PLoS ONE: påvisning af Methyleret WIF-1 Gene er mere præcis end en Fækal okkult blodprøve for tarmkræft Screening

Abstrakt

Baggrund

Den kliniske fordel ved guajak fækal okkult blod tests (FOBT) er nu veletableret for kolorektal cancer screening. Voksende beviser har vist, at epigenetiske modifikationer og fecal mikrobiota forandringer, også kendt som dysbiosis, er forbundet med CRC patogenese og kan anvendes som surrogatmarkører for CRC.

Patienter og metoder

Vi udførte en tværsnitsundersøgelse, der omfattede alle fortløbende emner, der blev nævnt (2003-2007) til screening colonoscopies. Forud for koloskopi, blev spildevand (friske afføring, sera-S og urin-U) høstet og FOBTs udført. Methylering niveauer blev målt i afføringen, S og U i 3 gener (Wif1, ALX-4, og vimentin) udvalgt fra et panel af 63 gener; KRAS-mutationer og syv dominerende og subdominante bakterielle befolkninger i afføring blev kvantificeret. Kalibrering blev vurderet med Hosmer-Lemeshow chi-square, og diskrimination blev bestemt ved at beregne C-statistik (Area Under Curve) og Net Reklassifikation Improvement indeks.

Resultater

Der var 247 personer (gennemsnitsalder 60,8 ± 12,4 år, 52% af mænd) i studiegruppen, og 90 (36%) af disse personer var patienter med fremskredne polypper eller invasive adenokarcinomer. En multivariat model justeret for alder og FOBT førte til en C-statistik på 0,83 [0,77-0,88]. Efter supplerende sekventiel (én efter én) justering, WIF-1 methylering (S eller U) og fækal mikrobiota dysbiosis førte til stigninger i C-statistik til 0,90 [0,84-0,94] (p = 0,02) og 0,81 [0.74- 0,86] (p = 0,49), hhv. Korrigeret fællesskab for FOBT og WIF-1 methylering eller fækal mikrobiota dysbiosis, stigningen i C-statistik var endnu mere signifikant (0,91 og 0,85, s 0,001 og p = 0,10, henholdsvis)

Konklusion

påvisning af methylerede WIF-1 i enten S eller U har en højere ydeevne nøjagtighed i forhold til guaiac FOBT for fremskreden kolorektal neoplasi screening. Omvendt fækal mikrobiota dysbiosis opdagelse var ikke mere præcis. Blod og urin test kan anvendes i de personer, tilbageholdende med at gennemgå afføring test

Henvisning:. Amiot A, Mansour H, Baumgaertner I, Delchier J-C, Tournigand C, Furet J-P, et al. (2014) påvisning af Methyleret WIF-1 Gene er mere præcis end en Fækal okkult blodprøve for tarmkræft Screening. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10,1371 /journal.pone.0099233

Redaktør: Anthony W. I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Februar 3, 2014 Accepteret: 13. maj 2014 Udgivet: 15 jul 2014

Copyright: © 2014 Amiot et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Cancéropole Ile de France, comica 2007-2010 projekt, (Charles Debray association-ACD); LNCC (fransk National League mod kræft), CCR INSERM Promotion (2004-2006). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Konkurrerende interesser findes for I. Sobhani og Wif1 testmarkøren (registreret patent), og for JP Carrau for FOB test (leder af laboratoriet).

