1755 celler ikke udviser en lignende tendens i CDK2 eller p21 og p27 trods G1 anholdelse og fald i S-fasen set med flowcytometri ( fig. 3D). Det gør os til at tro, at der er en anden mekanisme, der er involveret i G1 anholdelse, som er uafhængig af CDK2 nedregulering i disse celler

A, B:. Langsigtet vækst assay, 7 dage efter behandling med køretøj-DMSO (D ), V (vemurafenib) 1 uM, T (trametinib) 1 uM og TV (trametinib + vemurafenib, 1 uM hver) i HCC364 (A), og H1755-celler (B). C: Cell cyklus analyser ved flowcytometri i HCC364 og H1755-celler efter 24 timers behandling med D, V 0,5 uM, T 0,5 uM, TV 0,5 /0,5 uM. D: Western blot efter 24 timer af H1755 og HCC364 behandlet som i C. (*** p 0,001 i forhold til DMSO)

Vi udforskes yderligere apoptotiske effekt af kombinationen vemurafenib og trametinib i. BRAF muteret NSCLC-celler. Trametinib induceret apoptose i både BRAF muterede cellelinjer. Kombinationen af ​​vemurafenib og trametinib forårsagede signifikant højere apoptose end både enkeltstof i HCC364 og H1755 (fig. 4A). Apoptose efter forskellige doser af trametinib behandling blev bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​PARP-spaltning i HCC364 celler, hvorimod en formindskelse i PARP blev set i H1755-celler uden tilstedeværelsen af ​​spaltet PARP (Fig. 4B). Forekomsten af ​​apoptose blev yderligere understøttet af opregulering af pro-apoptotisk protein, BIM, både HCC364 og H1755 celler efter behandling med trametinib. Kombinationen forårsagede større forøgelse af BIM sammenlignet med trametinib alene. Denne iagttagelse antyder, at kombinationen af ​​vemurafenib og trametinib er bedre til at fremme apoptose end trametinib alene i BRAF muterede celler (fig. 4C). Der blev ikke observeret nogen signifikante ændringer i ekspression af BCL-2, BCL-xl, MCL-1, BAX og BAK

A:. Apoptose ved flowcytometri, 48h efterbehandling med køretøj-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 uM), T (trametinib 1 uM), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 uM) i HCC364 og H1755 celler. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001). B: Western blot af spaltet PARP i HCC364 og H1755, 48 timer efter behandling med D (DMSO) og varierende doser af vemurafenib (0,25, 0,5, 1 pM) og trametinib (0,25, 0,5, 1 pM) C: Western blot, der viser ændringer i ERK, AKT, BIM, PARP spaltning, 48h efterbehandling med køretøj D (DMSO), V (vemurafenib 1 uM), T (trametinib 1 uM), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 uM) i HCC364 og H1755 celler. Fire baner blev behandlet i dubletter for hver cellelinjer og kun den venstre 4 baner af hver cellelinjer er vist i figuren.

Trametinib som et enkelt middel i BRAF muteret NSCLC. MEK inhibitor, er selumetanib vist sig at nedregulere ERK-signalering i prækliniske lunge modeller med KRAS muteret NSCLC, men en lignende effekt er ikke påvist i BRAF muteret NSCLC [25]. Vi ønskede at sammenligne de onkogene signal ændringer som følge af indførelsen af ​​en BRAF inhibitor, en MEK-inhibitor, eller en kombination af begge i BRAF muteret NSCLC. Ændringerne i onkogene signaler blev evalueret ved at udføre et immunoblot assay til at vurdere ændringer i apoptose signaler i begge celler med vemurafenib vs. trametinib vs. kombinationen ved 48 timers behandling med 1 uM dosis af enkelte midler og 1: 1-forhold af kombinationen, 1: 1 pM doser hver. Vi observerede, at behandling med trametinib forårsagede en signifikant undertrykkelse i phosphorylering af ERK sammenlignet med DMSO eller vemurafenib alene i både HCC364 og H1755 celler (Fig. 4C). Kombinationen af ​​trametinib og vemurafenib var ikke bedre end trametinib alene. Derudover har vi bemærket, at Pakt ikke var forhøjet i HCC364 celler med anvendelse af enten enkelte midler eller kombination (p-AKT blev svagt påvist i HCC364 celler og ekspressionen ændrede ikke-immunoblot er ikke vist). Men så vi en stigning i p-AKT udtryk med brug af enkeltstofbehandling trametinib i ikke-V600E BRAF muteret H1755 celler og interessant kombination af trametinib og vemurafenib ikke viser en stigning i p-AKT sammenlignet med DMSO, tyder på, at måske p-AKT pathway kan spille en rolle i resistens over for behandling med enkelt middel trametinib. Trametinib er også effektivt til at forårsage apoptose i både HCC364 og H1755-celler (fig. 4A). Derudover trametinib forårsagede også G1 arrest i begge BRAF muterede celler (fig. 3C). Selvom ændringerne i cellecyklusproteiner, nedregulering af CDK2 og opregulering af p21 og P27 udtryk, blev kun set i HCC364 celler.

Diskussion

BRAF vej spiller en vigtig rolle i tumorigenese i NSCLC, BRAF inhibitorer, vemurafenib og dabrafenib har vist kun beskedne effekt i BRAF-V600E mutante cancere [11,13]. Trods målretning denne specifikke mutation, anvendelse af dabrafenib, i NSCLC med BRAF-V600E mutation har resulteret i kun 40% responsrate sammen med en skuffende 30% sygdomsprogression [11]. Disse resultater afspejler, at BRAF hæmning alene er ikke en ideel behandlingsmulighed og nyere strategier for optimeret og effektiv behandling af denne udvalgt gruppe af patienter er berettiget. Denne hypotese understøttes også af en klinisk undersøgelse i melanom viser en betydelig fordel i progressionsfri overlevelse med kombination af dabrafenib plus trametinib vs. dabrafenib alene [12]. Vores in vitro eksperimenter bekræftede, at vemurafenib er effektiv til inhibering vækst, faldende ERK-signalering, og inducere apoptose i BRAF V600E mutante cellelinie HCC364, mens i ikke-V600E BRAF mutant cellelinje, H1755, ikke var så følsomme. Prahallad

et al.

