Abstrakt
mikromiljø afstivning spiller en afgørende rolle i tumorigenese. Mens filopodia generelt menes at være et af de trådløse mechanosensors til sondering af miljøet stivhed, effekten af miljø- stivhed på filopodial aktiviteter af kræftceller fortsat uklare. I dette arbejde, vi undersøgte filopodial aktiviteter af humane lunge adenocarcinomceller CL1-5 dyrket på substrater af afstemmelig stivhed som anvender en ny platform. Platformen består af et optisk system kaldet struktureret belysning nano-profilometri, hvilket giver tid-bortfaldet visualisering af filopodial aktiviteter uden fluorescens mærkning. Dyrkningsbetingelserne substrater blev sammensat af polyvinylchlorid blandet med en miljøvenlig blødgører til dannelse Youngs modul i området fra 20 til 60 kPa. Celle levedygtighed undersøgelser viste, at levedygtigheden af celler dyrket på substraterne var lig dem dyrket på almindeligt anvendte elastomerer, såsom polydimethylsiloxan. Time-bortfaldet levende celle billeder blev erhvervet, og de filopodial aktiviteter som reaktion på substrater med varierende grader af stivhed blev analyseret. Statistiske analyser afslørede, at lungekræft celler dyrket på blødere substrater syntes at have længere filopodia, højere filopodial tætheder i forhold til den cellulære perimeter, og langsommere filopodial tilbagetrækningsmekanismer satser. Ikke desto mindre, den tidsmæssige analyse af filopodial aktiviteter viste, at hvorvidt en filopodium beslutter at forlænge eller trække er rent en stokastisk proces uden afhængighed af substrat stivhed. Forskellen på de filopodial aktiviteter mellem lungecancerceller dyrket på substrater med forskellige grader af stivhed forsvandt når myosin II-aktiviteter blev inhiberet ved behandling af cellerne med Blebbistatin, som antyder, at filopodial aktiviteter følges nøje moduleret af klæbestyrken af cellerne. Vores data kvantitativt relatere filopodial aktiviteter af lungekræft celler med miljømæssig stivhed og bør belyse forståelsen og behandling af kræft progression og metastase
Henvisning:. Liou YR, Torng W, Kao YC, Sung KB, Lee CH , Kuo PL (2014) Substrat Stivhed regulerer Filopodial Aktiviteter i lungekræft Cells. PLoS ONE 9 (2): e89767. doi: 10,1371 /journal.pone.0089767
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
Modtaget: Juni 13, 2013; Accepteret: 26 Jan 2014; Publiceret: 27 feb 2014
Copyright: © 2014 Liou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne er taknemmelige for den økonomiske støtte under tilskud numre NSC 100-2112-M-001-022-My3 og NSC101-2220-E-002-011 leveret af National Science Rådet Taiwan (https://web1.nsc.gov. tw /) og tildele nummer 101-EF-17-A-19-S1-174 leveres af Økonomiministeriet i Taiwan (https://www.moea.gov.tw/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
mikromiljø stivhed spiller en afgørende rolle i udviklingen af kræft og progression. Afstivning af ekstracellulær matrix som følge af forøget collagentværbinding forekommer under tumorgenese [1], [2]. Matricen afstivende påvirker cellemotilitet, dirigerer migrationen af cancerceller, og kan yderligere være relateret til organspecifik metastase [3]. Stiv matrix fremmer stabiliteten af cellen fokal adhæsion, hvilket forøger intracellulær vækstfaktorsignalering og igen øger tumor celletransformation og vækst [2], [4]. For eksempel blev det for nyligt vist, at flere lungekræft cellelinier voksede bedre på stivere substrater [5], og at reduktion af matrix stifferening ved at hæmme lysyloxidase-medieret collagentværbinding hæmmet tumorprogression [6]. Forstå, hvordan kræftceller sanse og reagere på miljømæssige stivhed skal give værdifuld indsigt i snørklede af kræft progression og medvirke til en forbedring af behandlingsstrategier.
