Abstrakt
Histon methylering spiller en afgørende rolle i forskellige biologiske og patologiske processer, herunder udvikling af kræft . I denne undersøgelse opdagede vi, at JARID2, et vekselvirkende komponent i Polycomb undertrykkende kompleks-2 (PRC2), der katalyserer methylering af lysin 27 af histon H3 (H3K27), var involveret i transformerende vækstfaktor-beta (TGF-ß) -induceret epitel -mesenchymal overgang (EMT), i A549 lungekræft cellelinien og HT29 coloncancer cellelinie. Udtrykket af
JARID2
blev øget i løbet af TGF-ß-induceret EMT af disse cellelinjer og knockdown af
JARID2
hæmmede TGF-ß-induceret morfologisk konvertering af celler i forbindelse med EMT.
JARID2
knockdown selv havde nogen virkning i ekspressionen af EMT-relaterede gener, men antagoniserede TGF-ß-afhængige udtryk ændringer i EMT-relaterede gener såsom
CDH1
,
ZEB
familie og
microRNA-200
familie. Chromatin immunopræcipitationsanalyser viste, at JARID2 var impliceret i TGF-ß-induceret transkriptionel repression af
CDH1
og
microRNA-200
familie gener gennem regulering af histon H3 methylering og EZH2 occupancies på deres regulatoriske områder . Vores undersøgelse viste en roman rolle JARID2 protein, som kan styre PRC2 rekruttering og histon methylering under TGF-ß-induceret EMT af lunge- og tyktarmskræft cellelinjer
Henvisning:. Tange S, Oktyabri D, Terashima M, Ishimura A, Suzuki T (2014) JARID2 er involveret i transformerende vækstfaktor-beta-induceret epithelial-Mesenchymale Overgang af Lung og tyktarmskræft cellelinjer. PLoS ONE 9 (12): e115684. doi: 10,1371 /journal.pone.0115684
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republic Of
Modtaget: September 16, 2014 Accepteret: November 25, 2014; Udgivet: 26 December, 2014
Copyright: © 2014 Tange et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning C (tilskud nummer 24.590.346 til TS) og videnskabelig forskning på innovative områder (tilskud nummer 22.112.010 til TS) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Lysin (K) methylering på aminoterminale hale af histon H3 (K4, K9, K27 og K36) har vist sig som en vigtig posttranslationel modifikation grund af dens særlige dynamik for transkriptionel regulering [1], [2]. Methylering af H3K4 har været tæt forbundet med aktiv transskription hvorimod methylering af H3K9 og H3K27 er undertrykkende tilhørende kromatin. Disse ændringer er reguleret af histon lysin methyltransferaser (KMTs) og lysin demethylases (KDMs). Nylige undersøgelser har vist, at deregulering af disse enzymer kan bidrage til de udviklingsmæssige defekter og patogenesen af menneskelige sygdomme, herunder kræft [1] – [3].
For at finde nye gener impliceret i udviklingen af kræft, har vi udført retroviral insertionsmutagenese i mus. Denne skærm førte til isolation af hundredvis af kandidat cancer gener herunder mange gener, der koder KMTs og KDMs [4], [5]. Tidligere vi rapporterede, at KDM5B /PLU1 /JARID1B, en H3K4 demetylase og en af kandidat onkogener, nedreguleret ekspression af
KAT5
CD82
gener at øge celle invasion [6] og undertrykt udtryk for
microRNA-200 Hotel (
miR-200
) familie og dermed fremme epitel-mesenkymale overgang (EMT) af kræftceller [7]. Således vore undersøgelser viste, at histon methyl-modificerende enzymer blev involveret ikke alene i tumor initiering men også i tumorudvikling.
