PLoS ONE: Autolog Tumor Lysate-Pulserende dendritiske celle immunterapi med cytokininduceret dræberceller Forbedrer overlevelse i Mavesår og Kolorektal Cancer Patients

Abstrakt

Gastric og kolorektal kræft (GC og CRC) har dårlig prognose og er modstandsdygtige at kemo- og /eller stråleterapi. I den foreliggende undersøgelse er de profylaktiske virkninger af dendritiske celle (DC) vaccination evalueret på sygdomsprogression og kliniske fordele i en gruppe på 54 GC og CRC patienter behandlet med DC immunterapi kombineret med cytokin-induceret killer (CIK) celler efter kirurgi med eller uden kemo-strålebehandling. DC’er blev fremstillet ud fra mononukleære celler isoleret fra patienter, der anvender IL-2 /GM-CSF og ladet med tumorantigener; CIK-celler blev fremstillet ved inkubering af perifere blodlymfocytter med IL-2, IFN-γ, og CD3-antistoffer. DC /CIK terapi begyndte 3 dage efter lavdosis kemoterapi og blev gentaget 3-5 gange i 2 uger som en cyklus med i alt 188,3 ± 79,8 × 10

6 DC’er og 58,8 ± 22,3 × 10

8 CIK-celler. Cytokin niveauer i patienternes sera før og efter behandlingerne blev målt og opfølgning blev gennemført for 98 måneder til at bestemme sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). Resultaterne viser, at alle testede cytokiner var forhøjet med signifikant højere niveauer af IFN-γ og IL-12 i både GC og CRC kohorter af DC /CIK behandlede patienter. Ved Cox regressionsanalyse, DC /CIK terapi reducerede risikoen for postoperativ sygdomsprogression (p 0,01) med en øget OS ( 0,01). Disse resultater viser, at der ud over kemo- og /eller stråleterapi, DC /CIK immunterapi er en potentiel effektiv fremgangsmåde til bekæmpelse af tumorvækst for postoperativ GC og CRC patienter

Henvisning:. Gao D, Li C, Xie X, Zhao P, Wei X, Sun W, et al. (2014) Autolog Tumor Lysat-Pulserende dendritiske celle immunterapi med cytokininduceret dræberceller Forbedrer overlevelse i Mavesår og tarmkræft Patienter. PLoS ONE 9 (4): e93886. doi: 10,1371 /journal.pone.0093886

Redaktør: Michael Lim, Johns Hopkins Hospital, USA

Modtaget: August 1, 2013; Accepteret: 10 marts 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:.. Kontaktforfatter Jian Jian Li er en PLoS ONE Editorial Board medlem, og det ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier

Introduktion

mavekræft (GC) og kolorektal cancer (CRC) er store maligne sygdomme i fordøjelseskanalen. Mens GC er den mest almindelige kræftform i den asiatiske-Stillehavsregionen, er CRC rangeret som den fjerde mest almindelige malignitet verden, med omkring 1,2 millioner nye tilfælde og 609,051 dødsfald årligt [1]. Kirurgisk resektion med eller uden adjuverende kemo- og /eller strålebehandling forbliver det centrale modalitet til GC og CRC, men desværre viser begrænsede kliniske fordele på grund af høj tumormetastaser. Selv om den nuværende adjuvans kemo-strålebehandling har vist sig at forlænge patientoverlevelse i nærvær af tilbagevendende læsioner [2], [3], alvorlige bivirkninger normalt begrænse effektiviteten af ​​denne anti-cancer modalitet [2] – [4]. For yderligere at forbedre den samlede overlevelse for GC og CRC patienter, er det vigtigt at undersøge nye tilgange til at kontrollere tumormetastase med eller uden anvendelse af traditionelle kemo-og /eller strålebehandling.