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en betydelig årsag til morbiditet og mortalitet i udviklede lande. Forekomsten af ​​CRC er vokset med 3 til 4% om året siden 1970’erne [1], [2]. I de fleste tilfælde er den naturlige historie CRC indeholder en progression fra polypper til avanceret CRC, der giver mulighed for tidlig påvisning hos symptomfri patienter. Screeningen koloskopi, “gold-standard metode”, fleksibel sigmoidoskopi, og computertomografi kolografi har vist sig at være effektive til CRC-screening ved at demonstrere en reduktion i CRC forekomst og dødelighed [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. Men i de fleste lande, er ingen af ​​disse metoder i øjeblikket anbefales til CRC masse screening på grund af de iboende begrænsninger, som omfatter tarm forberedelse, høje omkostninger, lave compliance satser, og lejlighedsvise bivirkninger. I de seneste årtier er der gjort forsøg at oprette minimalt invasive test for CRC-screening. Den guaiac fækal okkult blodprøve (FOBT) har vist sig at reducere CRC dødelighed i tre randomiserede, kontrollerede forsøg og en populationsbaseret undersøgelse [7], [8], [9], [10]. Men FOBT har en lav følsomhed og en meget begrænset indvirkning på adenom-karcinom overgang, sandsynligvis fordi tidlige forstadier til kræft kun producerer lave koncentrationer af blod i afføringen [11], [12]. Den kvantitative immunkemiske FOBT har for nylig vist en højere følsomhed i detektion af avancerede neoplasier [13]. Imidlertid er der stadig et behov for en mere præcis test for at forbedre screening performance.

I de fleste tilfælde, nedarvede genetiske faktorer gør et mindre bidrag til modtagelighed for at udvikle CRC, mens de store bidragsydere er miljøfaktorer [14]. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at CRC udvikling var forbundet med aldring, men også med moderne vestlige livsstil og kosten komponenter [1], [15].

afvigende methylering af CpG-rige sekvenser (CpG øer) er en epigenetisk forandring, der inducerer den transkriptionelle inaktivering af tumorsuppressorgener [16]. Disse genændringer kan induceres ved kemiske og /eller miljømæssige faktorer [1]. Hypermethylering af CpG-øer i tumorsuppressorgener er blevet rapporteret i neoplastisk væv af CRC patienter, såvel som i præmaligne læsioner [17]. Det er kendt, at afvigende methylering eksisterer i cirkulerende DNA, såsom den, der findes i afføringen, serum, urin og andre kropsvæsker, og kan anvendes som en biomarkør for cancer screening [18], [19].

på det seneste mikrober koloniserer mavetarmkanalen, som er vigtige aktører i biologiske miljøer, er blevet mistænkt for at spille roller i forekomsten af ​​CRC [20]. Faktisk har ændringer i den luminale eller omliggende intestinal mikroflora, såkaldte dysbiosis, vist i CRC patienter [21], [22]. I dyremodeller er bidraget af bakterier til ætiologien af ​​CRC blevet undersøgt, og det er blevet foreslået, at de kan virke gennem inflammatoriske pathways, selvom også kunne mistænkes en direkte genotoksisk virkning af bakterier [23]. For nylig demonstrerede vi, at afføring transplantation fra humane patienter med CRC til kimfrie mus kunne fremkalder stigninger intestinale præcancerøse begivenheder gennem værtsgenet ændring, celleproliferation og metabolisme i slimhinden [24]. Derfor kunne ændringer i det fækale mikrobioter anvendes som biomarkører for CRC-screening.

I den foreliggende undersøgelse, undersøger vi udførelsen nøjagtigheden af ​​nye screeningstest for CRC målretning af methylering niveauer af et panel af 63 gener i afføringen , blod og urin, og sammensætningen af ​​fækalt mikrobiota blev vurderet ved qPCR. Sidstnævnte tests blev sammenlignet med guaiac FOBT på et hospital-baseret population af individer, der tilhører grupper på gennemsnit eller høj risiko for CRC.

Patienter og metoder

studiepopulation

fra 2003 til 2007 247 konsekutive ambulante patienter (gennemsnitsalder 60,8 ± 12,4, 129 mænd) med en gennemsnitlig eller høj risiko for CRC (historie af kræft i pårørende, personlig tidligere historie af polypper, eventuelle abdominal eller tarm symptomer, eller anæmi der kræves koloskopi), indgik i en stikprøve bank samling undersøgelse. For at være berettiget til optagelse, patienterne skulle have nogen tidligere historie af følgende: kolorektal kirurgi, sygdomme såsom inflammatoriske eller infektiøse læsioner i tarmen, eller et behov for en nødsituation koloskopi. Undersøgelsen fandt sted i to afdelinger (Gastroenterology og Onkologi) af en universitetshospital i Paris-området i Frankrig.

