PLoS ONE: multipolær Spindel Pole Sammensmeltning er en vigtig kilde for Kinetochore Mis-Attachment og kromosom Mis-Adskillelse i Cancer Cells

Abstrakt

Mange kræftceller vise en CIN (

C

hromosome

I

stabilitet) fænotype, hvorved de udviser høje kromosom tab eller gevinst på hver celle cyklus. I årenes løb, en række forskellige mekanismer, herunder mitosespindelen multipolaritet, cytokinese svigt, og merotelic kinetochore orientering, er blevet foreslået som årsag til CIN. Men en omfattende teori om, hvordan CIN foreviget mangler stadig. Vi brugte CIN kolorektal cancer celler som en model for at undersøge den mulige cellulære mekanisme (r) underliggende CIN. Vi fandt, at CIN celler ofte samles multipolære spindler i begyndelsen mitose. Imidlertid multipolære anafase-celler var meget sjælden, og levende celle eksperimenter viste, at næsten alle CIN celler opdelt i en bipolær måde. Desuden viste fast celle analyse høje frekvenser af merotelically knyttet tilbagestående kromosomer i bipolar anafase CIN celler og højere frekvenser af merotelic vedhæftede filer i multipolære vs bipolar prometaphases. Endelig fandt vi, at multipolære CIN prometaphases typisk besad γ-tubulin overhovedet spindel poler, og at en betydelig del af bipolar metafase /tidlig anafase CIN celler besad mere end én centrosom ved en enkelt spindelpol. Tilsammen vores data tyder på en model, som let kan etableres merotelic kinetochore vedhæftede filer i multipolære prometaphases. De fleste af disse multipolære prometafasen celler ville derpå bi-polarisere før anafase debut, og de resterende merotelic vedhæftede filer ville producere kromosom mis-segregation grund anafase halter kromosomer. Vi foreslår denne spindel pole sammensmeltning mekanisme som en stor bidragyder til kromosom ustabilitet i kræftceller

Henvisning:. Silkworth WT, Nardi IK, Scholl LM, Cimini D (2009) multipolær Spindel Pole Sammensmeltning er en vigtig kilde for Kinetochore mis-Attachment og kromosom mis-Adskillelse i kræftceller. PLoS ONE 4 (8): e6564. doi: 10,1371 /journal.pone.0006564

Redaktør: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, England

Modtaget: May 10, 2009; Accepteret: 3 juli 2009; Udgivet: 10 August, 2009

Copyright: © 2009 Silkworth et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. IKN var en modtager af en Fralin Summer Undergraduate Research Fellowship i sommeren 2008 og sommeren 2009. Dette arbejde blev delvist støttet af NSF give MCB-0.842.551 og Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust give J-828 til DC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Præcis mitotisk kromosom adskillelse er nødvendig for at opretholde en diploid kromosom nummer. De fleste cancerceller er aneuploid [1], blev foreslået [2] og aneuploidi, allerede et århundrede siden, for at være en årsag til kræft [3]. Ud over denne aneuploid tilstand, mange cancerceller udviser høje kromosom mis-segregation (dvs. optagelse eller afgivelse af hele kromosomer) ved hver celle cyklus, omhandlede betingelse som kromosom ustabilitet eller CIN [4] – [6], som bidrager til at opretholde et højt niveau af aneuploidi. En række undersøgelser har forsøgt at identificere defekten (r) i mitotisk kromosomsegregering potentielt ansvarlige for CIN. Tidlige undersøgelser antydet defekter i den mitotiske checkpoint som den vigtigste årsag til CIN [7]. Imidlertid har efterfølgende arbejde vist, at de fleste CIN cancerceller har en robust kontrolpunkt [8] og deres reaktion på mitose forstyrrende behandlinger er fuldstændig identisk med den respons af ikke-CIN-celler [8], [9]. Cytokinese fiasko er også blevet foreslået i fortiden som en mulig årsag til CIN [10], [11]. Imidlertid ville cytokinese svigt fremstille en enkelt polyploid datter celle, og kunne ikke forklare CIN, der er defineret som den mis-segregation af chromosomer til højere rater. Som et resultat, CIN producerer både høje niveauer af aneuploidi og store variabilitet i kromosom kopital i befolkningen [4], hvorimod cytokinese svigt simpelthen ville resultere i en fordobling af kromosom nummer. Således cytokinese fiasko