dendritiske celler (DC’er) spiller en afgørende rolle i induktionen af ​​antigenspecifikke T-cellereaktioner at tilvejebringe aktiv immunterapi [5] – [7]. Kliniske undersøgelser under anvendelse specielt designet DC-målrettede cancercellelinier vacciner demonstrerede forskellige kliniske fordele. Patienter med lymfom [8], [9], metastatisk melanom [10], [11], coloncancer, og ikke-småcellet lungecancer [12] viste, at vaccination med tumorantigen-pulserede DC’er, enten isoleres direkte fra blod eller genereret

ex vivo

fra blodprækursorer, fremkaldte antigenspecifik immunreaktion og, i nogle tilfælde, væsentlige tumorreaktioner. Faktisk anvendelse af en aktiv immunterapi regime, Sipuleucel-T (APC8015) anvendes ved aktivering mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) med en prostatasyrephosphatase (PAP), et fusionsprotein af prostatacancer antigen, med GM-CSF, resulterede i ca. 4 måneder forlænget median overlevelse hos patienter med prostatacancer [13] – [15], og blev godkendt af FDA til behandling af metastatisk prostatakræft [14], [16], [17]. CIK-celler er en delmængde af naturlig dræber-T-lymfocytter (NKT), der overvejende CD3

+ CD56

+ type II NKT-celler [18], og sådanne celler kan genereres

ex vivo

ved inkubering perifere blodlymfocytter med et agonistisk anti-CD3 monoklonalt antistof, interleukin (IL) -2, IL1-β og interferon (IFN) -γ. CIK celler, støttet af opmuntrende kliniske resultater i både autologe og allogene sammenhænge, ​​er kendt for at cytolytically eliminere tumorceller [19]. I modsætning til lymfokin-aktiverede dræber (LAK) celler, som er cytotoksiske effektor-T-celler stimuleret overvejende reaktion på høj koncentration af interleukin-2 (IL-2), udviser CIK-celler forøget tumorcelle lytisk aktivitet [20], [21 ], højere proliferationshastighed [22], og relativt lavere toksicitet [23]. Selvom passiv immunterapi ved adoptiv overførsel af T-celler antages at være effektiv til bekæmpelse af primære tumorer, er det uklart, om passiv immunterapi er effektiv på lang sigt styring af tumor tilbagefald [24]. På den anden side, den aktive immunterapi under anvendelse tumorspecifikke vacciner, såsom DC-vaccine, har den potentielle fordel markant at forøge tumorspecifikke effektor og hukommelses-T-celler. De anti-tumor responser udløst af DC /CIK-terapi er blevet rapporteret i en række

ex vivo

[25] – [29] og

in vivo

[30] undersøgelser samt i indledende kliniske forsøg i patienter med non-Hodgkins og Hodgkins lymfom [31], [32] og ikke-småcellet lungekræft med få bivirkninger [33]. I den foreliggende undersøgelse, er kliniske fordele evalueret i en gruppe af 54 GC og CRC patienter behandlet med DC immunterapi kombineret med cytokin-induceret dræberceller (CIK) celler efter kirurgi med eller uden kemo-strålebehandling. Resultaterne viser forbedrede satser for DFS og OS med forhøjede niveauer af IFN-γ og IL-12 i både GC og CRC kohorter af DC /CIK behandlede patienter.