To uger før koloskopi og efter at give skriftligt informeret samtykke, patienter blev inkluderet i undersøgelsen og var bedt om at give frisk afføring, urin og blodprøver inden for 2 uger, men op til tre dage før koloskopi. I alle tilfælde blev afføringsprøver indsamlet før tarm udrensning for koloskopi. Eventuelle særlige diæter (diabetikere, vegetarer) og medicin (anti-diabetiske lægemidler, hypocholesterolemics og afføringsmidler) i denne periode blev registreret. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Val de Marne Paris-EST-området, der har godkendt rekrutteringen af ​​patienter i alle tilknyttede centre (nummer 2004-4 CCPPRB). Alle patienter fik information om studiet, dets mål, og prøver de ville give. Alle oplysninger blev givet af en maskinskrevet brev skrevet på fransk, og formel skriftlig tilladelse blev opnået på en tredobbelt kopi form en kopi af formularen blev tilbageholdt af patienten, vi beholdt en kopi på afdelingen for klinisk forskning (CIC) og den sidste kopi blev tilbageholdt af promoteren (National Institute for videnskabelig forskning i medicin-INSERM). Således er en formel tilladelse var til rådighed for hver patient. Detaljerede interviews til sygehistorie og fysiske undersøgelser blev udført.

guaiac fækal okkult blodprøve

guaiac Hemoccult blev udført (udført i et certificeret laboratorium af de franske myndigheder i Paris) på alle emner enige til at deltage i undersøgelsen. For FOBT, blev en prøve pr afføring fra 3 på hinanden følgende afføring påkrævet. I overensstemmelse med det igangværende program, blev en specifik diæt (meatless i 3 dage) anbefales. Emner indsamlet 3 prøver selv derhjemme (ved hjælp af kit kort til Hemoccult), indspillet datoen for hver afføring involveret, og sendt testene med posten. Den Hemoccult læsning blev udført blindt af certificerede teknikere uden rehydrering, ifølge protokollerne af den nationale organiserede screeningsprogram. Screening blev betragtet positiv, hvis Hemoccult testen var positiv (mindst 1 af de 6 slots var positiv).

Screening koloskopi

Alle individer undergik en koloskopi undersøgelse under bedøvelse. Højre og venstre kolon sites samt endetarmen, var fuldt undersøgt hos alle patienter. Koloskopi resultater blev registreret efter den sædvanlige proces for et organiseret screeningsprogram i Frankrig. Polypper blev fuldstændigt fjernet under endoskopi undersøgelse under anvendelse mucosectomy, hvis det kræves. Koloskopi blev betragtet som den gyldne standard metode. Koloskopi resultater blev klassificeret i henhold til den mest avancerede patologisk læsion fundet. Avancerede neoplasmer inkluderet avancerede adenomer (adenomer måling 10 mm eller adenomer med high-grade dysplasi eller in situ carcinom) og invasive CRC (invasion af maligne celler uden for muscularis slimhinder). Hyperplasisk polypper ikke medtaget, da neoplasmer.

Kvantificering af methylering ved kvantitativ PCR

I alt DNA blev isoleret fra urin, serum og afføringsprøver ved hjælp af Qiamp DNA Mini (Qiagen) og derefter omdannet med natriumbisulfit og amplificeret under anvendelse locusspecifikke PCR-primere, der flankerer en MGB probe. Methyleringen for hver patient blev bestemt som beskrevet af Eads et al [25]. PCR-betingelserne var 94 ° C i 10 minutter for enzymaktivering, 45 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder til annealing og forlængelse af PCR. Vi bekræftede methylering resultater ved direkte bisulfit genomisk sekventering hos 5% af påvirkede patienter undersøgt for deres væv at udelukke en teknisk artefakt. Et panel af 63 gener (data ikke vist), der udvindes fra litteraturen blev først evalueret, og derefter 3 gener af interesse (Wif-1, ALX-4 og vimentin) blev udvalgt på basis af deres diskriminerende værdier, som blev bestemt ved sammenligninger mellem tumor og normale homologe tarmvæv [26]. Effektiviteten af ​​primerne af målgener (Wif1, ALX4 og vimentin) og husholdning genet (Albumin BSP) til indtastning af modificeret DNA blev vurderet ved anvendelse seriefortyndinger af methylerede modificerede DNA kontroller som vist i fig S1). Efter en feasibility sæt af forsøg udført på 48 patienters afføring, urin og serumprøver, besluttede vi at måle kun WIF-1 methylering niveauer i valideringen sæt i henhold til de højere følsomhed og specificitet satserne for WIF-1-genet i forhold til ALX- 4 og vimentin. Grunder og probesekvenser for methylering af målgener er anført i tabel S1.