Tumor progression er blevet forbundet med aktivering af EMT program, der induceres af ydre signaler, såsom transformerende vækstfaktor-beta (TGF-ß) [8], [9]. EMT er karakteriseret ved ændringer i epitel- og mesenkymale genekspression. Især nedreguleringen af E-cadherin er afgørende for EMT. Adskillige transkriptionelle repressorer såsom ZEB1 og ZEB2 er involveret i E-cadherin transkriptionel repression under EMT [10]. De reversible egenskaber af EMT antyder, at epigenetisk regulering såsom DNA-methylering, histon modifikation og microRNA kan være involveret [11]. Der er flere papirer, herunder vores undersøgelse viser sammenhængen mellem E-cadherin undertrykkelse og funktionen af histon methyl-modificerende enzymer [7], [12], [13]. Imidlertid er den rolle, histon methylering i EMT lige begyndt at blive afdækket.
JARID2 er en af de Jarid proteiner, som indeholder JmjC (Jumonji C) domæne og ARID (AT interaktion domæne) [2]. Imidlertid mangler, JARID2 protein histon demethylase aktivitet karakteristisk for andre JmjC domæne proteiner, fordi det har aminosyresubstitutioner i konserveret område [2]. JARID2 er blevet rapporteret som tilbehør komponent i Polycomb undertrykkende kompleks-2 (PRC2), der regulerer vigtige genekspressionsmønstre under udvikling [14]. PRC2 indeholder de centrale underenheder: EZH2, SUZ12, europæiske demokratifond og RBBP4 /7, og er ansvarlig for undertrykkende H3K27 methylering [15]. JARID2 viste sig at styre PRC2 belægning og aktivitet på target gener i embryonale stamceller (EKSF) [16] – [19]. På den anden side, er deregulering af PRC2 aktivitet menes at bidrage til udvikling af menneskelige cancer. EZH2, en enzymatisk komponent i PRC2, viste sig at være overudtrykt i metastatisk cancer, og ekspressionsniveauerne blev associeret med tumorudvikling [20], [21]. Imidlertid rolle JARID2, et interagerende bestanddel af PRC2, under cancer progression fortsat ukendt.
I dette studie undersøgte vi funktionen af JARID2 under TGF-ß-induceret EMT af A549 lungekræft cellelinien og HT29 colon cancercellelinie. Vi fandt, at TGF-ß-afhængige udtryk ændringer i EMT-relaterede gener blev hæmmet af
JARID2
knockdown og forstærket af
JARID2
overekspression. Mekanistiske undersøgelser antydet, at JARID2 var involveret i TGF-ß-induceret transkriptionel repression af
CDH1
og
miR-200
familie gener gennem modulation af histon H3 methylering.
Materialer og metoder
plasmider
Den lille hårnål RNA (shRNA) udtrykkende retrovirus vektorer blev konstrueret som tidligere beskrevet [6]. Sense-strengen sekvenserne af de oligonukleotider var som følger:
JARID2
shRNA # 1, 5′-ccgggaaacaggtttctaaggtaaactcgagtttaccttagaaacctgtttcttttt-3 ‘
JARID2
shRNA # 2, 5′-ccgggcccaacagcatggtgtatttctcgagaaatacaccatgctgttgggcttttt-3 ‘
sekvensen af kontrol shRNA blev beskrevet tidligere [6]. Vi bekræftede, at ekspressionen af
JARID2
blev nedreguleret med infektion af både
JARID2
shRNA-udtrykkende retrovirus, selv i nærvær af TGF-ß ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR ) og Western blot (S1 fig.). Vi bekræftede også, at både
JARID2
shRNAs forårsagede de samme virkninger i vores EMT studier (S2 Fig.), Og dermed vi præsenterede data fra
JARID2
shRNA # 1 som et repræsentativt resultat (beskrevet som JARID2 KD). Menneskelig
JARID2
cDNA blev mærket med FLAG-6xHis-tag, og derefter klonet ind pDON-5 Neo plasmid (Takara) til at producere retrovira udtrykker JARID2.
Cell kultur og transfektion
A549 human lungecancer-cellelinie og HT29 human coloncancer cellelinie blev venligst stillet til rådighed af Dr. Y. Endo (cancer Research Institute, Kanazawa Univ.) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% FBS, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin (Sigma) ved 37 ° C i 5% CO2. For EMT induktion blev A549-celler behandlet med 1 ng /ml af TGF-ß (R 0,01 sammenligne at kontrolere). (F) Western blot blev udført for at detektere ekspressionen af JARID2 proteiner under TGF-ß-induceret EMT. Som kontrol blev anti-GAPDH antistof, der anvendes til at vise, at lige store mængder af proteiner blev læsset på gelen.