filopodia, finger-lignende fremspring på celle kanter, er generelt observeret i meget metastatiske cancerceller, såsom CL1-5, en yderst invasive humane lunge adenocarcinomceller [7], [8]. Den unikke morfologi og meget dynamiske aktiviteter filopodia gør dem iboende egnede organeller til sondering miljømæssige stivhed. Filopodia typisk udvide og tilbagetrække inden for en tidsskala gange ti sekunder, mens deres lange længde og højt overfladeareal-til-volumen-forhold tillade en intim interaktion med mikromiljøet. Filopodial tilbagetrækning indebærer retrograd strøm af F-actin primært drevet af myosin II sammentrækning [9], mens myosin aktiviteter er positivt korreleret med substrat stivhed [4], [10]. Det er således tænkt at filopodia kan virke som cellulære mechanosensors ved at probe miljømæssige stivhed ved tilbagetrækning. For nylig blev de substrat stivhed-sensitive dynamik filopodia demonstreret i neurale vækst kegler og forklares ved en stokastisk model baseret på “motor-kobling” hypotese [11], [12]. Modellen forudsiger, at myosin-drevne retrograd flow på F-actin stigninger og filopodial trækkraft aftager med stigende substrat stivhed. De eksperimentelle resultater bekræftede, at filopodia løsrevet fra substratet hyppigere med højere substrat stivhed. Hvis disse forudsigelser og observationer kan generaliseres til kræftceller, kan man forvente, at de overordnede filopodial aktiviteter af en kræftcelle, såsom distribution af filopodial længde og tæthed også vil blive reguleret af substrat stivhed. Dette er vigtigt, da tilstedeværelsen og aktiviteter filopodia i cancerceller menes at være korreleret med kræft cellens evne til at hjem til blodkar og invadere væv [7], [13] – [15].
Men virkningerne af substrat stivhed på de filopodial aktiviteter af kræftceller tilbage uklar på grund af flere teknik begrænsninger. Diameteren af filopodia typisk fra en til tre hundrede nanometer, som er på randen af opløsning grænse for konventionel optisk mikroskopi. Derfor blev de fleste levende celle billeder vedrørende filopodial aktiviteter taget fra fluorescerende protein-actin-transficeret embryonale neuroner, som har stor filopodia på vækst kegler. den forøgede ekspression af det transficerede fluorescerende protein-actin kompleks, kan dog ændre filopodial aktiviteter, mens fototoksicitet anlagt af excitationslyset kan påvirke celle aktiviteter og ændre dynamikken i filopodia [16], [17].
i dette arbejde, undersøgte vi virkningerne af substrat stivhed på filopodial aktiviteter lungecancerceller CL1-5 med en nyudviklet imaging teknik kaldet struktureret-belysning nano-profilometri (SINAP), som anvender topografiske følsomhed til at forbedre billedet kontrast en filopodium på flade substrater og tillader label-fri, tid-bortfaldet visualisering af filopodial aktiviteter på en frame rate på op til 0,2 Hz [18], [19]. For at forbedre billedets kontrast mellem filopodia og det omgivende medium, polyvinylchlorid (PVC) baserede materialer med høje brydningsindeks og justerbar stivhed blev tilpasset for cellekultur. Biokompatibilitet de PVC-baserede substrater blev evalueret under anvendelse MTT-assay [20]. Vi kvantificerede de filopodial aktiviteter af individuelle celler ved måling af filopodial densitet (dvs. antallet af filopodia per længdeenhed af de cellulære periferier), den gennemsnitlige filopodial længde, de filopodial udstrækningen og tilbagetrækningen satser, og udvidelsen /tilbagetrækning sandsynligheden for individuel filopodia , som er defineret som den del af tiden, at en filopodium brugt til udvidelse /tilbagetrækning. For at bestemme om virkningen af substrat stivhed på filopodial aktiviteter er afhængig af myosin II-aktiviteter, målte vi også ændringen af filopodial aktiviteter, når celler dyrket på substrater med forskellige grader af stivhed blev behandlet med Blebbistatin, en myosin II inhibitor.
Resultater
Karakterisering af PVC-baserede substrater
kultur substrater var lavet af en blanding af PVC og en miljøvenlig, carboxylat typen blødgører, di (isononyl) cyclohexan-1, 2-dicardoxylate (DINCH). Stivheden af blandingen blev indstillet ved at justere forholdet mellem PVC til plastificeringsmidlet, mens større forhold resulterede i stivere kompositter. Youngs moduli af PVC-kompositter, som målt ved at anvende sekventiel kompression til større krystaller, var 20,2 ± 2,5 kPa (
n
= 6), 35,7 ± 0 kPa (
n
= 1 ), og 61,1 ± 12,9 kPa (
n
= 6) for PVC 01:01, PVC 02:01, og PVC 03:01 hhv. Her PVC 01:01, 02:01, og 03:01 henvises til PVC kompositter med forhold af PVC til plastificeringsmidlet er 1:01, 2:01, og 3:01 hhv. Disse data indikerer, at stivheden af PVC kompositter er inden for området af de fleste væv i maligne tilstande [21].
