PLoS ONE: proteomiske Analyse af anti-kræft Scopularide Produktion af en Marine Microascus brevicaulis Stamme og dens UV Mutant

Abstrakt

Den marine svamp

Microascus brevicaulis

stammen LF580 er en ikke-model sekundær metabolit producent med høje udbytter af de to sekundære metabolitter scopularides A og B, som udviser distinkte aktiviteter mod tumor cellelinier. En mutant stamme blev opnået under anvendelse af UV-mutagenese, viser hurtigere vækst og forskelle i pelletdannelse foruden højere produktionsniveauer. Her viser vi den første proteomanalyse undersøgelse af en marine svamp. Sammenlignende proteomics blev anvendt til at opnå dybere forståelse af reguleringen af ​​produktionen og fysiologi vildtypestammen og dens mutant. Til dette formål blev en optimeret protein udvinding protokol etableret. I alt blev 4759-proteiner identificeret. Den centrale metaboliske vej af stammen LF580 blev kortlagt ved hjælp af Kegg pathway analyse og GO annotation. Anvender iTRAQ mærkning, blev 318 proteiner vist sig at være signifikant reguleret i mutant stamme: 189 var ned- og 129 opreguleret. Proteomics er et kraftfuldt værktøj til forståelse af lovgivningsmæssige aspekter: Forskellene på proteom niveau kunne tilskrives begrænsede tilgængelighed af næringsstoffer i vildtypestammen grund af en stærk pille formation. Denne information kan anvendes til optimering på stammen og procesniveau. Koblingen mellem næringsstof begrænsning og pellet dannelse i den ikke-modellen svamp

M

.

brevicaulis

er i enighed med viden om modelorganismer som

Aspergillus niger

Penicillium chrysogenum

Henvisning:. Kramer A, Beck HC, Kumar a, Kristensen LP, Imhoff JF, Labes a (2015) proteomiske Analyse af anti-kræft Scopularide Produktion af en Marine

Microascus brevicaulis

Strain og dens UV Mutant. PLoS ONE 10 (10): e0140047. doi: 10,1371 /journal.pone.0140047

Redaktør: Marie-Joelle Virolle, University Paris Syd, FRANCE

Modtaget: Marts 16, 2015; Accepteret: September 21, 2015; Udgivet: 13. oktober 2015

Copyright: © 2015 Kramer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er tilgængelige i de supplerende oplysninger filer eller via Pangea databasen. (doi: https://dx.doi.org/10.1594/PANGAEA.853591)

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af EU gennem det 7. rammeprogram KBBE (https://cordis.europa.eu/fp7/kbbe/about-kbbe_en.html) projektet MARINE SVAMPE (projekt nr. 265.926). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nye sekundære metabolitter produceret af svampe holde et stort potentiale i ansøgning til human brug [1, 2]. De to cyclodepsipeptider scopularides A og B er fremstillet efter en ascomycet, isoleret fra den indre væv i marine svamp

Tethya aurantium

[3]. Den svampestamme blev oprindeligt beskrevet som

Scopulariopsis brevicaulis

LF580. Nylige undersøgelser viste

S

.

brevicaulis

at være anamorf af

Microascus brevicaulis

[4-6]. Ifølge reglerne for nomenklaturen for svampe (6), navnet

Microascus brevicaulis

stammen LF580 bruges inden for denne manuskript.

Begge scopularides demonstrerede specifik aktivitet mod pancreas tumorcellelinier Colo357 og Panc89 samt colon tumorcellelinie HT29 [3]. Begge scopularides består af fem aminosyrer ringsluttes via en sidekæde (scopularide A: (

cyclo

– (3-hydroxy-4-methyldecanoyl- Gly-L-Val-D-Leu-L-Ala-L Phe); scopularide B:

cyclo

– (3-hydroxy-4-methylloctanoyl- Gly-L-Val-d-Leu-L-Ala-L-Phe)) i genomet analyse af

M

.

brevicaulis

LF580, 17 NRPS gener blev identificeret [7]. Den ansvarlige genklyngen for scopularide a omfatter en ikke-ribosomale peptid syntetase (NRPS1), en polyketidsyntase (PKS2), en CoA-ligase, en acyltransferase og en transkriptionsfaktor [7, 8]. på grund af den strukturelle lighed, antages en syntese af begge scopularides af det samme enzym-komplekset.