per se

kan ikke forklare CIN, medmindre den efterfølges af andre kromosomfejl mis-segregation begivenheder, hvor enkelte kromosomer (snarere end hele genomet) er mis-adskilte. Andre undersøgelser foreslog multipolaritet som en potentiel årsag til CIN [12] – [15] baseret på den iagttagelse, at kræftceller fra mange steder (anmeldt i [1]) ofte samle multipolære spindler (som regel ledsaget af centrosom forstærkning). Selvom multipolær kromosom adskillelse sikkert ville føre til omfattende kromosom mis-segregation, en række undersøgelser antydet, at mange af disse multipolære celler kan gennemgå en proces med spindel pole sammensmeltning /klyngedannelse [16], [17], hvilket ville forhindre de massive kromosom mis -segregation der ville være forbundet med multipolær kromosom segregation. Det er blevet foreslået, at denne spindelpol sammensmeltning mekanisme ville giver en selektiv fordel til celler, hvis aneuploidi niveauer ellers ville være så alvorlige at resultere i celledød [18], [19]. Endelig har en række undersøgelser fundet høje frekvenser af anafase halter kromosomer (dvs. kromosomer, der ikke adskille til spindlen pole, men halter bagefter på spindlen ækvator under anafase) i forskellige kræftceller, herunder orale kræftceller [20], [21], humane brystkræftceller [22], [23], ovariecancer celler [24], og kolorektal cancer celler [22]. En af disse undersøgelser [22] viste også, at de tilbagestående kromosomer merotelically blev orienteret (dvs. deres kinetochore var bundet til mikrotubuli fra både spindel poler snarere end blot én). Sammenfattende har mange alternative mekanismer CIN blevet foreslået i årenes løb; dog en omfattende teori om, hvordan CIN foreviget mangler stadig, og det er ikke klart, om nogen sammenhæng mellem nogle af disse mekanismer eksisterer.

I denne undersøgelse anvendte vi CIN kolorektal kræftceller som modelsystem til undersøge den mulige cellulære mekanisme (r) underliggende CIN. Vi fandt, at CIN celler ofte samles multipolære spindler i begyndelsen mitose, men multipolære anaphases var meget sjældne, og næsten alle CIN celler opdelt i en bipolær måde. Vi fandt også, at bipolar anafase CIN celler udviste høje frekvenser af merotelically knyttet tilbagestående kromosomer. Desuden er en betydelig del af bipolar metafase /tidlig anafase CIN celler besad mere end én centrosom ved en enkelt spindelpol. Endelig fandt vi høje frekvenser af merotelic vedhæftede filer i multipolære prometaphases. Tilsammen vores data tyder på en model, som let kan etableres merotelic kinetochore vedhæftede filer i multipolære prometaphases. De fleste af disse celler ville derpå bi-polarisere før anafase debut, og de resterende merotelic vedhæftede filer ville producere kromosom mis-segregation grund anafase halter kromosomer. Vi foreslår denne spindel pole sammensmeltning mekanisme som en stor bidragyder til kromosom ustabilitet i kræftceller.

Resultater

CIN kolorektal kræftceller besidder multipolære spindler i prometafasen, men ikke i anafase

tyktarms kræftceller kan opdeles i to grupper [5], [25], dem, der udviser CIN, og dem, der ikke traditionelt opkaldt MIN grund af deres typiske