Patienter og metoder

Studie design , patientrekruttering, og dataindsamling

Vi har udført undersøgelsen med patienter behandlet på Institut for Kirurgi og center of Biological Therapy, Qingdao Central Hospital, Qingdao, Kina 2005-2010 (tabel 1). Patienterne blev rekrutteret med følgende kriterier: 1) 18 år og ældre, 2) patologisk bekræftet GC eller CRC, 3) gennemgik kirurgisk resektion af primære tumorer, 4) ingen tegn på tumor metastase eller fornyet før modtagelsen cellebaserede immunterapi, 5) have afsluttet kemo-og /eller strålebehandling i mindst 1 måned, og 6) underskrive samtykkeerklæring. Patienterne i kontrolgruppen blev rekrutteret med demografiske og kliniske patologiske karakteristika. I alt 27 patienter blev randomiseret til cellebaseret immunterapi og 27 patienter blev inkluderet i kontrolgruppen. Tumorer blev iscenesat i henhold til International Union Against Cancer (UICC) klassifikation baseret på pTNM delmængder. Alle patienternes informerede samtykke blev opnået og procedurerne i undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af Etik Review Board Qingdao Central Hospital. Efter cellebaserede immunterapi, opnåede alle patienter opfølgning fra hospitalsbesøg og /eller telefoninterviews i mindst hver 6 måned. Lokale tumor tilbagefald og fjernmetastaser blev undersøgt af imaging analyser. DFS (sygdomsfri overlevelse, tidsintervallet mellem kirurgi og tumor recidiv) og OS (samlet overlevelse, tiden mellem kirurgi og sidste opfølgning) blev indsamlet i projektet forskningsdatabase. DFS og OS blev beregnet i begge behandlingsgrupper og kontrolgrupper fra datoerne for kirurgi og de opfølgninger blev afsluttet for alle patienter inden august 2011, herunder patienter med 12 måneder eller længere periode efter immunterapi.

DC-vaccine og CIK celleterapi

En dosis på 1 × 10

6 enheder IL-2 (Quangang Pharma Co. Shandong, Kina) i 250 ml fysiologisk saltvand blev forberedt og intravenøst ​​administreret til patienter i behandlingsgruppen, en gang om dagen i 5 konsekutive dage. Tre til seks dage efter IL-2 injektion, mononukleære celler (4-6 x 10

9) blev opsamlet fra total 6-9 liter cirkulerende blod ved COBE Spectra aferesesystem (Gambro BCT, Inc., Colorado, USA ) og opbevaret i 120-150 ml plasma. Hvis mononukleære celler var mindre end 4 × 10

8 /Liter, GM-CSF (150 ug) blev subkutant anvendt til patienterne-gang dagligt i 1-3 dage før yderligere samling af mononukleære celler blev behandlet.

Antigenfremstilling

Tumor-antigen blev fremstillet ved at følge etablerede protokol [34], [35] fra human AGS gastrisk cancer eller LS-174T colon cancerceller. Tumorceller blev dyrket i 2-3 passager (1-2 × 10

8), og opsamles og vaskes med normalt saltvand i 3 gange, og lyseret ved frysning-optøning tre gange og analyseret med ultralyd cellesprængning. Lysater fra tumorceller blev derefter fraktioneret ved centrifugering (1200 rpm x 5 min), og supernatanten blev opsamlet og filtreret med et 0,22 filter (Carrighwohill, Co. Cork, Irland), og proteinkoncentrationen i supernatanten blev målt før opbevaring ved – 80 ° C.

Udarbejdelse af DC og CIK celler

Mononukleære celler blev isoleret fra de indsamlede celler fra perifert blod af GC og CRC patient ved at følge en etableret metode [36], [37] hjælp Ficoll (GE Healthcare life Science, Shanghai, Kina). Isolerede celler blev suspenderet i RPMI 1640-medium ved en koncentration på 1 x 10

7 ml

-1 og dyrket i 175 cm

2 celledyrkningskolber ved 37 ° C, 5% CO

2 for 2 timer. Adhærente celler blev dyrket i serumfrit DC dyrkningsmedium (CellGenix, Freiburg, Tyskland) indeholdende 20 ng /mL interleukin 4 (IL-4) og 50 ng /mL GM-CSF ved 37 ° C, 5% CO

2 for 6 dage. DC dyrkningsmedium indeholdende forberedt tumorantigen blev derefter tilsat i dyrkede celler til en slutkoncentration på 50 ug /ml, og dyrket i yderligere 2 dage. Modnet DCs blev undersøgt ved flowcytometri for DC markører CD83 og HLA-DR. Præparater blev testet som bakterier og pyrogenfri. En portion af den fremstillede DC blev infunderet i patienterne og de resterende DC’er blev opbevaret ved -80 ° C. Suspensionsceller blev dyrket i RPMI 1640-medium (2 x 10