Bakteriel analyse af fækale prøver ved anvendelse af kvantitative PCR

hele friske afføring blev indsamlet i sterile bokse, og, inden for 4 timer , 10 g, blev nedfrosset ved -80 ° C til analyse. Bakterielt DNA blev ekstraheret fra aliquoter af afføring, og efter den endelige præcipitation blev DNA resuspenderet i 150 pi TE-buffer og opbevaret ved -80 ° C til yderligere analyse, som beskrevet tidligere [26]. Vi anvendte en real-time qPCR teknik til at undersøge forskellen i bakterielle densiteter inden mikrobiota mellem normal og avanceret neoplasi og kræftpatienters afføring. Primerne og proberne anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet andetsteds [26] og er vist i tabel S2. Real-time qPCR blev udført under anvendelse af en ABI 7000 Sequence Detection System med softwareversion 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, USA), og det samlede antal bakterier blev udledes de midlede standardkurver og udtrykt som log10-værdierne, som tidligere beskrevet [26]. qPCR værdier blev opnået per patient og for hver tarmens mikrobiota komponent. For at kompensere for det faktum, at de fækale prøver kan indeholde mere eller mindre vand, dataene for hver fækal prøve blev normaliseret som tidligere beskrevet [26]. Indholdet var for hver særlig dominerende og sub-dominant bakteriepopulation blev trukket fra alle-bakterieindhold, og resultaterne er udtrykt som logaritmen af ​​antallet af bakterier per gram fæces. Disse assays blev anvendt til at sammenligne sammensætningen af ​​den intestinale mikroflora i samtlige emner, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD.

KRAS mutationsanalyse

DNA blev amplificeret på dubletter ved PCR med en allel-specifikke primer sæt omfatter exonerne 12 og 13 i KRAS-genet [27]. PCR-betingelserne var 94 ° C i 10 minutter, 45 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder og 60 ° C i 60 sekunder til annealing og forlængelse af PCR. To sæt PCR-primere og prober blev anvendt: ét sæt var specifik for vild allel DNA og det andet sæt repræsenteret mutationen allel. Grunder og probesekvenser er anført i tabel S3.

Statistisk analyse

Hver patientens karakteristika beskrives som et antal (%) for kvalitative data og som median (interkvartile område, IQR) eller betyde (± 1 standardafvigelse, SD) for kvantitative data i henhold til deres distribution. Vi sammenlignede baseline karakteristika for patienter i begge grupper (avancerede neoplasi og kontrolgrupper) ved hjælp af Pearson chi-square test eller Fishers eksakte test for kvalitative variabler og Wilcoxon non parametriske eller Kruskal- Wallis test for kvantitative variable. Spearman to-halet test blev anvendt til at vurdere sammenhænge.

De odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) for hver parameter blev estimeret ved hjælp af separate logistiske regressionsanalyser. De fækale mikrobiota dysbiosis resultater blev givet for en SD af log-transformerede niveauer beregnet for hver kontrolgruppe. Analysen var systematisk alder justeret til at estimere uafhængigt udførelsen nøjagtigheden af ​​hver screeningstest. Alder blev håndteret i kontinuerlig efter kontrol normalitet antagelse. Kalibrering af hver model blev anslået af Hosmer-Lemeshow statistik, hvor en