arbejdsprincip for SINAP kræver, at kulturen substratet har en anden brydningsindeks fra den for celler til forbedre signal-støjforholdet af billederne. De brydningsindekserne af PVC-kompositter blev bestemt under anvendelse af hidtil ukendte digitale holografiske microtomography som for nylig beskrevet [22]. De målte brydningsindekser PVC og blødgøringsmidlet var 1,53-1,57 og 1,47 hhv. Dermed de resulterende brydningsindekser PVC sammensatte varierede fra 1,47 til 1,53, hvilket er meget tæt på den for glas (~1.5) og højere end den for celler (~1.36) [23].
Cellelevedygtighed test blev anvendt til at bestemme, om biokompatibilitet PVC kompositter er forenelig med andre kompatible substrater almindeligvis anvendes til celledyrkning. Vi har udført MTT-assays til human lunge adenocarcinomceller CL1-5 dyrket på glas, PVC kompositter, polyacrylamid (PA) geler og poly (dimethyl) siloxan (PDMS). Figur 1 viser typiske billeder af celler dyrket på forskellige substrater. MTT assay kvantificerer metabolisk aktive celler som den optiske densitet (OD) ved 570 nm. Som vist i fig. 2, celler dyrket på glasset og PA-gel havde den største levedygtighed sammenlignet med andre elastomere substrater. De gennemsnitlige levedygtigheder af celler dyrket på PVC kompositter og af PDMS substrater var ens. Der var ingen signifikant forskel i cellernes levedygtighed mellem PVC 03:01, 02:01, og 01:01. Dette indikerer, at biokompatibilitet PVC kompositter svarer til den for andre almindeligt anvendte elastomere substrater og ikke berøres ved at variere forholdet af PVC til plastificeringsmidlet.
PVC 01:01, 02:01, og 3 :1 henvise til PVC kompositter med forhold af PVC til plastificeringsmidlet er 1:01, 2:01 og 3:01 henholdsvis; PA og PDMS er forkortet til polyacrylamid og poly (dimethyl) siloxan hhv. Scale bar = 100 um.
Farvestoffet har en lilla farve og blev kvantificeret ved den optiske absorbans ved 570 (
n
= 8, 5, 4, 4, 3, og 3 for glas, pvc 03:01, PVC 02:01, PVC 01:01, PA-gel, og PDMS substrat henholdsvis).
effekter af substrat stivhed på filopodial længde og tæthed
for at bestemme, om de filopodial aktiviteter er påvirket af substrat stivhed blev CL1-5 celler podet på PVC 01:01, PVC 03:01, og glas substrater. Substraterne blev belagt med fibronectin før cellepodning at lette cellevedhæftning. Immunfarvning mod den overtrukne fibronectin bekræftede, at den absorberede fibronectin havde lignende overfladekoncentrationer på tværs af de tre typer af substrater; forholdene mellem den gennemsnitlige fluorescensintensitet af den farvede fibronectin til substratet baggrunden var 1,64, 1,59, og 1,41 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glassubstrater hhv. Youngs moduli af PVC kompositter var omkring 60 kPa og 20 kPa for PVC 3:01 og 1:01 henholdsvis mens Youngs modul på glas er af størrelsesordenen GPa. Levende celler optagelser blev foretaget ved anvendelse af et SINAP system. Typiske SINAP billeder for cancercellerne dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glassubstratet er vist i fig. 3, i hvilken filopodia karakteriseres som tynde, lyse fremspring med forskellige længder på cellulært periferier.
Scale bar = 5 um.