M

icrosatellite

i

stabilitet. På grund af denne egenskab, colorektale cancerceller repræsenterer en særlig interessant model til undersøgelse kromosom mis-segregation i cancerceller, fordi MIN celler kan anvendes som en eksperimentel kontrol for CIN celler. Til denne undersøgelse valgte vi to CIN kolorektal cancer cellelinier (HT-29 og SW620) og en MIN colorektal cellelinie (HCT116). For at identificere mitotiske defekter potentielt ansvarlige for kromosom mis-segregation i CIN celler, vi udførte Immunofarvning eksperimenter at mærke kinetochores (ved hjælp af CREST-antistoffer) og mitosespindler (ved hjælp af anti-a-tubulin-antistoffer) i CIN og MIN celler. Vi anvendte derefter høj opløsning konfokal mikroskopi til at identificere prometafasen defekter i både CIN og MIN-celler (figur 1). Vi fandt, at den mest fremtrædende prometafasen defekt i CIN-celler var spindel multipolaritet og at CIN prometafasen celler udviste multipolære spindler (figur 1A) ved frekvenser, der var signifikant højere end dem, der findes i MIN-celler (Figur 1B). De fleste af de multipolære spindler udviste en trepolet eller tetrapolar morfologi, selv om også blev observeret multipolære celler med 5-8 spindel poler (5,4%, 19,5% og 7,9% af alle multipolær HCT116, HT-29, og SW620, henholdsvis). Vi kiggede derefter på multipolaritet i anafase celler, og fandt, at frekvensen af ​​multipolære spindler i anafase CIN celler var meget lavere end dem, der findes i prometafasen (figur 1B). Desuden var der ingen forskel mellem MIN og CIN celler i hyppigheden af ​​multipolære anaphases (figur 1B).

A. Eksempler på MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) prometafasen celler immunofarvede for α-tubulin (rød, venstre kolonne) og kinetochores (grøn, midterste kolonne). Alle billederne er maksimal intensitet fremskrivninger af stakke af optiske sektioner erhvervet 0.6 um intervaller gennem cellen Z-aksen. Flettede billeder er vist i højre kolonne. For hver cellelinie er et eksempel på bipolære prometafasen og en af ​​multipolære prometafasen vist. Scale bar, 5 um. B. Hyppigheden af ​​prometafasen og anafase celler med multipolære spindler. De viste data repræsenterer midler og standardfejl (barer) af fire uafhængige forsøg. Multipolær CIN prometaphases var signifikant hyppigere end multipolære MIN prometaphases (χ

2 test, P 0,001 for både HT-29 og SW620 i forhold til HCT116). Men indtraf, multipolære CIN anaphases ved lave frekvenser, der ikke adskiller sig fra dem af multipolære MIN anaphases.

Både CIN og MIN celler deler i en bipolar mode, men mitose varer længere i CIN celler

De lave frekvenser af multipolære spindler i anafase CIN celler foreslog, at multipolære prometaphases måske ikke fuldføre en multipolær division, men måske i stedet støder forskellige skæbner. Nogle muligheder omfatter mitosestandsning, mitotisk celledød, eller mitotisk skred. For at bestemme den mulige skæbne (r) af mitotiske CIN cancerceller, udførte vi time-lapse eksperimenter. I hvert eksperiment blev flere synsfelter udvalgt og afbildes af fasekontrastmikroskopi med et 20 x objektiv på et omvendt mikroskop forsynet med en fuldt automatiseret stadium. Billederne blev optaget hver 30 sek i tre timer. De time-lapse film blev efterfølgende analyseret for at bestemme varigheden af ​​mitosen og skæbne af celler ind mitose i løbet af optagelsen. Som forventet fra vores faste-celle-data (fig. 1B), vi sjældent observeret kromosomsegregering at forekomme i en multipolær måde (figur 2A). I de fleste celler, kromosomer adskilt i to grupper på hver sin side af cellen, og en enkelt cytokinetic fure dannet mellem dem (Video S1). Antallet af celler, der udviser multipolær kromosom segregering i vores live-cell eksperimenter (figur 2A) var ikke signifikant forskellig (χ