vildtypestammen LF580 repræsenterer en ikke-model sekundær metabolit producent, udstiller høje udbytter af målet metabolitter (ca. 200 mg L

-1 for scopularide a [9]). Ved hjælp af en optimeret screening tilgang [10], en UV-mutant stamme (

M

.

brevicaulis

stammen LF580-M26) blev registreret, hvilket viste en øget produktion på de to scopularides under standardbetingelser, hurtigere og anderledes vækst og ændringer i pellet formation. Således var dette mutantstamme LF580-M26 valgt til en detaljeret sammenligning med vildtypestammen på proteom niveau.

Sammenlignende proteom profilering hjælper til at forstå metaboliske ændringer mediering af cellulære metaboliske aktiviteter forekommer principielt på proteinniveau [ ,,,0],11, 12]. Kvantitative proteomics kan linke fysiologiske ændringer, vækst egenskaber og udvidet sekundær metabolit produktion med molekylære ændringer på proteom niveau. En kvantitativ sammenligning giver roman information om de regulatoriske involverede veje og bidrager til præcis belastning og procesudvikling [13-16]. På trods af deres forekomst i den bioteknologiske industri og deres betydning som patogener, trådsvampe fået mindre opmærksomhed under initiering og gennemførelse af innovative biologiske metoder og systemer biologi i fortiden [17]. Ligesom i den genomiske æra, trådsvampe er efternølere i proteomisk æra: I 2008, kun få svampeangreb proteomanalyse studier var til rådighed, primært beskrive klassiske model arter af de to slægter

Aspergillus

Penicillium

[15]. I dag, 250 svampeangreb proteomer er til rådighed, der repræsenterer mindre end 5% i forhold til de tilgængelige bakterielle proteomer (https://www.uniprot.org, August 2015). Molekylær hele celle analyser afslører omfattende indsigt især i ikke-modelorganismer, med oplysninger af reaktionen af ​​organismen til miljøforandringer. Nogle undersøgelser allerede gav et glimt af det enorme potentiale for proteomics:.

E

g

. den proteomanalyse af udviklingsstadier i

Cordyceps militaris

førte til konkrete udgangspunkter for stamme udvikling [18], proteomanalyse undersøgelser af

A

.

fumigatus

kaste nyt lys over sygdomsfremkaldende evne mekanismer [19], og den sammenlignende proteomanalyse af en

A

.

nidulans

stamme og dens mutantstamme afslørede de mange virkninger af gendeletioner [20, 21].

proteomanalyse teknikker er i rivende udvikling, men mange protokoller blev udviklet til kun et lille antal organismer. Næsten alle nye undersøgelser havde brug for en tilpasning af proteinet udvinding metode. Generelt svampe kendt for at have stive og komplekse cellevægge, hvilket er grunden til der kræves en særlig fokus på cellevæggen forstyrrelser under prøveforberedelse [17, 22, 23].

Formålet med denne undersøgelse var den proteomanalyse baseret karakterisering af forskellene mellem UV mutant LF580-M26 og dets vildtype (WT) stammen for at identificere de underliggende molekylære mekanismer for den øgede scopularide produktion af UV mutant stamme. Denne undersøgelse er den første proteomanalyse af en marine trådsvamp.

Resultater

Identifikation af lige prøveudtagningssteder ved bestemmelse af vækst egenskaber og scopularide produktions-

Som alle ændringer af cellulære metaboliske aktiviteter resulterer i ændringer på proteinniveauet, kan kun opnås en sammenlignende proteomanalyse af stammer med forskellig vækst adfærd og fysiologi ved at synkronisere den metaboliske egenskab af de to stammer. En sammenligning af deres vækst adfærd blev anvendt til at vælge høsten punkt, hvor begge stammer blev antaget at være i den samme vækst og produktionsfasen. Vækstkurver begge stammer blev opnået i tre eksemplarer og viste forskelle i væksten adfærd WT stamme LF580 og mutantstammen LF580-M26 (fig 1A). Indlysende forskelle var hastighed, pH, biomasse og scopularides produktion (Fig 1B) i de forskellige vækstfaser