Knockdown af JARID2 hæmmede morfologiske ændringer i de celler induceret af TGF-ß
for at belyse funktionen af JARID2 i EMT, vi undersøgte, om knockdown af
JARID2
ville påvirke EMT proces fremkaldt af TGF-ß. A549-celler blev inficeret med kontrol- retrovirus eller retrovirus, der udtrykker
JARID2
shRNA, og de inficerede celler blev behandlet med eller uden TGF-ß. Efter TGF-ß behandling blev kontrolcellerne dispergeret, langstrakt og antog en fibroblast-lignende udseende er forbundet med EMT (fig. 2A).
JARID2
knockdown sig ændrede ikke celleformer betydeligt, men inhiberede morfologiske ændringer af cellerne induceret af TGF-ß (fig. 2A). Næste udførte vi immunofluorescens assay under anvendelse af et antistof mod E-cadherin, en epitelcelle markør. Ubehandlede kontrol A549-celler udviste heterogen E-cadherin-farvning, og denne farvning blev næsten tabt i TGF-ß-behandlede celler som tidligere beskrevet (fig. 2B) [23]. Som vist i fig. 2B, E-cadherin farvning blev klart påvist i
JARID2
Knockdown celler behandlet med eller uden TGF-ß, hvilket tyder på, at den epiteliale ejendom kunne opretholdes i
JARID2
Knockdown celler selv efter TGF-ß behandling. Vi undersøgte yderligere status af actin i cellerne ved TRITC-konjugeret phalloidin-farvning, da forekommer actin reorganisering under EMT-processen [8]. I modsætning til ubehandlede kontrolceller, TGF-ß dramatisk induceret actin fiberdannelse typisk for EMT (fig. 2C). Men i
JARID2
knockdown-celler, vi ikke observere dannelse actin fiber selv i nærværelse af TGF-ß (fig. 2C).
(A) Cell morfologiske ændringer af A549-celler efter TGF-ß behandling. A549-celler blev inficeret med retrovirus, der udtrykker kontrol shRNA eller
JARID2
shRNA (beskrevet som
JARID2
KD) uden eller med behandling af 1 ng /ml af TGF-ß i 48 timer. (B) Immunofluorescens billeder af celler, der viser lokaliseringen af E-cadherin. Panelerne af A549-celler med samme arrangement med (A) blev farvet med anti-E-cadherin antistof og med DAPI. (C) Fluorescensbilleder af celler viser reorganiseringen af aktincytoskelettet ved farvning med TRITC-phalloidin (Actin) og med DAPI. Scale barer: 20 pm
Vi undersøgte også, om
JARID2
knockdown vil medføre lignende virkninger i en anden EMT model.. Vi brugte en menneskelig coloncancercellelinie, HT29, fordi det reagerer på TGF-ß for EMT [7]. For ekspression af
JARID1A
,
JARID1B
,
JARID1C
og
JARID1D
viste QRT-PCR, at kun
JARID1B
udtryk var signifikant forøget efter behandlingen på 5 ng /ml TGF-ß (fig. 3B). Ekspressionen af
JARID1D
blev ikke påvist i HT29-celler, fordi
JARID1D
gen er placeret på Y-kromosomet og HT29-celler er afledt fra en kvindelig coloncancer patient. QRT-PCR og Western blot viste, at
JARID2
udtryk blev også øget i HT29-celler efter TGF-ß behandling (fig. 3D og 3E). Som vist i fig. 4, TGF-ß behandling inducerede morfologiske ændringer, forsvinden af E-cadherin-farvning og dannelse af actin stress fiber i HT29-celler.
JARID2
knockdown selv gav ikke anledning til væsentlige ændringer i forhold til at styre celler, men antagoniserede disse TGF-ß-inducerede fænotyper (fig. 4). Tilsammen viste disse resultater, at knockdown af
JARID2
modvirket TGF-ß-induceret morfologiske ændringer og cytoskelet omlejringer af A549 og HT29 cancerceller karakteristiske for EMT.