s

værdi større end 0,20 indikerer tilstrækkelig pasform. Diskrimination af vores model blev vurderet af C-statistik (arealet under ROC-kurven), der blev beregnet ud fra multivariat logistisk regressionsmodel. De C-statistik af modellerne med og uden avancerede neoplasi blev sammenlignet ved hjælp af en ikke-parametrisk test udviklet af Delong et al og passende for ikke-uafhængige data [28]. En resampling bootstrap analyse med 1000 gentagelser af baseline datasæt blev udført for at estimere 95% CIs af C-statistisk materiale fra de multivariate modeller. Forskelsbehandlingen blev også kvantificeret ved at beregne Net Reklassifikation Improvement indeks (NRI) [29].

Alle sammenligninger var to-sidet og en

s

værdi på mindre end 0,05 indikerede en statistisk signifikant forskel . Analyser blev udført ved hjælp af STATA softwareversion 12.0 (Stata- Corp, College Station, TX, USA).

Resultater

studiepopulation

To hundrede syvogfyrre patienter blev inkluderet i undersøgelsen. Kendetegnene for undersøgelsespopulationen er anført i tabel 1. Alle personer gennemgik en koloskopi med fuld undersøgelse af højre og venstre tyktarm og endetarm. Patienterne blev derefter klassificeres som følger: normale individer, der præsenteres med enten normal koloskopi (n = 123) eller små adenomer mindre end 1 cm i diameter (n = 34) blev heri betragtet som kontroller og patienter med neoplasi som præsenteres med CRC ( n = 66) eller store ( 1 cm i diameter) adenomer (n = 24) blev heri betragtet som sager. Det gennemsnitlige tilfælde var mere end 10 år ældre end den gennemsnitlige kontrol patient. patienter De kontrol mindre hyppigt rapporteret en tidligere personlige historie af polypper og tyktarmskræft i deres familie i forhold til sagerne. De to grupper var lige afbalanceret til BMI, co-morbiditet, medicin optagelse samt mad regime (tabel 1).

Analyse af guajak-baserede Fækal okkult blodprøve Hemoccult

Hemoccult test var ikke tolkes i 2 tilfælde. Samlet set FOBT var positiv i 46 patienter, hvoraf 36 (78%) havde avanceret neoplasi, herunder 33 (72%) CRCs. Blandt de 199 patienter med negative FOBTs, 146 (73%) patienter havde normale colonoscopies eller små adenomer mens 53 (27%) havde avanceret neoplasi, herunder 33 (17%) med CRC. Således følsomheden og specificiteten af ​​FOBT for avancerede neoplasmer var 40,4% og 93,6%, henholdsvis.

Methyleret Wif-1, ALX-4, og vimentin i serum, urin og afføring

de methylering niveauer i Wif-1, ALX-4 og vimentin generne blev først vurderet i fækale prøver. I den samlede befolkning, blev hypermethylering af WIF-1, ALX-4 og vimentin gener observeret hos 7,3%, 4,5% og 0,8%, henholdsvis (Tabel 2). For hvert gen (WIF-1, ALX-4 og vimentin), afvigende methylering var signifikant hyppigere i tilfælde patienter sammenlignet med kontrol patienterne (19,3%

vs.

0,6%, 10,6%

vs.

1,3% og 32,6%

vs

. 0,0%, henholdsvis) (tabel 2). For hvert gen, specificiteten var over 98%, men med en lav følsomhed under 25%. På Wif-1 og ALX-4-generne, men ikke vimentin genet, methylering niveau var signifikant mere ophøjet i tilfælde patienter sammenlignet med kontrolindivider (figur 1).

methylering niveauer af Wif-1, ALX-4, og vimentin blev derefter vurderet i urin- og serumprøver. Wif-1 viste sig at være den mest følsomme markør for avancerede neoplasi i enten urin eller serum prøver (52% og 29%) sammenlignet med ALX-4 og vimentin (23% og 15% vs. 4% og 8%, henholdsvis). Specificitet var højere end 93% i alle tilfælde. Kombinationen af ​​urin og serum WIF-1 methylering niveau førte til en højere følsomhed på 60,4% [30].