(A) Tidsserier af biomassen (LF580: – ◆ – (lysegrå); LF580-M26.: – ▲ – (mørkegrå)) og pH-værdi (LF580: – ■ – (lysegrå); LF580-M26: – ● – (mørkegrå)) for vildtypestammen LF580 og dens mutantstamme LF580- M26 er vist. Bestemmelser blev udført i triplikater i 6 dage. (B) Produktionen af ​​scopularide A (LF580: – ◆ – (lysegrå); LF580-M26: – ▲ – (mørkegrå)) og B (LF580: – ■ – (lysegrå); LF580-M26: – ● – (mørkegrå)) under tidsserier sammenlignes på grundlag af toparealet af den respektive masse signal efter analytisk HPLC-MS. Kurverne repræsenterer tendensen linje.

Den hurtige vækst fase af mutant stamme LF580-M26 startede 20 timer efter podning. I modsætning hertil forsinkelsesfase af WT-stammen sluttede ca. otte timer senere. Idet produktion og pH biomasse som markører for svampevækst, kurverne afveg i varigheden af ​​den hurtige vækstfase, idet omtrent 24 timer for mutanten og 42 h for WT. Disse forskelle førte til vækstrater på 0,0715 g biomasse L

-1 h

-1 og 0,0426 g biomasse L

-1 h

-1 (baseret på biomasse: μX = dX (dt)

-1) for mutantstammen LF580-M26 og WT-stammen henholdsvis. Produktionen af ​​biomasse af begge stammer i løbet af denne fase viste ganske lignende værdier på 1,71 g biomasse L

-1 (mutant stamme LF580-M26) og 1,79 g biomasse L

-1 (WT stamme). Det endelige udbytte af begge stammer var i det samme område (LF580: 3,4 g biomasse L

-1, LF580-M26: 4,3 g biomasse L

-1). Svarende til kurven biomasse, progression af pH-kurven for mutantstammen LF580-M26 var temmelig eksponentiel i forhold til den lineære progression af pH-kurven for WT-stammen. Sammenligning af tidspunkt hvor begge stammer nået den laveste pH-niveau (angiver afslutningen af ​​hurtig vækst), en forskel på cirka 24 timer mellem de to stammer blev observeret. PH-værdien for WT-stammen forblev på dette niveau indtil afslutningen af ​​eksperimentet (120 timer). I modsætning hertil pH-værdien af ​​mutantstammen LF580-M26 begyndte at stige straks efter ankomsten den laveste pH-niveau med samme progression det havde været tidligere faldende. PH-værdien nåede et maksimum på 7,5 ved slutningen af ​​forsøget.

Begge stammer udviste kontinuerlig produktion af scopularides med lignende satser i den hurtige vækstfase. En drastisk ændring, der fører til klare forskelle mellem WT og mutant stamme blev observeret under overgangen fra slutningen hurtige til den tidlige stationære fase (Fig 1B): Den mutant stamme LF580-M26 passerede gennem denne overgang inden for 7 h, mens WT stamme brug for omkring 32 timer. Den scopularide produktionshastighed var 50 gange højere i mutant stamme i overgangsfasen. I den stationære vækstfase, faktoren faldt til ca. 10. I denne fase (

jeg

.

e

. 52 h og 72 timers dyrkning for LF580-M26 og LF580 henholdsvis) den produktion af både scopularides stagnerede i WT-stammen, mens produktionen i mutant stamme stadig øges, indtil ca. 100 h dyrkning, efterfulgt af et fald i koncentrationen af ​​begge scopularides. Den karakteristiske kompakt pellet dannelsen af ​​WT-stamme blev ikke observeret for mutantstammen LF580-M26. Pellet dannelse af WT-stammen startede på dag to efter inokulering; på dag tre omtrent 90% af pellets nået en størrelse på 2-3 mm i diameter; på dag fire pillen dannelse endte med diametre på 3-4 mm. Ingen signifikant stigning af pellet nummer kunne observeres efter fire dage. I modsætning hertil udviste LF580-M26 en stigende turbiditet af kulturen, med filamentøs vækst bliver til udviklingen af ​​behårede pellets (diameter ca. 1 mm). Viskositeten af ​​kulturerne forøges indtil dag fem af dyrkning