Vi observerede, at antallet af filopodia per celle varierede fra 50 til 70. for de enkelte celler, vi identificeret alle synlige filopodia og beregnet tætheden og gennemsnitlige længde af filopodia, kaldet
f
d og
f
L hhv. Den filopodial densitet blev defineret som forholdet mellem filopodia nummer til omkredsen af cellen. Figur 4A viser variationen af
f
d samplet fra celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glas substrater hhv. De celler dyrket på PVC 1:01 havde den største
f
d (middelværdi = 0,55 um
-1, celleantal = 33), efterfulgt af cellerne dyrket på PVC 3: 1 (middel = 0,31 um
-1, celle nummer = 18), og at dyrket på glasset (middel = 0,31 um
-1, celle nummer = 43). Statistisk analyse viste, at der er signifikant forskel mellem resultaterne fra PVC 01:01 og 03:01 (
s
= 4,4 × 10
-9), og PVC 01:01 og glasset (
s
= 1,1 × 10
-9), mens der ikke er nogen signifikant forskel mellem resultaterne af PVC 03:01 og glas (
s
= 0,75). Konsekvent, som vist i fig 4B,
f
L af celler dyrket på PVC 01:01 var signifikant længere end for de celler dyrket på PVC 03:01 (
s
= 8,8 × 10
-4) og glas (
s
= 2,2 × 10
-4), mens der ikke er nogen væsentlig forskel mellem den for PVC 03:01 og glasset (
s
= 0,67). Midlerne til
f
L var 3,77, 3,08, og 3,03 um for PVC 01:01, PVC 03:01, og glas hhv. Disse data indikerer, at når kræftceller dyrkes på elastomere substrater, de celler, der vokser på blødere underlag har mere og længere filopodia.
filopodial densitet blev defineret som antallet af filopodia per længdeenhed af den cellulære perimeter. Den filopodial længde blev beregnet som gennemsnit af alle synlige filopodia af cellen. Søjlerne repræsenterer hjælp af variabler og fejlene betegner standardafvigelser beregnet ud fra 33, 18 og 43 celler til PVC 01:01, PVC 03:01 og glas substrater hhv. blev fundet signifikante forskelle mellem data for PVC 01:01 og 03:01, og PVC 01:01 og glas med det ** angiver
p
. 0,01
Effekter af substrat stivhed på dynamikken i filopodial udvidelse og tilbagetrækning
Vi spurgte, om filopodia har forskellige satser og sandsynligheder for at udvide eller trække når kræftceller blev dyrket på substrater af forskellige grader af stivhed. Konkret har vi begrundet, at filopodia af kræftceller dyrket på stivere substrater kan have en større tilbøjelighed til at trække, hvilket fører til en mindre
f
D og en kortere
f
L, som vist i fig. 4. For at analysere ind- og udfoldning dynamik individuel filopodia blev tidsforkortet SINAP billeder af levende celler taget ét billede hvert 10. sekund i fem minutter. Kun filopodia varede mere end et minut (dvs. optræder på 6 på hinanden følgende rammer) blev sporet og de øjeblikkelige filopodial længder blev målt fra individuelle frames. En repræsentativ længde tidsmæssig profil for et sporet filopodium er afbildet i fig. 5. filopodium havde en indledende længde på 0,92 um i starten af sporing, kontinuerligt forlænget for 100 sekunder, og trækkes tilbage til 1,02 um ved udgangen af billedoptagelse. Vi beregnede satserne for forandring længde mellem på hinanden følgende rammer og henviste positive forandringer som udvidelse og negativ som tilbagetrækningsmekanismer satser. Dette gav et sæt extension /tilbagetrækningsmekanismer satser forbundet med forskellige filopodial længder. For eksempel forlængelsesdelene for den filopodium vist i fig. 5 er 0,004, 0,04, og 0,001 μm⋅s
-1 ved filopodial længde på 0,92, 1,14 og 1,79 um hhv. Vi sporede 51, 59, og 34 filopodia for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01 og glas substrater hhv. Vi antog, at celler dyrket på den samme slags substrater har lignende filopodial dynamik og samlede hastighedsdata efter typen af dyrkning substrater. For at lette sammenligningen af sats data på tværs af forskellige filopodial længder, assorteret vi dataene med et sæt længde intervaller adskilt af samme hul. Vi valgte først 2 um som hullet; nemlig spænder 1 nævnte filopodial længde ≥0 og 2 um, område 2 nævnte filopodial længde ≥2 um og 4 um, og så videre. Figur 6 samlet variationen af hastighedsdata tværs af defineret længde intervaller for celler dyrket på de tre typer substrater. Søjlerne repræsenterer midlerne til hastighedsdata assorteret i længden rækkevidde og fejlene betegner standardafvigelser. Generelt forlængelsesdelene satser udviste en tendens til at aftage med filopodial længde forøges, mens tilbagetrækningsaksen satser syntes at stige som længden øges, med et lokalt maksimum ved længde på 11, 7 og 7 um for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glas substrater hhv. Vi observerede lignende tendenser, når assorting dataene ved hjælp af forskellige huller, såsom 1 eller 0,5 um for længde intervaller. Bemærk, at i fig. 6, satsen data for cellerne på blødere underlag strakte større længde intervaller, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne vist i fig. 4B.