, Har vist øget aktivitet ved kombineret behandling af EGFR inhibitor cetuximab med vemurafenib ved at knytte ERK og AKT signalering gennem mellemled Cdc25C i BRAF muterede kolon kræftceller [15]. Men vores resultater afspejler, at kombinationen af ​​erlotinib og vemurafenib er ikke effektiv i NSCLC celler. Selv om vi var i stand til at opdage Cdc25C i BRAF mutant cellelinjer HCC364 (V600E) og H1755 (ikke-V600E), disse celler ikke reagerer på ERK hæmning med forbedret AKT aktivering tyder på, at ERK og AKT signalering ikke er forbundet via Cdc25C i disse celler.

Vemurafenib kunne modulere apoptose relaterede proteiner og cellecyklussen [26,27]. Vi fandt, at behandling med vemurafenib resulterede i reducerede niveauer af anti-apoptotiske protein MCL-1 og forhøjede niveauer af det pro-apoptotiske protein BIM i NSCLC cellelinjer. MCL-1 tab sammen med øget BIM [28-30], fører til apoptose induktion, og øgede niveauer af BIM kan også initiere apoptose [31-33]. Derudover cellecyklussen-relateret protein, CDK2, blev nedreguleret mens cellecyklusinhiberende proteiner, p21 og p27, blev opreguleret efter vemurafenib behandling i HCC364 celler, hvilket resulterer i vækststandsning. Vi spekulere, at disse proteinekspressionsplasmider ændringer sandsynligvis er relateret til reduceret aktivitet af ERK [34,35], eftersom lignende virkning sås ved behandling med trametinib (fig. 3D). Dette styrker vores hypotese, at modulering af BIM og MCL-1 er relateret til reduceret aktivitet af ERK i HCC364 celler. Desværre, H1755, BRAF-ikke-V600E celler, viste G1 cellecyklusstandsning afhængig nedregulering af ERK ved behandling med trametinib. Cellecyklusstop sket uden ændring af cellecyklusproteiner, CDK2, p21 og p27. Dette antyder, at H1755-celler kan have en anden mekanisme involveret i G1 arrest uafhængig af CDK2 kontrolpunkt i cellecyklussen.

Vores resultater viser trametinib er effektiv til at forårsage apoptose i både BRAF V600E og ikke-V600E muterede celler. Trametinib var potent i faldende ERK signalering i BRAF mutant celler, og denne undertrykkelse er mere udtalt med trametinib sammenlignet med vemurafenib selv i BRAF V600E muterede celler. De langsigtede vækst analyseresultater viser også, at trametinib har bedre effekt som enkeltstof i forhold til vemurafenib i BRAF V600E celler, men dette kunne være som et resultat af en kortere halveringstid vemurafenib [36,37]. Interessant behandling med enkelt middel trametinib forårsaget opregulering af AKT signalering i BRAF ikke-V600E kun celler, hvilket antyder en potentiel escape mekanisme til udvikling af resistens over for behandling med MEK-inhibitor alene. Det kan give et indblik i udviklingen af ​​resistens over for MEK-inhibitorer. Den AKT pathway syntes ikke at være opreguleret når BRAF ikke-V600E celler blev behandlet med kombinationen af ​​trametinib og vemurafenib, hvilket antyder, at kombinationsterapien kan være overlegen i forhold til hver af de to enkelte midler i denne gruppe. Den mekanistiske forhold mellem ERK hæmning og AKT aktivering i BRAF mutant NSCLC af MEK-inhibitor skal evalueres yderligere. Vi viste også for første gang, at kombinationsbehandlingen forårsagede en signifikant stigning i opregulering af BIM i både V600E og ikke-V600E celler, spiller således en væsentlig rolle i apoptose [31]. Kombinationsbehandlingen også forårsaget lille, men en betydelig forøgelse i apoptose i BRAF muterede celler sammenlignet med enkelt middel, hvilket tyder rationalet for at anvende en kombination af BRAF og MEK-inhibitor i denne udvalgte gruppe. Desuden kunne kombinationen af ​​trametinib og vemurafenib overvinde modstanden mod trametinib alene, og dermed bedre end monoterapi trametinib. Lupus et al. har understreget mulig mekanisme bag modstanden i BRAF-V600E muterede NSCLC celler til BRAF-hæmmer [38]. De to diskrete molekylære mekanismer for erhvervelse BRAF inhibitor resistens omfatte tab af fuld længde i BRAF-V600E koblet med ekspressionen af ​​en afvigende form af BRAF-V600E der bevarer RAF pathway afhængighed og konstitutiv autokrin EGFR signalering drevet af c-Jun-medieret EGFR ligand ekspression. Vores resultater understøtter hypotesen om BRAF- mutation uafhængig aktivering af MAPK sti, der fører til udvikling af resistens over for BRAF-hæmmer ved behandling BRAF-V600E muteret NSCLC. Derudover bivirkning og toksicitetsprofil (19% af kutant pladecellecarcinom i BRAF inhibitor arm

vs

. 7% i kombinationen arm i melanomapatienter) begunstiger kombinationsterapien [12].