methylering niveau WIF-1 blev derefter vurderet i enten urin eller serumprøver for hele validering kohorte, som omfattede 247 patienter. Hypermethylering af WIF-1 blev observeret i urin og serumprøver i 26,7% og 32,6% af tilfældene, og i 1,3% og 1,3% af kontrolpersoner, (p 0,001 og p 0,001). Kombinationen af ​​serum og urin rejst detekteringshastigheden neoplasi til 47,8% i tilfælde, sammenlignet med 2,5% i kontroller (tabel 2). Methyleringen niveau var signifikant mere ophøjet i tilfælde sammenlignet med kontroller i enten serum eller urinprøver (figur 1). Ingen forskel blev fundet for forskellige stadier af tyktarmskræft i henhold til amerikanske Blandede kræft klassificering

Fækal mikrobiota dysbiosis i avancerede adenomer ( 10 mm). Og colorectal cancer

fækal mikrobiota sammensætning var tilgængelig for alle de emner og er vist i tabel 3. i tilfælde patienter, fækal mikrobiota dysbiosis var præget af en højere tæthed af arter, der tilhører den

Bacteroides /Prevotella

gruppe vs. kontrol. I betragtning af alle personer sammen,

Bacteroides /Prevotella

gruppe var ikke knyttet til alder (r = 0,09; p = 0,62) eller BMI (r = 0,20 og p = 0,24)

Kras mutationsanalyse i afføringsprøver

KRAS-mutationer (exon 12 og 13) i fæcesprøver blev fundet i 16 (18%) patienter med fremskreden neoplasi sammenlignet med 16 (10%) individer i kontrolgruppen. Følsomheden og specificiteten var 17,8% og 89,8% for b Kras mutationer, hhv. Ingen korrelation blev fundet mellem Kras mutationer og mikrobiota ændringer eller WIF-1 methylering, når det blev behandlet i afføring, blod eller urinprøver.

Nøjagtighed af screeningstest for at identificere avanceret neoplasi

De multivariate yderste periferi for hver parameter for tilstedeværelsen af ​​avancerede neoplasi er vist i tabel 4. i en multivariat model justeret for alder, hankøn [OR = 2,02; CI95% (1,07-3,82), p = 0,03], historie af polypper [OR = 0,24; CI95% (0,11-0,55), p = 0,001] og familiær historie med CRC [OR = 0,50; CI95% (0,27-0,95), p = 0,03), blev uafhængigt forbundet med tilstedeværelsen af ​​avancerede neoplasi.

Når alder og resultaterne af FOBT blev behandlet i den samme model (model 1) blev en positiv FOBT uafhængigt associeret med avancerede neoplasi. På lignende model med resultaterne af urin eller Wif-1 methylering testserum (model 2), en positiv Wif-1 methylering test blev stærkt forbundet med fremskreden neoplasi (nedre grænse på 95% CI: 18,7). Justering med både FOBT og urin eller WIF-1 methylering testserum (model 3), viste, at urin eller WIF-1 methylering testserum stærkt forblev forbundet med fremskreden neoplasi (nedre grænse på 95% CI: 14,41), mens FOBT ikke længere signifikant.

Når alder og fækal mikrobiota dysbiosis blev anset, kun det

Bacteroides /Prevotella

gruppe blev forbundet med fremskreden neoplasi (model 4). Når fækal mikrobiota dysbiosis og resultaterne af FOBT blev behandlet i den samme model (model 5), er det kun FOBT var forbundet med fremskreden neoplasi.

Bidrag af hver model til avanceret neoplasi forudsigelse

den goodness of fit af forudsigelsen model, der kun omfattede alder og FOBT var passende (

s

værdien af ​​Hosmer Lemeshow statistik = 0,58). Som vist i tabel 4, nøjagtigheden (vurderet ved C-statistik) af denne model var signifikant lavere end urinen og /eller Wif-1 methylering testserum (model 2 øgede C-statistik på 8,6%). Denne forbedring (vurderet ved C-statistik og Net Omklassifikation Improvement Index) var signifikant højere i den model, der kombinerede urin og /eller Wif-1 methylering testserum og FOBT (model 3 øgede C-statistik på 9,8%, og NRI på 22,8%). Testning for fækal mikrobiota dysbiosis (model 4) havde nøjagtighed svarende til FOBT. Kombinere FOBT og test for fækal mikrobiota dysbiosis øgede ikke sidstnævnte nøjagtigheden af ​​modellen (model 5 ikke øge C-statistik og NRI).