6 /ml) indeholdende 10% BFS, 100 U /ml IL-2, 300 U /ml IFN-γ, 20 ng /mL CD3 monoklonalt antistof (R 0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 16,0 til Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

Baseline information

I alt 54 patienter med histologisk bekræftet gastrisk eller colorectal adenocarcinom blev tilfældigt rekrutteret ind i denne undersøgelse består af 27 patienter i hver gruppe. De demografiske og kliniske patologiske data for patienter i behandlings- og kontrolgrupper blev præsenteret i tabel 1. Halvdelen af ​​patienterne i behandlingsgruppen og alle patienter i kontrolgruppen havde fået mindst én cyklus af kemo-strålebehandling før indskrivning. Immunterapi blev indledt mindst en måned efter afslutningen af ​​kemo- og /eller strålebehandling og opfølgning tid var 98 måneder for alle patienter i behandlings- og kontrolgrupper.

Karakteristik af DC /CIK celler til celle infusion

Det gennemsnitlige antal celler infunderes i patienter i en cyklus var 188,3 ± 79 × 10

6 for udviklingslandene og 58,8 ± 22,3 × 10

8 for CIK celler. Celler, der udtrykker DR /CD11c og CD83 (DC markører) eller CD3 /CD8 og CD3 /CD56 (CIK markører) blev analyseret. DC’er fremstillet ud fra GC patienter var 88% -81% positive for DR /CD11c og 85% -71% positive for CD83 (fig. 2A, B). CIK-celler fremstillet ud fra GC patienter viste 73% -46% positive for CD3 /CD8 og 42% -16% positive for CD3 /CD56 (Fig. 2C, D). Desuden DC fremstillet ud fra CRC patienter var 87% -80% positive for DR /CD11c og 84% -71% positive for CD83 (fig. 3A, B), og CIK-celler fra CRC patienter var 75% -48% positive for CD3 /CD8 og 41% -11% positive for CD3 /CD56 (fig. 3C, D). Den samlede cytolytiske effekt af CIK-celler fra alle patienter blev forbedret ~2.5 fold. Disse resultater viser, at størstedelen af ​​DC’er og CIK-celler fremstillet ud fra patienterne var modne og funktionelle. |

Serum cytokinniveauer efter DC /CIK terapi

Vi undersøgte serumniveauer af en gruppe af cytokin til hver patient før og efter DC /CIK behandlinger (figur 4 for GC (a) og CRC (B)). Niveauerne af IL-2, IL-6 og IL-10 svagt forbedret, uden statistisk signifikans i sera fra GC og CRC patienter (fig. 4A, B). Imidlertid blev serum IL-12 og IFN-y-niveauet signifikant forøget i både GC og CRC patienter, hvilket indikerer, at DC /CIK terapi specifikt kan fremme en Th1 immunrespons at mediere tumordræbende virkning af DC /CIK terapi.

sygdomsfri overlevelse (DFS) og samlet overlevelse (OS) af patienterne efter cellebaseret immunterapi

Som vist i figur 5 og 6, DFS og OS blev begge signifikant forlænget hos patienter i DC /CIK behandlingsgrupper (GC: 5-års DFS rate: 66%, OS rate: 66%; CRC: 5-års DFS rate: 66%, OS rate: 75%) sammenlignet med patienterne i kontrolgrupperne (GC: 5- år DFS rate: 34%, OS rate: 34%; CRC: 5-års DFS rate: 8%, OS rate: 15%; p 0,01). For at undersøge forskellen respons af GC og CRC analyserede vi to kohorter (GC: P 0,05; CRC: p p 0,01) eller patient deceases (Odd ratio: 0,05, 95% CI:. 0,01-0,37; p 0,01) efter justering for alder, køn, tumor kvalitet, TNM stadier, og tidligere kemo- og /eller strålebehandlinger