2, P 0,37 for alle tre cellelinier) fra antallet af multipolære anafase celler vi fandt i fast celle eksperimenter (figur 1B). Desuden fandt vi, at 40-67% af CIN celler udviser multipolær kromosom adskillelse undladt at fuldføre cytokinese (figur 2A), mens der var ingen tilfælde af cytokinese fiasko i celler, der udviser bipolar kromosom adskillelse. Endelig har vi ikke finde nogen tegn på vedvarende mitosestandsning, celledød under mitose, eller mitotisk skred. Disse data indikerer, at de fleste af kromosomet ustabilitet i CIN-celler skal stamme fra kromosom adskillelse fejl i celler deler sig i en bipolær måde og gennemfører celledeling. Vores levende celle eksperimenter viste også, at den tid i mitose, målt som den forløbne tid fra starten af ​​celle afrunding til anafase debut, var signifikant længere i CIN celler i forhold til MIN-celler (tabel 1), på samme måde som, hvad andre har fundet i andre cancer cellelinjer [26].

A. Frekvensen af ​​celler, der udviser multipolær kromosom segregering i fase-kontrast time-lapse eksperimenter. B. Frekvenser af bipolar anafase MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) celler med tilbagestående kromosomer. De viste data repræsenterer midler og standardfejl (barer) af fire uafhængige forsøg. Frekvensen af ​​anafase halter kromosomer var signifikant højere i CIN end MIN-celler (χ

2 test, P 0,001 for både HT-29 og SW620 i sammenligning med HCT116). C. Eksempler på MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) anafase-celler immunofarvede for α-tubulin (rød, første kolonne) og kinetochores (grøn, anden kolonne). Billederne er maksimal intensitet fremskrivninger af stakke af optiske sektioner erhvervet 0.6 um intervaller gennem cellen Z-aksen. Flettede billeder vises i den tredje kolonne. For hver cellelinie er et eksempel på normal anafase og en anafase med en tilbagestående kromosom vist. Kolonnen yderst til højre viser cellerne med halter kromosomer på et enkelt brændplan, hvor kontrasten er blevet forbedret, fremhæve de merotelic forbindelser af tilbagestående kromosom kinetochore. Scale bar, 5 um.

Bipolar anafase CIN celler udviser høje frekvenser af merotelically knyttet tilbagestående kromosomer

Som beskrevet ovenfor, multipolaritet var almindelig i CIN prometafasen celler, men det blev sjældent observeret i anafase (figur 1B), og de fleste CIN celler adskilt deres kromosomer i en bipolær måde (figur 2A). Dette indikerede, at multipolær kromosom adskillelse er en usandsynlig årsag til kromosom ustabilitet i CIN celler, og foreslog, at fejl opstår under bipolar kromosom adskillelse var den mest sandsynlige årsag til CIN. For at identificere sådanne potentielle fejl, brugte vi i høj opløsning konfokal mikroskopi til at analysere anafase celler med immunofarvede kinetochores og mikrotubuli (Figur 2C). Vi fandt, at bipolar CIN anafase celler merotelically besad vedhæftet tilbagestående kromosomer (dvs. kromosomer, der sakkede agterud på spindel ækvator i stedet for adskillelse til spindlen pol, og hvis kinetochore var bundet til bundter mikrotubuli fra både spindel poler snarere end blot én; Figur 2C , højre spalte) ved højere frekvenser end MIN-celler (figur 2B). Interessant, frekvenserne af anafase celler med halter kromosomer var meget lig de frekvenser af multipolære prometafasen celler (sammenligne figur 1B med figur 2B).

Både multipolære og bipolære CIN celler besidder flere centrosomer

de lave frekvenser af multipolære anaphases sammenlignet med dem af multipolære prometaphases (Figur 1B) og den bipolære kromosomsegregering observeret i levende celler (figur 2A) foreslog, at de fleste af de multipolære spindler kan bipolarize før anafase indtræden. For at teste denne hypotese, udførte vi γ-tubulin farvning i kombination med mikrotubulus og kinetochore immunfarvning på CIN-celler på forskellige stadier af mitose (figur 3A-B). Høj opløsning konfokal mikroskopi afslørede, at i prometafasen CIN celler, γ-tubulin farvning var til stede på alle spindel poler i over 95% af cellerne (figur 3A). Dernæst så vi på bipolære metafase /tidlig anafase-celler (figur 3B) og fandt, at et betydeligt antal celler udviste multiple γ-tubulin-positive prikker på en enkelt spindelpol (figur 3B-C), hvilket antyder, at nogle af spindel poler stede i multipolære prometafasen celler kan bevæge sig tæt på hinanden på senere mitotiske faser for at generere to fokuserede spindel poler og dermed en bipolar spindel. Det skal bemærkes, at de observerede frekvenser (6,8% og 10,5% for HT-29 og SW620, henholdsvis) kunne undervurdere det faktiske antal spindel poler undergår denne sammensmeltning proces, som nogle af dem kan bevæge sig så tæt på hinanden til at fremstå som én efter γ-tubulin farvning.