QRT-PCR-analyse blev udført for at detektere udtryk for
JARID1A Hotel (A),
JARID1B
(B),
JARID1C
(C) og
JARID2
(D) i HT29-celler før og efter behandlingen af 5 ng /ml TGF-ß (12 h, 24 h, 48 h og 72 h) (*,
P
0,01 sammenligne at kontrollere, **,
P
0,05 sammenligne at styre). (E) Western blot blev udført for at detektere ekspressionen af JARID2 proteiner under TGF-ß-induceret EMT. Som en kontrol blev anti-GAPDH-antistof anvendes.
(A) Cell morfologiske ændringer af HT29 celler efter TGF-ß behandling. HT29-celler blev inficeret med retrovirus, der udtrykker kontrol shRNA eller
JARID2
shRNA (beskrevet som
JARID2
KD) uden eller med behandling af 5 ng /ml TGF-ß i 72 timer. (B) Immunofluorescens billeder af celler, der viser lokaliseringen af E-cadherin. Panelerne af HT29-celler med samme arrangement med (A) blev farvet med anti-E-cadherin antistof og med DAPI. (C) Fluorescensbilleder af celler viser reorganiseringen af aktincytoskelettet ved farvning med TRITC-phalloidin (Actin) og med DAPI. Scale bars: 20 pm
Knockdown af JARID2 påvirkede ændringerne i ekspression af EMT-beslægtede gener induceret af TGF-ß
EMT er karakteriseret ved ændringer i epitel- og mesenchymale markør. genekspression [8]. analyserede vi således udtryk for en epitelial markør,
CDH1 /E-cadherin
, og mesenkymale markører,
FN1 /Fibronectin
Vimentin
i
JARID2
knockdown celler. QRT-PCR viste, at TGF-ß faldt ekspressionen af
CDH1 /E-cadherin
mRNA i A549-celler (fig. 5A) som tidligere rapporteret [23].
JARID2
knockdown selv havde nogen effekt på
CDH1
udtryk, men hæmmede undertrykkelsen af
CDH1
induceret af TGF-ß (fig. 5A). For
FN1 /Fibronectin
Vimentin
hvis udtryk blev opreguleret af TGF-ß,
JARID2
knockdown antagoniserede virkningen af TGF-ß (fig. 5B og 5C ). Disse resultater antydede, at
JARID2
knockdown inhiberede genekspression program af TGF-ß-induceret EMT i A549-celler.
QRT-PCR-analyse blev udført for at detektere ekspressionen af
CDH1 /E-cadherin Hotel (A),
FN1 /Fibronectin
(B),
vimentin
(C),
ZEB1
(D),
ZEB2
(E),
miR-200a
(F),
miR-200C
(G) og
JARID1B
(H) i A549 celler inficeret med retrovirus udtrykker kontrol shRNA eller
JARID2
shRNA med eller uden behandling af 1 ng /ml af TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne til kontrol). (I) Western blot blev udført for at detektere ekspressionen af E-cadherin, Fibronectin, vimentin, ZEB1, ZEB2, phosphoryleret SMAD3 (P-SMAD3) og GAPDH-proteiner ved anvendelse af de tilsvarende antistoffer.
Under EMT proces, er det blevet rapporteret, at ekspressionen af E-cadherin reguleres af transskriptionelle repressorer såsom ZEB1 og ZEB2 [10]. analyserede vi således udtryk for ZEB familie transskription repressorer i
JARID2
knockdown celler. Som vist i fig. 5D og 5E, TGF-ß behandling opreguleret ekspression af
ZEB1
og
ZEB2
i A549 celler.
JARID2
knockdown sig påvirkede ikke udtryk for
ZEB1
og
ZEB2
betydeligt, men hæmmede TGF-ß-afhængig forøgelse af både udskrifter (fig. 5D og 5E ). Dette fund førte os til at undersøge muligheden for, at effekten kan skyldes regulering af
miR-200
familie af microRNA.
miR-200
familie er blevet rapporteret at hæmme ZEB1 og ZEB2 specifikt under EMT [24], [25]. undersøgte vi derfor, om
JARID2
knockdown vil påvirke ekspressionen af to repræsentative miRNA,
miR-200a
miR-200C
. I overensstemmelse med tidligere rapporter [24], TGF-ß behandling resulterede i reduceret ekspression af
miR-200a
miR-200C
i A549-celler (fig. 5F og 5G).