(A) Det overordnede overlevelsesraten for mavens kræftpatienter. De 1-, 3- og 5-årige overlevelsesrater i behandlingsgruppen var 93%, 82%, og 66%, sammenlignet med kontrolgruppen 79%, 42%, og 34%. B) sygdomsfri overlevelse på de mavecancerpatienter. De 1-, 3- og 5-årige overlevelsesrater i behandlingsgrupperne (rød boks markeret) var 86%, 73%, og 66%, sammenlignet med kontrolgruppen 79%, 42%, og 34%. De kumulative overlevelseskurver i A og B blev analyseret af Kaplan-Meier-metoden.

(A) Den samlede overlevelsesrate for patienter med tarmkræft. 1-, 3- og 5-årige overlevelsesrater i behandlingsgruppen var 100%, 77% og 75%, sammenlignet med kontrolgruppen 85%, 23%, og 15%. (B) Sygdom overlevelse i mavens kræftpatienter. 1-, 3- og 5-årige overlevelsesrater i behandlingsgruppen var 100%, 69% og 66%, sammenlignet med kontrolgruppen 69%, 15% og 8%. De kumulative overlevelseskurver i A og B blev analyseret af Kaplan-Meier-metoden.

Potentielle uønskede virkninger af cellebaserede immunterapi

Den mest almindelige negativ virkning observeret i alle patienter, der får DC /CIK behandling var feber, som forekom hos 9 ud af 27 behandlede patienter (33%) i intervallet fra 37,5 til 40 ° C. Alle patienter kom spontant eller efter antipyretisk behandling med non-steroid medicin. Ingen andre væsentlige komplikationer, der ledsager celle-baserede immunterapi blev observeret.

Diskussion

Kræft immunterapi havde vist en potentiel effekt i tumorvækst kontrol og patient overlevelse [14], [38], [39] som nyheden frigivet, at “i stedet for at bruge kirurgi, kemoterapi eller radioterapi, er forskere fra National Institutes of Health finde der hidtil begrænset, men inspirerende succes i en ny tilgang til bekæmpelse af kræft, ved hjælp af immunsystemet til at angribe tumorer vejen det ville være en forkølelse eller influenza. -CNN.com (August 2006) “. Selvom omfattende undersøgt i celler og dyremodeller, de kliniske data vedrørende den nøjagtige fordel af immunterapi i patientens overlevelse og sygdomsprogression mangler at blive undersøgt nærmere [17], [40]. Trods begrænsede størrelse kohorter, denne undersøgelse viser en bemærkelsesværdig forbedring i den post-kirurgisk styring af tumor tilbagefald og overlevelse i GC og CRC patienter behandlet med kombineret DC /CIK terapi. Det er blevet veletableret, at DCS prime naive T-celler og DC-vaccine kombineret med CIK celleterapi har opnået opmuntrende løfte som en ny terapeutisk tilgang til sygdomsbekæmpelse i bestemte kræftformer [41]. DCs [6], [7], [42] har evnen til at præsentere tumorantigener til T-lymfocytter og fremkalde de specifikke cytotoksiske T-celler mod tumor antigener [43]. Sipuleucel-T, den første DC-vaccine, blev godkendt til klinisk anvendelse af FDA i USA til behandling af asymptomatisk metastatisk kastrationsniveau-resistent prostatacancer, forbedre patienternes OS i fase III forsøg [14]. Yderligere lovende resultater blev rapporteret i de seneste fase III-forsøg ved hjælp af tumor vaccine til behandling af forskellige sene fase kræftformer [44], herunder melanom, follikulært lymfom, CRC, og NSCLC. Undersøgelser i klinikkerne har fastslået, at DC’er opsamling og proces tumorassocierede antigener og udskiller cytokiner at initiere et immunrespons [45].