Cellen blev dyrket på glassubstratet. Den filopodial længde var 0,92 um ved starten af erhvervelse billede, løbende udvidet til 1,81 um, og tilbagetrukket til 1,02 um i slutningen af erhvervelsen billede. De SINAP billeder svarende til de data, længde markeret med cirkler er vist i højre og kommenteret med optagetiden. Den sporede filopodium blev fremhævet af pilen i en
st billede.
(A), (B) og (C) et billede af forholdet mellem de forlængerledninger satser og filopodial længder til henholdsvis celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glassubstratet henholdsvis; (D), (E), og (F) viser variationen af tilbagetrækningskroppen satser med hensyn til forskellige filopodial længder for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glassubstratet hhv. Søjlerne repræsenterer midlerne til hastighedsdata assorteret i længde intervaller og fejlene betegner standardafvigelser. Dataene blev assorteret i et sæt af længde intervaller adskilt af 2 um. Antallet af filopodia sporet for den sats måling er 51, 59, og 34 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glas substrater henholdsvis.
Underlag stivhed væsentligt påvirket tilbagetrækningsaksen satser, når filopodial længde oversteg en vis størrelsesorden. Vi fandt, at betydningen syntes da skalaen blev sat til at være 4 pm, som er omkring hjælp af
f
L vist i fig. 4B. For hver sporet filopodium, slået vi hastighedsdataene målt ved filopodial længde ≥4 um og beregnede midlerne. Vi henvises til midlerne til udvidelsen og tilbagetrækning satser som
V
E og
V
R hhv. Vi samledes
V
E og
V
R beregnet ud fra celler dyrket på den samme form for substrat og diverse data i et sæt af sats intervaller, der var lige så adskilt af 0,02 μm⋅s
-1. Det forekommende Sandsynligheden for et bestemt interval blev således anslået ved at beregne den del af data assorterede i den interesserede rækkevidde. Figur 7 illustrerer sandsynligheden fordeling af Udlægning og tilbagetrækning satser anslås for cellerne dyrket på de tre typer substrater. De solide, stiplede, og stiplede linjer repræsenterer normalfordeling passer til dataene af glas, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Statistisk analyse viste, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem
V
E for celler dyrket på de tre substrater (
s
= 0,17). Midlerne til
V
E var 0,052, 0,064, og 0,054 μm⋅s
-1 for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset substrat henholdsvis . ,
V
R for celler dyrket på PVC 01:01 var imidlertid betydeligt langsommere end af glasset (
s
= 0,02), mens forskellene i
V
R mellem cellerne dyrket på PVC 01:01 og PVC 03:01 (
s
= 0,31), og at den PVC 03:01 og glasset (
p
= 0,05) var ikke signifikant. Midlerne til
V
R var 0,059, 0,063, og 0,069 μm⋅s
-1 for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset substrat henholdsvis . Disse resultater antyder, at filopodia af celler dyrket på blødere underlag synes at trække langsommere, når den filopodial længde overstiger den gennemsnitlige længde.
Dataene blev sorterede i en serie af intervallerne, der var lige så adskilt ved 0,02 μm⋅s
-1. De solide, stiplede, og stiplede linjer repræsenterer normalfordeling passer til dataene af glas, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Koefficienterne for bestemmelse (dvs.