JARID2
knockdown sig påvirkede ikke udtrykket, men hæmmede nedregulering af begge microRNA’er induceret af TGF-ß (fig. 5F og 5G). Næste undersøgte vi ekspressionen af
JARID1B
i
JARID2
Knockdown celler, fordi
JARID1B
fandtes at være opreguleret efter TGF-ß behandling og at være impliceret i EMT [7]. Som vist i fig. 5H,
JARID2
knockdown sig påvirkede ikke udtryk for
JARID1B
betydeligt, men hæmmede TGF-ß-afhængig forøgelse af
JARID1B
udskrift.
Vi analyserede også ændringerne i proteinekspression for nogle af EMT-relaterede genprodukter i A549-celler.
JARID2
knockdown aflyst TGF-ß-afhængig reduktion af E-cadherin protein og forøgelse af fibronektin, vimentin, ZEB1 og ZEB2 proteiner (fig. 5I), som gjorde det muligt at bekræfte QRT-PCR-resultater. Næste forsøgte vi at undersøge, om TGF-ß signalvejen ville blive forringet eller ikke i
JARID2
Knockdown celler ved detektering af de phosphorylerede SMAD3 proteiner efter TGF-ß behandling [9]. Som vist i fig. 5I, de phosphorylerede SMAD3 proteiner blev induceret af TGF-ß og deres niveauer var ens i kontrol- celler og
JARID2
knockdown celler. Dette resultat viste, at aktivering af nedstrøms SMAD3 transskription faktor af TGF-ß-signalet ikke ville blive forringet af
JARID2
knockdown. Desuden har vi bekræftet effekten af
JARID2
knockdown i reguleringen af de EMT-relaterede gener i en anden cancer cellelinje, HT29 (fig. 6). QRT-PCR viste, at
JARID2
knockdown tilsvarende hæmmede TGF-ß-inducerede ændringer i
CDH1 /E-cadherin
,
FN1 /Fibronectin
,
ZEB1
,
miR-200a
,
miR-200C
JARID1B
udtryk i HT29-celler (fig. 6A-F), og Western blot muligt for os at bekræfte QRT -PCR resultater (fig. 6G). Disse resultater sammen antydede, at JARID2 ikke påvirkede aktivering af downstream transkriptionsfaktorer af TGF-ß-signal, men var involveret i TGF-ß-afhængig transkriptionel regulering af EMT-relaterede gener i A549 lungekræft cellelinje og HT29 coloncancercellelinie.
QRT-PCR-analyse blev udført for at detektere ekspressionen af
CDH1 /E-cadherin
(A),
FN1 /Fibronectin
(B),
ZEB1
(C),
miR-200a
(D),
miR-200C
(E) og
JARID1B
(F) i HT29-celler inficeret med retrovirus udtrykker kontrol shRNA eller
JARID2
shRNA med eller uden behandling af 5 ng /ml TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne at kontrollere, **,
P
0,05 sammenligne at styre). Udtrykket af
Vimentin
ZEB2
var oprindelig lav eller ikke påvist i HT29-celler. (G) Western blot blev udført for at detektere ekspressionen af E-cadherin, Fibronectin, ZEB1 og GAPDH-proteiner ved anvendelse af de tilsvarende antistoffer.
JARID2 er impliceret i den transskriptionelle regulering af CDH1 og MIR-200 familie gen af TGF-ß ved konvertering af histon H3 methylering
JARID2 er en vigtig cofaktor af PRC2 enzym kompleks, der katalyserer methylering af H3K27 [14], [15] og er involveret i transkriptionel undertrykkelse i økonomiske og sociale råd [16] – [19]. Således undersøgte vi den methylerede status histon H3 på de regulatoriske regioner af
CDH1
og
MIR-200
familie gener, som transkriptionelt blev undertrykt under TGF-ß-induceret EMT, ved kromatin immunofældning ( chip) assay. Genetisk,
miR-200
familie er grupperet i to polycistroniske enheder:
miR-200b /200a /429
miR-200C /141
[26]. Efter immunpræcipitering, primersættene anbragt opstrøms fra transcription start sites af
CDH1
genet og to microRNA klynger blev anvendt i kvantitativ PCR [7].