Foruden DC vaccine, cıks induceres af cytokiner og besidder ikke-specifik cytotoksicitet mod tumorer [24]. CIK-celler kan dræbe tumorceller, direkte, men har signifikant kortsigtet anti-cancer virkning og de er mindre tilbøjelige til at styre tumor-udvækst på lang sigt [24]. I modsætning hertil er DC vaccine vist at inducere tumorspecifikke effektor og hukommelses T-celler [24]. Derfor kan kombinationen af ​​DC vaccine med CIK behandling har en potentiel højere cytotoksisk aktivitet og specificitet i effektor-T-celler, som viser både kort og lang sigt antitumoreffektivitet. Efter aftale med de kliniske fordele observeret i andre kliniske forsøg [44], vores undersøgelse tyder på, at DC /CIK behandlingen betydeligt kan forbedre patientens overlevelse, hvilket fik den fremtidige kliniske undersøgelse.

Selv om en række pro-inflammatoriske cytokiner var forhøjet i DC /CIK behandlede patienter, kun to Th1 cytokiner, IL-12 og IFN-γ, viste en signifikant stigning i patienternes sera i vores undersøgelse. Undersøgelser viste, at IFN-y og IL-12 play kritiske roller i immunterapi ved anvendelse DC og CIK [28], [33]. Tumorceller er meget heterogene [46] og en specifik tumor kan indeholde celler med både høje og lave MHC-I populationer [47], [48]. Interessant, MHC-I-ekspression viser heterogene blandt tumorceller og stråling fremmer den immunologiske genkendelse af tumorcellerne ved immunceller via MHC-I [49]. Dog sandsynligvis på grund af heterogeniteten i en given tumor, en enkelt type immunterapi kan kun være effektiv i en subpopulation af cancerpatienter. Tilsvarende kan tumorceller med højere MHC-I-ekspression være mere følsomme over for DC vaccineterapi mens celler med lavere MHC-I-ekspression kan blive dræbt af CIK. Vores resultater støtte, kombineret DC /CIK behandling kan fremme tumorcellecytotoksicitet ved at målrette forskellige populationer af tumorceller, såsom dem med forskellige niveauer af MHC-I.

Doserne af DC og CIK til patienterne i denne undersøgelsen blev bestemt på grundlag af tidligere dosis eskalerende test, og fundet at være sikker i alle patienter. Det skal bemærkes, at i den nuværende undersøgelse blev data fra patienter behandlet med en modificeret regime, dvs. før lymfocyt samling ved intravenøst ​​administration af IL-2 for at forbedre funktion og antal lymfocytter, der kan udgøre en væsentlig rolle i DC /CIK terapi. Desuden fik patienterne også en cyklus af lav dosis kemoterapi forud for DC og CIK infusion, hvilket også kan påvirke den samlede effektivitet af DC /CIK terapi. Vi antager, at en 3-dages mellemrum er kritisk for tilstrækkelig “udvaskning” af kemoterapeutisk middel, for ikke at påvirke effektiviteten af ​​infused DC og CIK. Patienterne i kontrolgruppen var tidligere blevet behandlet med mindst 1 cyklus af kemoterapi, sammenlignes med patienter indskrevet i immunterapi-gruppen (tabel 1 og figur 5, 6). De potentielle virkninger af lav dosis kemoterapi før infusion celle [28], kan også inducere tumor celledrab, opregulerer ekspressionen af ​​tumorantigen og bidrage til sammensætningen af ​​værten immunceller. Derfor vil yderligere studier udføres med større kohorter patient. Afslutningsvis denne kliniske undersøgelse viser, at kombinationen af ​​DC-vaccine og CIK terapi markant kan forbedre sygdomsfri overlevelse i mave- og patienter med tarmkræft.

Tak

Vi takker Dr. William Murphy og Dr. Cheikh Menaa på NCI-designet omfattende kræft center University of California i Davis for nyttige diskussioner, og den uhyre støtte læger og sygeplejersker i bioterapi center, Qingdao Central Hospital.