Diskussion

CRC er en væsentlig årsag af dødelighed og en økonomisk byrde i de udviklede lande. Forsøget på at reducere dødeligheden af ​​sygdommen har medført offentlige sundhedssystemer at prioritere masse screeninger bruger FOBT i asymptomatiske individer. Faktisk er det blevet påvist, at FOBTs reducerede CRC-associeret dødelighed [7], [8], [9], [10]. Selv immunokemisk måling af hæmoglobin er blevet vist at være mere sensitive end FOBT med lignende specificitet, at det store antal personer, der er tilbageholdende udføre det fækale prøve kan begrænse dets anvendelse. Effektiviteten af ​​sådanne strategier afhænger hovedsageligt af accept og omkostningseffektiviteten af ​​screeningsmetode. I denne indstilling, kunne blod og urin test bruges i individer potentielt tilbageholdende med at indsende til afføring test.

I denne undersøgelse sammenlignede vi den diagnostiske ydeevne methylerede WIF-1, et udskilt antagonist af Wnt signalvejen , som biomarkør for fremskreden kolorektal neoplasi i fæces, serum- og urinprøver. Vi inkluderede også kliniske karakteristika i udvælgelsesprocessen, og udførte potentielle FOBTs som en guld standard. Vi fandt, at methyleret Wif-1 havde den højeste diagnostiske resultater til at forudsige avanceret neoplasi sammenlignet med kliniske karakteristika, FOBTs og mikrobiota ændringer, alene eller i kombination. Dette fund er af stor interesse, fordi et betydeligt antal patienter afslå at udføre FOBT [31].

Således for FOBT resultater i den foreliggende undersøgelse blev anvendt Wif-1, for at overvinde begrænsningerne i FOBT fordi af dens tilsvarende diagnostisk ydeevne, med 47,8% følsomhed og 97,5% specificitet. Kolorektal cancer neoplastiske celler har vist sig at være en stor paradigme på grund af heterogenitet af de molekylære veje impliceret i deres udvikling [32], [33], [34], [35]. I de fleste tilfælde den initiale genomiske ændring af

APC /Wnt

signalvejen efterfølges af akkumulering af ekstra driver mutationer [36]. Dette forhold har ført forskere til at tro, at et enkelt DNA-markør ikke kan være et værdifuldt markør for CRC-screening. I vores undersøgelse har screening for Kras mutationer i afføringsprøver bekræftet dette dogme ved at vise meget specifikke, men meget dårligt følsomme resultater. Anvendelsen af ​​en fækal DNA panel af 21 genmutationer viste højere følsomhed end den FOBT men har en stor omkostning begrænsning [12]. Påvisning af afvigende methylering er for nylig blevet vist at være mere sensitive end påvisning af genmutation [37]. Desuden kunne også detekteres afvigende methyleringer i cirkulerende DNA, såsom den, der findes i afføringen, serum, urin og andre kropsvæsker [39]. I denne undersøgelse viser vi, at Wif-1 methylering test er en nøjagtig markør for fremskreden kolorektal neoplasi i et første sæt evalueringer. Endvidere har vi også vise, at enten urin eller blodprøver kan anvendes til at bestemme methylering niveau. Især kan denne markør anvendes i individer, som er utilbøjelige til at udføre afføring tests. Især ydeevne FOBT beskrevet en lavere følsomhed end tidligere rapporteret. Denne forskel kunne forklares ved valget af en primær resultat, som har inkluderet patienter med fremskreden neoplasme, som er meget mere relevant i klinisk praksis og af den undersøgte population, der har inkluderet patienter med en gennemsnitlig eller høj-risiko for CRC. Denne forskel kan forklare med udvidelsen af ​​resultatet for patienter med fremskreden neoplasme, som er langt mere pålidelige i klinisk praksis og af undersøgelsespopulationen herunder patienter med en gennemsnitlig til høj risiko for CRC. Men strækker sådan test til massen screeningsprogrammer kræver yderligere validering hos asymptomatiske individer, samt omkostningseffektivitet analyser i en simuleringsmodel som tidligere rapporteret [38].