Fordi JARID2 kan rekruttere PRC2 komplekset til kromatin i økonomiske og sociale råd [16] – [19], vi først analyseret transkriptionelt undertrykkende tri-methylerede H3K27 (H3K27me3) status i A549 celler. På de regulatoriske regioner af
CDH1
,
miR-200b /200a /429
miR-200C /141
gener, niveauerne af H3K27me3 blev forøget markant efter TGF ß behandling (fig. 7), som blev korreleret med den transkriptionelle repression af disse gener. På den anden side, transkriptionelt aktive H3K4me3 mærker faldt væsentligt på disse regulatoriske regioner ved TGF-ß (fig. 7). Vigtigere, observerede vi den forbedrede rekruttering af EZH2, en katalytisk underenhed af PRC2 kompleks, på disse regulatoriske regioner efter TGF-ß behandling (fig. 7). Disse resultater antydede, at TGF-ß-induceret rekruttering af EZH2 om de regulatoriske regioner kan være ansvarlig for den transkriptionelle undertrykkelse i A549 celler.
JARID2
knockdown selv gav ikke anledning til ændringer i histon methylering og EZH2 occupancies på disse områder. Desuden TGF-ß behandling i
JARID2
Knockdown celler resulterede ikke i en forøgelse af H3K27me3, faldt H3K4me3 og stigningen i EZH2 rekruttering (fig. 7). Denne observation blev korreleret med hæmning af TGF-ß-afhængig transkriptionel repression af
CDH1
og
MIR-200
familie gener i
JARID2
Knockdown celler (fig. 5A, 5F og 5G). Vi kunne ikke finde rekruttering af endogene JARID2 protein på de regulatoriske regioner af Chip assay med anti-JARID2 antistof, muligvis på grund af sin lave reaktivitet for immunopræcipitation. disse resultater foreslog dog, at JARID2 var ansvarlig for TGF-ß-induceret transkriptionel repression af
CDH1
og
MIR-200
familie gener under EMT af A549 celler, og at dens funktion var forbundet med regulering af rekruttering af EZH2 på kromatin for histon methylering. Som et kontrolforsøg, vi udførte chip-analysen på den regulatoriske region uafhængige
GAPDH
gen i A549 celler. Der var ingen væsentlige ændringer i H3K27 og H3K4 methylering og EZH2 occupancies på den regulatoriske region
GAPDH
gen ved JARID2 knockdown og /eller TGF-ß behandling (S3 Fig.). Dette indikerede, at JARID2-medierede ændringer af histon H3 methylering og EZH2 rekruttering kan være specifik for de målgener reguleret af JARID2 og TGF-ß, som blev korreleret med specificitet transkriptionel regulering.
chip analyser af H3K27me3, H3K4me3 og EZH2 om de regulatoriske regioner af
CDH1 Hotel (A),
miR-200b /200a /429
(B) og
miR-200C /141
gener (C ) i A549 celler er vist. De occupancies af denatureret histoner eller EZH2 protein på de regioner, blev analyseret ved kvantitativ PCR (*,
P
0,01 sammenligne at kontrollere, **,
P
0,05 sammenligne at kontrollere) .
desuden har vi også undersøgt virkningerne af
JARID2
knockdown i status for histon H3 methylering og EZH2 rekruttering på de regulatoriske regioner af
CDH1
mIR-200 Salg familie gener i en anden cancer cellelinie, HT29 (fig. 8). Chip analyser viste, at
JARID2
knockdown tilsvarende hæmmede TGF-ß-afhængig forøgelse af H3K27me3 og EZH2 occupancies og fald i H3K4me3 på disse regulatoriske områder (fig. 8). Disse JARID2-medierede virkninger blev ikke observeret på den regulatoriske region GAPDH genet (S4 Fig.). disse resultater sammen Derfor foreslog, at JARID2 var nødvendig for TGF-ß-afhængige ændringer i histon H3 methylering og EZH2 rekruttering på de specifikke målgener løbet TGF-ß-induceret EMT proces med A549 og HT29 cancer cellelinjer.