figuren viser eksempler på multipolær prometafasen (A) og bipolar metafase (B) CIN-celler immunofarvede for α-tubulin, kinetochores, og γ-tubulin. Billeder viste blev opnået ved at sammenlægge maksimal intensitet fremskrivninger af enten α-tubulin og CREST (kinetochores) billeder (venstre kolonne) eller α-tubulin og y-tubulin-billeder (højre kolonne). A. De fleste multipolære prometafasen celler (eksakte procenter vist i nederste højre hjørne af de rigtige paneler) udviste γ-tubulin farvning på alle spindel poler. B. Eksempler på bipolar metafase CIN celler med multiple centrosomer til fast spindelpol (pilene peger på γ-tubulin-farvede prikker). Scale bar, 5 um. C. Hyppigheden af ​​bipolære metafase /tidlig anafase CIN celler besidder flere centrosomer (som visualiseret ved γ-tubulin farvning) på en enkelt spindel pol.

Højere frekvenser af merotelic vedhæftede filer i multipolær vs bipolar prometafasen CIN celler

de mange y-tubulin signaler på spindel poler bipolar metafase CIN celler sammen med forekomsten af ​​tilbagestående kromosomer i bipolar anaphases ved frekvenser, der nøje ligner frekvenserne af multipolære prometaphases, foreslog, at merotelic vedhæftede filer kan være fortrinsvis dannet i multipolære prometafasen celler, som efterfølgende bi-polarisere af spindelpol sammensmeltning. For at teste denne hypotese anvendte vi høj opløsning konfokal mikroskopi kombineret med 3-D visualisering og billedbehandling (se materialer og fremgangsmåder for detaljer) at identificere merotelic kinetochores i koldt-behandlet (for at inducere ikke-kinetochore mikrotubulus demontering, men bevare kinetochore mikrotubuli ) prometafasen CIN celler immunofarvede for kinetochores og mikrotubuli (Figur 4A-D). Vi bestemt antal merotelic kinetochores i bipolar vs. multipolær prometafasen CIN celler ved at identificere alle de kinetochores bundet til to mikrotubuli bundter orienteret i modsatte retninger, og fandt, at multipolære prometafasen celler besad signifikant højere antal merotelic vedhæftede filer end bipolære prometafasen celler (figur 4E ), hvilket tyder på merotelic vedhæftede filer i sådanne multipolære prometaphases som en vigtig kilde til tilbagestående kromosomer i bipolære anafase celler.

a. Single brændplan en ubehandlet HT-29 multipolær prometafasen. Scale bar, 2,5 um. B. Samme celle og samme brændplan som i (A) opnået efter forarbejdning af billederne i de to kanaler ved speciel filtrering, sammenlægning, og udjævning (se materialer og metoder for detaljer). En merotelic kinetochore er synlig i indrammede område. Kts: kinetochores. Mts: mikrotubuli. C. Ratio visning af fokusplanet vist i (A) og (B). Regioner i sidestilling mellem kinetochore og dens mikrotubuli bundt (er) vises med grønt. D. Udvidelse (400%) af det indrammede areal i (B). E. Gennemsnitligt antal merotelic kinetochores i bipolar vs. multipolær prometafasen CIN celler. Multipolær prometaphases besidder betydeligt mere merotelic kinetochores end bipolære prometaphases (t-test, P 0,001 for begge cellelinier)

Diskussion

Cytokinese fiasko ikke bidrager til CIN

.