R-
firkant) for de tre fittings er . 0,9
For at kvantificere tendens filopodial tilbagetrækning når cellerne blev dyrket på substrater af særlig stivhed, vi definerede sandsynligheden for, at en filopodium foretrækker at trække som (1), hvor
t
E og
t
R betegne fraktionerne af tid, at filopodium brugt til udvidelse og tilbagetrækning hhv. Da vi var primært interesseret i de filopodial dynamik påvirker hjælp af
f
L, kun de tidsmæssige data efter filopodial længde på over 4 um blev betragtet og de perioder, at filopodial længde forblev stationær blev udelukket . Bemærk at udstrække og tilbagetrække sandsynligheden for filopodium er de samme, hvis
P
R er lig med 0,5. Figur 8 viser sandsynlighedsfordelingen for den
P
R beregnet ud fra celler dyrket på de tre typer substrater. Igen, de faste, stiplede, og stiplede linjer repræsenterer normalfordeling passer til dataene af glas, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Statistisk analyse viste, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem
P
R af celler dyrket på de tre typer underlag (
s
= 0,54). Midlerne til
P
R var 0,48, 0,48, og 0,47 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glas hhv. Disse resultater antyder, hvorvidt en filopodium beslutter at forlænge eller tilbagetrække er rent en stokastisk proces uden afhængighed af substrat stivhed. Således variationen af
f
L mellem substrater af forskellige grader af stivhed primært skyldes de forskellige satser for filopodial tilbagetrækning, som hovedsagelig blev drevet af myosin II sammentrækning og afhængig af underlaget stivhed.
tilbagetrækning tendens blev defineret som den del af tiden, at filopodium brugt for tilbagetrækning. De solide, stiplede, og stiplede linjer repræsenterer normalfordeling passer til dataene af glas, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Koefficienterne af beslutsomhed (dvs.
R-
firkant) for de tre fittings er . 0.9
Blebbistatin behandling ændrer filopodial aktiviteter
Da underlaget stivhed regulerer styrken af celleadhæsion og myosin II-aktiviteter [10], vi spekulerede på, om den observerede afvigelse på filopodial længde og tæthed mellem celler dyrket på substrater af forskellige grader af stivhed forsvinder, hvis myosin aktiviteter blev hæmmet. Vi først undersøgt levedygtighed og filopodial aktiviteter af cancerceller behandlet med Blebbistatin af forskellige koncentrationer. De CL1-5 celler blev dyrket på glas substrater for 24 timer og udsat for opløsninger indeholdende 10-30 pM Blebbistatin i 1 time for at inhibere myosin aktiviteter, som henviser til en nylig litteratur [24]. Celle levedygtighed undersøgelser under anvendelse af MTT-assayet viste, at behandlingen af 10-30 pM Blebbistatin ikke bringe den CL1-5 celler signifikant toksicitet (fig. 9), medens den filopodial tæthed og gennemsnitlig længde steg med stigende Blebbistatin koncentrationer (Fig. 10) . Statistisk analyse viste, at filopodial tæthed af cancerceller behandlet med 30 pM Blebbistatin var betydeligt større end behandlet med 0 (
s
= 0,006) og 10 uM Blebbistatin (
s
= 0,03), men der var ingen signifikant forskel mellem denne behandles med 0 og 10 uM (
s
= 0,1). Ligeledes filopodial længde af kræftceller behandles med 30 pM Blebbistatin var signifikant længere end behandlet med 0 (
s
= 3,2 × 10
-5) og 10 uM Blebbistatin (
p
= 0,02), og der var signifikant forskel mellem denne behandles med 0 og 10 uM (
s
= 0,01).
cellerne blev dyrket på glas substrater for 24μM DMSO eller Blebbistatin for 1 time (
n
= 5 for hver koncentration). De optiske densiteter af celler uden anvendelse af reagenserne blev omtalt som kontrol (
n
= 8). Søjlerne repræsenterer hjælp af variabler og fejlene betegner standardafvigelser.
Søjlerne repræsenterer hjælp af variabler og fejlene betegner standardafvigelser beregnet ud fra 43, 24 og 31 celler behandlet med 0, 10 og 30 pM Blebbistatin henholdsvis. Mærket * angiver
s
. 0,05
For at opnå betydelig blokering af myosin aktiviteter, vi dyrkede de CL1-5 celler på PVC 01:01, PVC 03:01 og glassubstrater og behandlet af cellerne med en opløsning af 30 pM Blebbistatin i 1 time. Figur 11 viser den repræsentative lyse felt og immunofarvningsprocedure billeder af celler, der var behandlet og ikke behandlet med Blebbistatin. Vi beregnede antallet af farvede vinculin pr celler. Det fremgår, at Blebbistatin behandling øgede celle afrunding på alle de tre typer substrater og forbedret filopodial forlængelse og forgrening, men faldt antallet af fokale adhæsioner for celler dyrket på stivere substrater. Den gennemsnitlige og standardafvigelse vinculin antal pr celle var 53,2 ± 28,3, 93,6 ± 30,3, og 155,8 ± 35,5 til celler dyrket på PVC 01:01 (
n
= 5), PVC 03:01 (
n
= 5), og glas substrat (
n
= 8) uden bleddistain behandling. Efter bleddistain eksponering, tallene ændret til 40,5 ± 13,6, 51,7 ± 19,5, og 101,6 ± 22,3 til celler dyrket på PVC 01:01 (
n
= 3), PVC 03:01 (
n
= 4), og glas substrat (
n
= 9).