chip analyser af H3K27me3, H3K4me3 og EZH2 om de regulatoriske regioner af
CDH1 Hotel (A),
miR-200b /200a /429
(B) og
miR-200C /141
gener (C) i HT29-celler er vist. De occupancies af denatureret histoner eller EZH2 protein på de regioner, blev analyseret ved kvantitativ PCR (*,
P
0,01 sammenligne at kontrollere, **,
P
0,05 sammenligne at kontrollere) .
over-ekspressionen af JARID2 forbedret TGF-ß-afhængig transkriptionel regulering af EMT-relaterede gener
for at udvide vores forståelse for regulering af EMT ved JARID2, vi undersøgt virkningerne af
JARID2
overekspression i A549 celler. Over-ekspressionen af
JARID2
blev bekræftet ved QRT-PCR og Western blot og niveauet af overudtrykt
JARID2
blev ikke ændret væsentligt før og efter TGF-ß behandling (S5 Fig.) . Derefter undersøgte vi udtryk for
CDH1 /E-cadherin
,
FN1 /Fibronectin
,
Vimentin
,
ZEB1, ZEB2, miR-200a
miR-200C
i A549 celler med
JARID2
overekspression.
JARID2
overekspression ikke selv viser nogen væsentlige ændringer i ekspressionen af EMT-relaterede gener, men forbedret effekten af TGF-ß i ekspressionen af EMT-relaterede gener (fig. 9A-G). I
JARID2
over-udtrykkende celler, udtryk for
CDH1, miR-200a
miR-200C
blev undertrykt mere af TGF-ß, og udtryk for
FN1
,
ZEB1
og
ZEB2
blev aktiveret mere af TGF-ß (fig. 9A-G). Vi bekræftede også, at
JARID2
overekspression forbedret TGF-ß-afhængig reduktion af E-cadherin protein og forøgelse af fibronektin, vimentin, ZEB1 og ZEB2 proteiner (fig. 9H). Disse resultater indikerede, at overekspression af
JARID2
potenseret TGF-ß-afhængig transkriptionel regulering under EMT processen med A549-celler.
QRT-PCR-analyse blev udført for at detektere ekspressionen af
CDH1 /E-cadherin Hotel (A),
FN1 /Fibronectin
(B),
vimentin
(C),
ZEB1
(D),
ZEB2
(E),
miR-200a
(F) og
miR-200C
(G) i A549 celler inficeret med kontrol retrovirus eller retrovirus udtrykke
JARID2
med eller uden behandling af TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne at kontrollere, **,
P
0,05 sammenligne at styre; *** ,
P
0,05 sammenligne at kontrollere plus TGF-ß). (H) Western blot blev udført for at påvise ekspressionen af E-cadherin, Fibronectin, vimentin, ZEB1, ZEB2 og GAPDH proteiner ved hjælp af de tilsvarende antistoffer.
Næste forsøgte vi at undersøge, om
JARID2
overekspression i A549 celler vil påvirke methylerede status histon H3 og ansættelse af EZH2 om de regulatoriske regioner af
CDH1
,
miR-200b /200a /429
miR-200C /141
gener af chip analyse. På disse regulatoriske områder,
JARID2
overekspression selv ikke ændre niveauerne af H3K27me3 og H3K4me3 betydeligt, men forbedret effekten af TGF-ß på begge modifikationer (fig. 10), som blev korrelerede godt med ekspressionsniveauerne af
CDH1
og
miR-200
familie gener. Desuden
JARID2
overekspression selv haft ringe effekt i EZH2 occupancies, men forbedret EZH2 rekruttering på disse regulatoriske områder efter TGF-ß behandling (fig. 10). Vi kunne også registrere den øgede rekruttering af FLAG-mærkede JARID2 proteiner på de regioner, kun ved tilstedeværelsen af TGF-ß (fig. 10).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.