Cytokinese fiasko er blevet foreslået i fortiden som en mekanisme ansvarlig for aneuploidi i cancerceller [10], [11]. Faktisk har en række undersøgelser vist, at polyploidi induceret af eksperimentelt hæmme cytokinese, kan føre til malign transformation og tumorigenese [27], [28]. Men som påpeget i indledningen, cytokinese fiasko

per se

ville ikke være tilstrækkeligt til at forklare CIN, dvs. høj kromosomfejl mis-segregation satser. Alligevel kan cytokinese fiasko være en medvirkende faktor for CIN, således vi bestemt hyppigheden af ​​cytokinesen fiasko både i celler udviser bipolar kromosom adskillelse og i celler med tripolær kromosom adskillelse. Vi aldrig observeret cytokinese svigt i celler, der undergår bipolar celledeling, og dette fænomen forekom kun i omkring halvdelen af ​​de celler, som undergår multipolær celledeling (figur 2A). Fordi meget få celler udviser multipolær kromosom adskillelse, de observerede satser cytokinese fiasko repræsenterer en meget sjælden begivenhed i den samlede celle population. Således cytokinese fiasko undlader at forklare både den høje kromosom mis-segregation observeret i CIN celler [4], [5] og den høje tilbagestående kromosomer findes i kræftceller [20] – [24] (figur 2B). Afslutningsvis selvom cytokinese fiasko kunne repræsentere en sjælden, tidlig begivenhed i tumor udvikling [27], [28], det synes ikke at bidrage væsentligt til CIN i cancerceller på senere stadier af tumor progression.

multipolaritet og multipolær kromosom segregering i CIN cancerceller

Mange cancerceller har tidligere vist at udvise centrosom forstærkning [12], [15], [29], [30], og mitosespindelen multipolaritet er blevet observeret i kræft celler fra forskellige steder [1], [12], [15], [20], [21], [24], [29] – [34]. Det er blevet foreslået, at multipolær kromosomsegregering ville producere stort set aneuploide datterceller, som ville sandsynligvis ikke overleve efterfølgende cellecyklus [18], [19]. Faktisk viste vores levende celle eksperimenter, der multipolær celledeling er en sjælden begivenhed i CIN-celler (figur 2A). Desuden er en nylig undersøgelse viste, at multipolær celledeling i CIN celler resulterer i enten celledød eller cellecyklusstandsning [35]. Det blev tidligere foreslået, at multipolære cancerceller kan undergå en bipolarization proces, hvilket ville ske via centrosom klyngedannelse, og ville føre til bipolar kromosom opdeling [16] – [18]. Nylige undersøgelser har vist, at flere spillere kan være involveret i at fremme centrosom klyngedannelse (revideret i [36]). Disse omfatter actin-associerede mekanismer [16], dynein [17], kinesin 14s (NCD /HIndstil) [16], [37], og måske andre proteiner /mekanismer [16], [36], [37]. Nylige undersøgelser [16], [26], [37] har også foreslået en mulig rolle af spindlen samling checkpoint i giver tid til spindel bipolarization i multipolære celler, som MAD2 hæmning forhindret spindel bipolarization [16], [37] og accelereret mitotiske exit i multipolære celler [26]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, finder vi, at celler med højere frekvenser af multipolære spindler bruge, i gennemsnit, længere gange mitose (tabel 1). Men MAD2 hæmning accelererer mitose exit uanset spindel pole nummer og kinetochore vedhæftet fil [38] – [40], så dens virkning på multipolær spindel bi-polarisering kan simpelthen være en sekundær effekt. Vi fandt også, at multipolære celler besidder højere antal merotelic kinetochores. Dog er merotelic vedhæftede ikke opdaget af spindlen samling checkpoint (revideret i [1]), og derfor synes usandsynligt, at være årsagen til den mitotiske forsinkelse. På den anden side, CIN kræftceller har store kromosom tal, så det er let at forestille sig, at opnå stabile vedhæftede filer for alle kromosomer vil tage længere tid i sådanne celler sammenlignet med bipolære diploide celler. Men Yang et al. [26] viste for nylig, at eksperimentelt genererede multipolære diploide RPE1 celler tage dobbelt så lang tid at indtaste anafase i forhold til deres bipolære modstykker, hvilket antyder, at stigningen i centrosom antal kan være nok til at forsinke anafase indtræden. Forfatterne foreslog, at tilstedeværelsen af ​​flere mikrotubuli asters kunne forstyrre stabiliteten af ​​kinetochore vedhæftede filer [26], hvilket fører til en stigning i den nødvendige tid til at fuldføre kinetochore vedhæftet fil, og dermed forlænge mitose. Dette er en spændende mulighed, som vil skulle testes i fremtidige eksperimenter. Afslutningsvis hvordan ekstra centrosomer forsinkelse anafase debut er stadig uklart, men disse undersøgelser tyder på, at både de ekstra kromosomer og de ekstra centrosomer i CIN kræftceller kunne bidrage til stigningen i den gennemsnitlige tid i mitose, hvorunder multipolære celler bipolarize via spindel pole sammensmeltning. Den centrosom klyngedannelse forbundet med spindel bi-polarisering er tidligere foreslået at bibringe cancerceller med en selektiv fordel, som kan forhindre massiv kromosom mis-segregation og tillade kræftceller at holde dividere selv i nærvær af ekstra centrosomer [18], [19]. Således tidligere undersøgelser foreslået sådan spindel pole sammensmeltning proces som en mekanisme til at forhindre fejlagtig kromosom adskillelse. Omvendt foreslår vi her, at multipolær spindel samling efterfulgt af spindel pole sammensmeltning udgør en væsentlig mekanisme af kromosom mis-segregation i CIN kræftceller (se næste afsnit for en detaljeret beskrivelse af vores foreslåede model).