(A), (B) og (C) er lyse felt billeder af celler behandlet med regelmæssig dyrkningsmedium som kontrol; (D), (E), og (F) er deres tilsvarende immunofluorescens billeder af kernen (blå) og vinculin (grøn); (G) – (L) viser lyse felt og tilsvarende immunofluroresence billeder af celler behandlet med 30 pM Blebbistatin i en time for at inhibere myosin II-aktiviteter. Scale bar = 10 um.
Statistisk analyse afslørede, at efter udsat for 30 uM Blebbistatin i en time, forskellen på
f
D mellem cellerne dyrket på PVC 01:01 og PVC 03:01 blev ubetydelig (
s
= 0,11), og den
s
værdi for betydningen af
f
D forskel mellem denne på PVC 01:01 og glasset faldt (
s
= 0,0069) i forhold til, at uden Blebbistatin behandling (
s
= 1,1 × 10
-9). Desuden Blebbistatin behandling signifikant forøget
f
D, med en mere markant stigning i celler dyrket på PVC 03:01 (
s
= 0,046 for PVC 01:01,
s
= 2,1 × 10
-6 til PVC3:1, og
s
= 0,006 for glas). Antallet af celler i stikprøven var 10, 13 og 31 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset henholdsvis. Figur 12A opsummerer ændringen af
f
D for celler udsat for Blebbistatin i en time. Bemærk, at resultaterne er vist i fig. 4A blev afbildet ved siden af disse stænger til sammenligning
De hvide søjler repræsenterer midlerne til de målte data fra celler uden Blebbistatin behandling (dvs. data i figur 4.).; de grå søjler angiver middelværdien af de målte data fra celler med Blebbistatin behandling; og fejl angiver standardafvigelser af dataene. Antallet af celler behandlet med Blebbistatin er 10, 13, og 31 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glas substrater hhv. # Og ## betegner
s
0,05 og
s
0,01 henholdsvis forskellen mellem de data indhentet fra den samme slags underlag med og uden Blebbistatin behandling; * Og ** er kommenteret for
s
0,05 og
s
0,01 henholdsvis forskellen mellem de data indhentet fra forskellige slags underlag med og uden Blebbistatin behandling. Bemærk, at for de celler uden Blebbistatin behandling, blev der fundet signifikante forskelle mellem dataene for PVC 01:01 og PVC 03:01, og mellem denne PVC 01:01 og glas; for cellerne behandlet med Blebbistatin blev signifikant forskel kun fundet mellem data af PVC 01:01 og glas.
f
L af celler dyrket på substrater af forskellige grader af stivhed udviste lignende ændring efter behandlingen på 30 uM Blebbistatin (fig. 12B). Igen er resultaterne vist i fig. 4B blev plottet ud for dem efter Blebbistatin behandling til sammenligning. Statistisk analyse viste, at Blebbistatin behandling signifikant øget
f
L for celler på PVC 03:01 (
s
= 0,005) og glasset (
p
= 3,2 × 10
-5); mens ændringen af
f
L ikke var signifikant for celler på PVC 01:01 (
s
= 0,48). Gennemsnittene af
f
L var 4,32 um, 3,95 um, og 4,98 um for PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset henholdsvis. Forskellen på
f
L mellem celler dyrket på substrater af forskellige grader af stivhed blev ubetydelig efter Blebbistatin behandling (
s
= 0,12). Disse resultater antyder, at den observerede substrat stivhed-sensitive aktiviteter filopodia var i det mindste delvis moduleret af myosin II-aktivitet.
Discussion
I dette arbejde, vi kvantificeret forholdet mellem de filopodial aktiviteter lungecancerceller og substrat stivhed under anvendelse af en etiket-fri billeddannelse teknik. Vi fandt, at underlaget stivhed reguleret filopodial længde og tæthed i kræftceller sandsynligvis via påvirker filopodial tilbagetrækning sats, der primært blev moduleret af varieret myosin aktiviteter.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.