I betragtning af observerede forskelle, pH, biomasse og scopularides produktion blev anvendt som markører til bestemmelse tilsvarende prøveudtagningssteder:. Følgelig blev celler høstet efter 68 timer (WT-stamme LF580) og 44 timer (mutantstamme LF580-M26). På disse tidspunkter blev stammer antages at være i en sammenlignelig vækst tilstand, som pH (LF580: 4,62 ± 0,13; LF580-M26: 4.95 ± 0,17) og biomasse (LF580: 2,5 ± 0,2 mg ml

-1; LF580-M26: 2,6 ± 0,1 mg ml

-1) værdier var i samme størrelsesorden

Kvantitative Protein Extraction som en forudsætning for Proteome Studies

i tilfælde af det marine ikke. -model svamp

M

.

brevicaulis

stammen LF580 af denne undersøgelse yderligere metodiske tilgange og validering af protokoller var afgørende for at opnå proteomanalyse data af høj kvalitet. En simpel standard ekstraktionsprocedure baseret på celleødelæggelse ved sonikering førte ikke til en tilsvarende kvalitet (mønster) og mængde (intensitet) af proteiner for WT og mutantstammen, hvilket indikerer ufuldstændig ekstraktion. Derfor blev en tilpasset protein udvinding protokol udviklet og valideret. Fokus blev sat på cellesprængning og opløsning af proteinerne (fig 2). To cellesprængning procedurer blev sammenlignet: formaling i flydende nitrogen og anvendelse af perler. Yderligere blev fokus sat på opløsningen af ​​den uopløselige proteinfraktion, som pelleteret under den indledende adskillelse.

To forskellige cellesprængning metoder blev sammenlignet med hensyn til antallet af protein grupper identificeret under anvendelse nano-LC-MS /FRK. En yderligere fokus blev sat på solubiliseringen af ​​næppe opløseligt protein fraktion (H) ved siden af ​​opløseligt protein fraktion (S).

Anvendelse dette tilpasset protokol, en sammenlignelig udtræk klasse for WT og mutant stamme var bevist ved SDS-PAGE før fordøjelse af den endelige proteinekstrakt (resultater ikke vist). For at kunne sammenligne de udvinding kvaliteter af de forskellige prøver præparater (fig 2), blev proteomanalyse data analyseret prøve ved prøve med nano-LC-MS /MS. Tidligere undersøgelser har vist, at hele genomet af

M

.

brevicaulis

har en størrelse på ca. 32 Mb, som indeholder 16.298 gener. 1,33% af genomet repræsenterede gentagelser [7, 24]. Her blev 4759 proteiner identificeret (FDR 0,01 og 1 ≥ peptider per protein) ved hjælp af de udviklede ekstraktionsprocedurer i begge stammer. Dette afspejler dækning på ca. 30% af det teoretiske protein nummer. Proteiner opnået ved flydende nitrogen ekstraktion dækkede 92,2% af disse 4759 proteiner. Sammenlignet med dækning af 88,1% under anvendelse af perle-baserede ekstraktion, derfor flydende nitrogen ekstraktion ført til en stigning på 4,1% af proteiner, der er omfattet. En cirka tre gange større stigning (11,4%) blev opnået ved opløsning af de “næppe opløselige” proteiner (92,2%), i stedet for kun at fokusere på de “let opløselig” protein fraktion (80,8%). Denne stigning var uafhængig af den oprindelige celle forstyrrelser metode.

Sammenligning af proteomer af vildtypestammen LF580 og dens UV mutant stamme LF580-M26

Analyse af veje og proteinholdige funktioner.

En kombination af alle fraktioner fra de flydende nitrogen behandlede celler blev anvendt til kvantitativ sammenligning i iTRAQ mærkning. 3526 gensidige proteiner blev trygt identificeres og kvantificeres i WT og mutant stamme LF580-M26 (FDR 0,01 og 2 ≥ peptider per protein). 318 proteiner blev differentielt reguleret: 129 proteiner blev opreguleret og 189 blev nedreguleret i mutantstammen sammenlignet med WT-stammen. Til identifikation af molekylære processer og cellulære aktiviteter, blev sæt af differentielt regulerede proteiner underkastet GO analyse [25] (figur 3). De enzym funktionaliteter blev afsløret ved hjælp Kegg [26], forudsige effekter af mutationen på celle- og metaboliske niveauer (Fig 4).