Kræft celle multipolaritet og merotelic kinetochore vedhæftet fil: to sider af samme sag

det lave antal multipolære anaphases forhold til multipolære prometaphases (figur 1B), det lave antal multipolære celledelinger (figur 2A), og tilstedeværelsen af ​​flere γ tubulin-positive signaler på en enkelt spindel poler i metafase /tidlig anafase CIN celler (figur 3B-C), tyder på, at de fleste af de multipolære prometaphases gennemgå en proces med spindel pole sammensmeltning før anafase debut, som tidligere foreslået [16] – [19 ].

Vi foreslår, at når CIN kræftceller indledningsvis samle multipolære spindler, enlige kinetochores er mere tilbøjelige end de ville være i en bipolar spindel til ansigt (figur 5A), og bliver knyttet til (figur 5B), to spindel poler (merotelic vedhæftede). Således ville multipolære prometafasen celler forventes at besidde mere merotelic vedhæftede sammenlignet med bipolære prometaphases. Faktisk fandt vi multipolære prometafasen celler til at besidde mere merotelic kinetochores forhold til bipolare prometaphases (Figur 4). Som beskrevet ovenfor, multipolære spindler sandsynligt bipolarize via en spindelpol sammensmeltning fremgangsmåde (figur 5B-C) inden anafase indtræden. Selv om der findes korrektionsmekanismer for merotelic kinetochore vedhæftet fil [39], [41], [42], er denne kinetochore mis-vedhæftede fil ikke opdaget af den mitotiske checkpoint [43], [44], og cellerne kan indtaste anafase før opnå komplet korrektion [ ,,,0],39], [43]. Fordi celler, der forbigående samle multipolære spindler ville starte med flere merotelic vedhæftede filer i forhold til bipolare celler (figur 4 og 5B), forventes flere af disse mis-vedhæftede filer til at fortsætte gennem anafase og producere tilbagestående kromosomer (dvs. kromosomer, der halter bagefter på spindel ækvator stedet for at lagre den spindelpol, figur 5D), og dermed kromosom mis-segregation og aneuploidi. Bemærkelsesværdigt, vi fandt også, at frekvenserne af anafase celler med merotelically orienterede tilbagestående kromosomer var meget lig de frekvenser af multipolære prometafasen celler (sammenlign figur 1B og 2B), hvilket tyder på interessante mulighed, at de fleste tilbagestående kromosomer findes i de celler, der oprindeligt samle multipolære spindler. Sammenfattende mens spindel multipolaritet og anafase halter kromosomer tidligere er blevet foreslået som uafhængige årsager til CIN, viser vi her for første gang, at et stort antal merotelic kinetochores form multipolære prometafasen celler, hvilket afslører den tætte sammenhæng mellem multipolaritet og anafase halter kromosomer .