Desuden at forbedre nøjagtigheden af ​​biologiske forsøg til forudsigelse af neoplasier under colonoscopies, vi undersøgte markører i mikrobiota, som bliver et nyt felt for humane studier sygdom. Bidraget fra den intestinale mikrobiota til CRC tumorigenese er nu fuldt accepteret [39]. High throughput sekventering teknikker til humane microbiome er blevet anvendt til at undersøge ændringer i det bakterielle fylogenetiske kerne i normale individer og i CRC patienter, i enten afføring eller slimhinde associeret mikrobiota [21], [22]. Adskillige bakterier grupper, dvs.

Bacteroides /Prevotella

[21],

Fusobacterium

,

Faecalibacterium

og især

Coriobacteridae

og

Roseburia arter

[22], har vist sig at være relateret til CRC, og eksperimentelle modeller har støttet denne kausalitet hypotese [24].

Fusobacterium har vist nucleatum Salg stammer til at fremme kolorektal carcinogenese ved invasion af epitelcellerne ved at producere genotoxin-relateret direkte DNA-skader eller ved at inducere inflammation [23], [40], [41]. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi en specifik dysbiosis forbundet med fremskreden kolorektal neoplasi kendetegnet ved en højere tæthed af arter, der tilhører den

Bacteroides /Prevotella

gruppe. Men dette resultat ikke forbedre screening ydeevne FOBT eller afprøvning Wif-1. Fremtidige undersøgelser bruger dybere sekventering metoder og /eller metagenomisk tilgange berettiget til at muliggøre et screeningsværktøj baseret på fækal mikrobiota.

Konklusion

I denne undersøgelse, påvisning af methylerede WIF-1 i afføring, urin eller serumprøver har en højere diagnose nøjagtighed at detektere avancerede neoplasi sammenlignet med FOBT (0,90 [0,84-0,94] versus 0,83 [0,77-0,88], p = 0,02). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge, om ændringerne i mikrobiota kunne være biomarkører for fremskreden kolorektal neoplasi, især ved hjælp kandidat bakterier og metagenomisk undersøgelser. Serum og urin WIF-1 methylering tests kunne bruges i individer tilbageholdende med at gennemgå afføring test og skal nu vurderes i sammenhæng med screening.

Støtte oplysninger

figur S1.

Effektivitet af primere af målgener (Wif1, ALX-4 og vimentin) og housekeeping gen (Albumin BSP), der anvendes til methylering kvantificering hjælp seriefortyndinger af methylerede modificerede DNA-kontrol. For hvert datapunkt blev udført tre uafhængige analyser. Ligningen for den lineære regression kurve samt sammenhængen faktor er angivet på hver graf

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s001

(DOC)

tabel S1. .

Methyleret gen-målrettede primere og prober

doi: 10,1371 /journal.pone.0099233.s002

(DOCX)

tabel S2.

Group og artsspecifikke 16S rRNA gen-målrettede primere og prober

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s003

(DOCX)

tabel S3.

Kras mutation primere og prober

doi:. 10,1371 /journal.pone.0099233.s004

(DOC)

Tak

Vi vil gerne takke M. Goossens , K. Leroy, R. Inchitti, B. Coste, B. Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, S. Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, T. Aparicio, D. Abdelrahman, H. Hagège, A. Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, M. Cavicchi, Cl. Altman, E. Zrhien, G. Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, D. Gilot, P. De Fleury, M. Algard, M. Prieto, M. Petit, J. Samama, D. Lucienne, JC. Delchier, M. Levy, og A. Charachon for deres nyttige bidrag til denne undersøgelse.