3526 proteiner blev kvantificeret ved hjælp iTRAQ mærkning. 318 (9%) viste en signifikant regulering i mutantstammen. 129 (3,7%), blev opreguleret og 189 (5,3%), blev nedreguleret. Søjlediagrammet viser procentdelen af ​​op- og nedreguleret proteiner sorteres til de forskellige kategorier på grundlag af GO annotation.

Mørkegrå diagrammer repræsenterer nedreguleret proteiner i mutant stamme, lysegrå, i modsætning de opreguleres dem. Tallene afspejler sekvenserne af enzymer sorteret til de forskellige kategorier.

Evalueringen af ​​GO data blev udført ved hjælp af et sæt af udvidede kategorier,

jeg

.

e

. underniveauer af GO kategorier [27]. Vigtigste forskelle blev fundet i de kategorier af katabolisme, pellet dannelse og replikation. De to sidstnævnte kategorier viste en tydelig opregulering i mutant med faktorer af 3,2 (pellet dannelse) og 3,5 (replikation), hhv. Imidlertid pelletdannelse repræsenterer en kategori med en lille datasæt af proteiner (1,6% op- og 0,5% nedreguleret). En klar nedregulering blev set for protein grupper relateret til kategorierne katabolisme, opbevaring, stress respons og død. 18,6% af de proteiner relateret til kategorien katabolisme blev opreguleret og 33,3% nedreguleres. I kategorien anabolisme, omtrent det samme antal proteiner var op- eller nedreguleret: 10,1% og 9,5%, henholdsvis. Små forskelle kunne ses for kategorierne cellevæggen (forhold på 1,5) og transport (forhold på 1,3). Inden for kategorierne oplagring (0,5%), stressrespons (4,2%) og død (2,1%) blev kun fundet nedreguleret proteiner. Antallet af ukendte proteiner var næsten den samme for op- og nedreguleres datasæt (17,8% og 16,9%, henholdsvis). 12,4% (0,8% opreguleres, 11,6% nedreguleret) af de regulerede proteiner kunne ikke henføres til en af ​​kategorierne.

Kegg pathway analyse aktiveret kvalifikation af alle nødvendige enzymer i det centrale stofskifte (se afsnit nedenfor). Generelt blev ekspressionsniveauerne af de fleste enzymer nedreguleret i mutantstammen (fig 4). Inden for kategorien “biosyntesen af ​​sekundære metabolitter” et lige antal enzymer var op- og nedreguleres. I kategorierne lipidmetabolismen, metabolisme af cofaktorer og vitaminer, metabolisme af terpenoider /polyketider og oversættelse, et større antal enzymer afslørede højere ekspressionsniveauer i mutantstammen.

Kegg og gå data blev anvendt til en detaljeret sammenligning af WT stamme og mutantstammen LF580-M26.

katabolisme.

GO kategori af katabolisme viste en højere antal proteiner, der skal nedreguleres i mutantstammen (fig 3). Men nedregulering afspejler ikke en generel afmatning af katabolisme. For eksempel, peptidase-inhibitor i9 (g7795), en inhibitor for kataboliske processer, viste en nedregulering i mutantstammen, hvilket indikerer en forøgelse af kataboliske processer. Evalueringen af ​​Kegg data bekræftede denne antagelse, fordi en nedregulering hovedsageligt blev set på enzymniveau for yderligere veje og isoenzymer i mutantstammen, sandsynligvis fører til højere fluxe i de centrale veje.