A. Inden for en flerpolet spindel, en enkelt kinetochore er mest udsat for to spindel poler end den ville være i en bipolar spindel. B. På grund af den multipolære spindel geometri, kan en enkelt kinetochore let binde mikrotubuli indleveret af to spindel poler og ikke blot fra den ene pol. Efter etablering af merotelic kinetochore vedhæftet fil, mitosespindelen bi-polariserer ved en proces med spindel pole sammensmeltning (eller centrosom klyngedannelse). C. Merotelic kinetochore vedhæftet fil kan vare gennem metafase og ind anafase. D. Under anafase, kan merotelic kinetochore vedhæftede give anledning til et tilbagestående kromosom.

Vi bør bemærke, at selv ved meget lavere frekvenser end i CIN celler, fandt vi begge multipolære prometafasen spindler (figur 1 ) og anafase halter kromosomer (figur 2B-C) i HCT116 (min) celler. Ikke desto mindre har disse celler tidligere vist sig ikke at udstille CIN [4], [22], og de blev vist ikke at tolerere eksperimentelt inducerede kromosom mis-segregation [22], hvilket tyder på, at CIN skal opnås ved en kombination af høje kromosom mis -segregation satser (ikke observeret i HCT116 celler) og nogle andre fænotypiske funktion, der gør cellerne tolerante for aneuploidi [22].

Fremtidige eksperimenter bør tage sigte på at afprøve vores model og dens forudsigelse om, at hæmning af spindel pole sammensmeltning bør resultere i lavere frekvenser af tilbagestående kromosomer i bipolære anafase celler. Time-lapse billeddannelse af celler med mærkede kinetochores og mikrotubuli vil bekræfte hændelsesforløbet foreslås her (figur 5), hvis merotelically vedhæftet anafase halter kromosomer blev observeret hyppigere i celler startende mitose med multipolære spindler sammenlignet med celler, der starter ud med bipolar spindler. Desuden kunne spindel pole clustering hæmmes at afkoble spindel multipolaritet fra anafase halter kromosomer, og dermed demonstrere den årsagssammenhæng mellem disse to fænomener. For eksempel ved at udføre en genom-dækkende RNAi skærmen i Drosophila S2-celler, Kwon et al. [16] fandt mange forskellige gener impliceret i en række cellulære processer, herunder spindelpol organisation, celleform og polaritet, og celleadhæsion, at være involveret i centrosom klyngedannelse. Ifølge vores model, bør tavshed af disse gener i CIN celler resultere i reducerede frekvenser af tilbagestående kromosomer i bipolære anaphases, og fremtidige eksperimenter bør tage sigte på at afprøve denne hypotese. Selvom den omvendte eksperiment (dvs. reducere merotelic fastgørelse i multipolære celler) ville være meget mere udfordrende, kunne nogle eksperimenter giver indirekte beviser, at en reduktion merotelic fastgørelse ville resultere i en reduktion i anafase tilbagestående kromosomer i celler, der transient samle en flerpolet spindel. For eksempel kunne anafase indtræden forsinkes ved behandling af multipolære celler med en proteasominhibitor. I den tid af proteasomhæmning er de multipolære spindler forventes bi-polarisere, og forventes merotelic vedhæftede filer, der skal korrigeres. Således ved udvaskning af hæmmer, bør cellerne ind anafase og udviser lave frekvenser af tilbagestående kromosomer.

Er der nogen anden mekanisme bidrager til Cin?

Vi har ikke udelukke, at andre mekanismer måske bidrage til kromosom ustabilitet i cancerceller. For eksempel, de seneste undersøgelser antydet, at mekanismerne i merotelic kinetochore korrektion er ikke særlig effektiv i CIN cancerceller [9], [45].