Alle enzymer af en klassisk Embden-Meyerhof-vejen (glykolyse) var til stede og aktiv, så vækst på glucose som forventet for en typisk eukaryot. Derudover kunne alle enzymer, der er nødvendige for den indledende nedbrydning af andre mono- og disaccharider være kvalificeret. Væksten medium indeholdt glukose som kulhydratkilde, men sojapepton og gærekstrakt var kilder til yderligere monomere sukkerarter (efter leverandørernes certifikater for analyser). Udtrykket af alle glycolytiske enzymer var den samme i WT stamme og mutant stamme LF580-M26.

pentosephosphatvejen (PPP) kunne betegnes. De fleste enzymer blev nedreguleret i mutantstammen, såsom fructose-biphosphatase (EF 3.1.3.11). WT anvendte stamme både fruktose-biphosphatase (EF 3.1.3.11) og 6-phosphofructokinase (EF 2.7.1.11). Med hensyn til oxidative side blev vejen fra d-gluconat-6-phosphat til d-ribose-1-phosphat nedreguleret i mutantstammen. WT kan opnå en kørende PPP, da det resulterer i ekstra NADPH, som er nødvendig for ammonium optagelse samt for protein biosyntese. Generelt større efterspørgsel efter NADPH øger fluxen gennem PPP [28]. Det højere niveau af protein-ekspression i PPP i WT angivet en sådan stigning i flux [29].

Som forventet for en eukaryot organisme, blev pyruvat genereres i glycolysen kanaliseres via den klassiske pyruvat dehydrogenase komplekset i tricarbonic syre cyklus (TCA). Den fulde TCA var operativ i den kataboliske retning i begge stammer. Imidlertid viste, mutantstammen LF580-M26 nedregulering af nogle enzymer: Det første trin af kondensationen af ​​oxaloacetat og acetyl-CoA til citrat katalyseres af en citratsynthase (EF 2.3.3.8) i mutantstammen.

M

.

brevicaulis

stammen LF580-M26 bruger et skridt isocitratdehydrogenase isoform (EF 1.1.1.41) genererer NADH. WT desuden udtrykte totrins isocitratdehydrogenase (EF 1.1.1.42) genererer NADPH. Udnyttelse dette enzym, kan WT hæve NADPH niveau,

e

.

g

. for øget ammonium optagelse eller højere niveauer af oversættelse. Det samme fænomen blev observeret for succinat-dehydrogenase, som er til stede i WT stamme som EF 1.3.99.1 og EF 1.3.5.1. Sidstnævnte isoform er membranbundet og en del af det respiratoriske elektrontransportkæden. Det blev fundet på samme oversættelse niveau i begge stammer. Omdannelsen af ​​CoA-aktiverede carboxylsyrer (acetat, butyrat, acetoacetat) blev nedreguleret på niveauet for acetat CoA-transferase (EF 2.8.3.8), hvilket fører til et højt niveau af aktiverede substrater i TCA og efterfølgende flux i mutantstammen .

CoA-transferase (EF 2.8.3.8) og beslægtede enzymer af β-oxidation blev nedreguleret i mutantstammen angiver lavere niveauer af β-oxidation. Nedregulering af propionyl-CoA-omdannende enzymer, såsom 2-methylcitrate syntase (EF 2.3.3.5) og den efterfølgende dehydratase (EF 4.2.1.79), faldt sammen med lavere niveauer af β-oxidation, som propionyl-CoA dannes via nedbrydningen af ulige fedtsyrer. I modsætning hertil viste WT højere niveauer af disse enzymer, som kan forklares ved nedbrydning af storage-forbindelser (

jeg

.

e

. Fedtsyrer) fremkaldt af en carbon begrænsning inden de dannede pellets .

Enzymer af den respiratoriske kæde (oxidativ phosphorylering) var kvalificeret og viste ingen forskel i proteinet ekspressionsniveauet mellem mutant og WT-stamme.

Aminosyre nedbrydning og nitrogenmetabolisme var kvalificeret, hvilket indikerer, at NADP-glutamat dehydrogenase (EF 1.4.1.4) blev anvendt af begge stammer at assimilere fri ammonium fra mediet. I mutantstammen blev yderligere ammonium optagelse via glutaminsyntetase-glutamin oxoglutarat aminotransferase (GOGAT) cyklus nedreguleret på niveauet for konvertering fra glutamat til glutamin ved glutaminsyntetase (EF 6.3.1.2).

NAD -specifik glutamat dehydrogenase (EF 1.4.1.2 omdannelse glutamat til ketoglutarat og ammonium eller i omvendt) blev nedreguleret i mutantstammen. En sådan nedregulering blev vist for fungale celler ikke begrænset i deres nitrogen- eller carbonkilder [30, 31]. Vice versa, vil NAD-specifikke glutamat dehydrogenase blive aktiveret, hvis en stamme er begrænset i en af ​​disse kilder. Som scopularide produktion er nitrogen afhængig [9], proteomet data indikerer en nitrogen begrænsning af WT i det anvendte medium. I modsætning hertil blev alle veje til yderligere forstærkning af nitrogen nedreguleret i mutantstammen, som ikke synes at være nitrogen begrænset.

Generelt aminosyre nedbrydning er aktiv, så stammerne til dyrkes på pepton medium . Omdannelse af aminosyrerne til acetyl-CoA til efterfølgende respiration blev forstærket på niveau med de respektive acetyl-CoA C-acyltransferaser (EC 2.3.1.16). Ikke desto mindre nedbrydning af aminosyrer er nødvendige for produktionen af ​​scopularides blev nedreguleret (se nedenfor).

Anabolisme.

Evalueringen af ​​GO data viste et tilsvarende antal proteiner grupperet i kategorien af anabolisme at være op- og nedreguleres. Den Kegg pathway analyse tillod en mere detaljeret visning

De enzymer klassiske Embden-Meyerhof (EM) vej i eukaryoter normalt tjene i to retninger:. For glykolyse og glukoneogenese. Derfor er tilstedeværelsen af ​​en arbejdsgruppe EM pathway indikerer gluconeogenese opererer via samme vej. Da nogle reaktioner EM-vejen er irreversible, er nødvendige for glukoneogenese yderligere reaktioner: Den eukaryote glucogenetic vigtige enzymer 1,6-fructose bisphosphatase (EF 3.1.3.11) og phosphoenolpyruvatcarboxykinase (EF 4.1.1.49) var kvalificerede og vist at blive nedreguleret i mutantstammen. Den tredje enzym, en glucose-6-phosphatase (EF 3.1.3.9), kunne ikke være kvalificeret i begge stammer. Dette indikerede en direkte omdannelse af gluconeogenetic glucose-6-phosphat til glucose-1-phosphat til dannelsen af ​​cellen kuvert og andre polymere sukkere til opbevaringsformål. Som det var tilfældet for andre gluconeogenetic enzymer, blev den respektive glukose fosfat mutase (EF 5.4.2.2) vist sig at være nedreguleret i mutant stamme.

Internt lager sukker (

e

.

g

. glykogen dannelse) var ikke aktiv i mutant stamme. Alle tilgængelige glucose direkte ind i glycolytiske vej som angivet ved nedregulering af alle enzymer, der er nødvendige for polymer nedbrydning sukker. Den nedregulering af glukose fosfat mutase (EF 5.4.2.2) støttede denne hypotese, da dens aktivitet er en forudsætning for at omdanne sukker til opbevaring polysaccharider.

ketosyrer af TCA tjene som starteren molekyler for biosyntesen af ​​aminosyrer og andre molekyler. Fjernelsen af ​​disse ketosyrer fra TCA ved anabolske reaktion formindsker flux af de kataboliske reaktioner og dermed af den energiske udbytte. Derfor har mange af de anabolske reaktioner starter ved TCA blev nedreguleret i mutantstammen, såsom succinat-dehydrogenase (EF 1.2.1.16), 4-aminobutanoat-transaminase (EF 2.6.1.19) og malat-dehydrogenase (EF 1.1.1.38).

aminosyrebiosyntese veje blev kvalificeret, men ingen forskelle mellem stammerne blev observeret. Proteomet data viste, at LF580 brugte alfa-aminoadipat vej for lysin biosyntese.

Transport.

Et tilsvarende antal proteiner knyttet til transport processer var op- og nedreguleres. Opreguleres proteiner var involveret i transporten af ​​aminosyrer samt af ilt ind i cellerne. Især et protein (fosfat-repressible fosfat permease, g10374) med ansvar for den regulerede optagelse af fosfor blev nedreguleret; i stedet en ikke-reguleret fosfor transport er til stede. Reguleringen af ​​indtag af kvælstof (

jeg

.

e

. Nitrat) blev nedreguleret (nitrat assimilation regulatorisk protein Nira, g12583), og er i overensstemmelse med nedregulering af alle veje til ekstra gevinst på nitrogen i mutantstammen.

proteiner involveret i intracellulær transport blev nedreguleret i mutantstammen, f.eks proteiner tilhørende Golgi-apparatet, peroxisomet og vesikel transport.

Replication, morfologi, celle integritet og vedligeholdelse.

vækst forskelle blev tydeligt afspejlet i kategorierne replikation og pellet formation. Sammenlignet med WT-stammen tre gange flere proteiner tilhører disse to kategorier blev opreguleret i mutantstammen (fig 3). Nogle proteiner blev nedreguleret, såsom ekstracellulære serin-rige protein (g7517), der var tilsluttet den sene udviklingsfase [32]. Imidlertid blev ændringer af proteiner involveret i pellet morfogenese ikke overholdes.

mutant stamme viste nogle opreguleret proteiner involveret i vedligeholdelsesfunktioner,

e

.

g

. omdannelse af glycin til aminolevulinat (5-aminolevulinatsynthaseaktivitet, EF 2.3.1.37) til efterfølgende porphyrin syntese. Opregulering af dette enzym kan være relateret til øget respiratorisk kæde vedligeholdelse. Højere niveauer af respiration i mutant stamme indblande højere beskyttelsesniveauer mod oxidativt stress. For eksempel den kerneprotein qri2 nse4 (g3175), som virker i DNA-reparation, blev opreguleret i mutantstammen [33].

Men gener involveret i stressrespons viste højere ekspressionsniveauer i WT. I betragtning af begrænsning situation for WT grund pelletdannelse (

i

.

e

. Næringsstof stress, lavt pH ved afslutningen af ​​vækstfasen), sådanne stress svar ville forventes [34 , 35]. Et eksempel er en højere grad af peroxisomal katalase (g8585), som er nedreguleret i mutantstammen. Yderligere proteiner i reparation og stress respons blev nedreguleret:

e

g

.. Tam domæne methyltransferase (g15885) at bevare integriteten af ​​polypeptider står aldersafhængige ikke-enzymatiske reaktioner [36]; sphingomyelin phosphodiesterase (g8757) [37] og overlevelse protein Sure-lignende fosfatase /nukleotidase (g13733). Sidstnævnte kan være involveret i stress respons, som celler med mutationer i sikker gen dårligt overleve i den stationære fase [38].

Sekundær stofskifte.

I alt 39 biosyntetisk enzym komplekser var identificeret i genomet af

M

.

brevicaulis

. 17 var tilsluttet nationale reformprogrammer, 18 til PKS, to til fedtsyre ligase og én repræsenterede en PKS /nationale reformprogrammer hybrid [7, 24]. Ud af disse gener, blev 9 nationale reformprogrammer og 7 PKS proteiner kvalificeret i GO datasættet. iTRAQ kvantificering viste en højere ekspression af NRPS13 og PKS15 og en nedre ekspression af PKS 9, 14 og 18 i mutanten. Men funktionen af ​​disse enzymer fortsat uklart, da de sekundære metabolit profiler af WT og mutant er meget ens

Konkret reguleringen af ​​de respektive biosyntese veje for de fem aminosyrer danner scopularides A og B blev sammenlignet.: de veje for L-valin, L-phenylalanin, L-alanin, d-leucin og glycin syntese var kvalificeret, hvilket indikerer, at

M

.

brevicaulis

syntetiseret alle precursor molekyler til scopularides. Dette understøttes af tidligere vækst undersøgelser, der viste, at aminosyrer fra næringskilder ikke tjener som direkte forløbere for scopularide produktion [9]. Nedbrydningen af ​​aminosyrer er nødvendige for scopularide produktion blev signifikant nedreguleret i mutantstammen: Alanin nedbrydning blev nedreguleret på niveauet for alanin-glyoxylat transaminase (EF 2.6.1.44) og 4-aminobutyrat-2-oxoglutarat transaminase (EF 2.6.1.19) . Valin nedbrydning blev blokeret på niveauet for methylmalonat-semialdehyd-dehydrogenase (EF 1.2.1.27). [17]. [10].