PLoS ONE: Østrogen Induktion af Telomerase aktivitet gennem forordning af mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) Afhængig Pathway i Human endometriecancer Cells

Abstrakt

I betragtning af at langvarig udsættelse for østrogen og øget telomerase-aktivitet er forbundet med endometrie carcinogenese, vores mål var at evaluere samspillet mellem MAPK pathway og østrogen induktion af telomerase-aktivitet i endometrie kræftceller. Estradiol (E2) induceret telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspression i østrogenreceptoren (ER) -α positiv, Ishikawa endometriecancer cellelinje. UO126, en meget selektiv inhibitor af MEK1 /MEK2, inhiberede telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspression induceret af E2. Lignende resultater blev også fundet efter transfektion med ERK 1/2-specifikke siRNA. Behandling med E2 resulterede i hurtig phosphorylering af p44 /42 MAPK og øget MAPK aktivitet, som blev afskaffet af UO126. HTERT-promotoren indeholder to østrogen responselementer (Eres), og luciferaseassays viser, at disse østrogenresponselementerne aktiveres af E2. Udsættelse for UO126 eller ERK 1/2-specifikke siRNA i kombination med E2 modvirket den stimulerende virkning af E2 på luciferaseaktivitet fra disse østrogenresponselementerne. Disse resultater tyder på, at E2-induktion af telomerase-aktivitet medieres via MAPK pathway i humane endometriecancer celler

Henvisning:. Zhou C, Steplowski TA, Dickens HK, Malloy KM, Gehrig PA, Boggess JF, et al . (2013) Østrogen Induktion af Telomerase aktivitet gennem forordning af mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) Afhængig Pathway i Human endometriecancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e55730. doi: 10,1371 /journal.pone.0055730

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: November 6, 2012; Accepteret: December 29, 2012; Publiceret: 7 Feb 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde var generøst støttet af V Foundation for Cancer Research og Steelman Fund (Bae-Jump VL og Gehrig PA). Den beskrevne projekt blev også støttet af (1) Award Number KL2RR025746 (UNC Clinical Translational Science Award-K12 Lærde Program) fra National Center for Research Resources (Bae-Jump VL) og (2) Award Number 1K23CA143154-01A1 (NIH /NCI K23 mentored Patient-Oriented Research Career Development Grant). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer er den mest mest almindelige malignitet hos kvinder i USA [1]. Endogen og eksogent østrogen eksponering er væsentlige risikofaktorer for udvikling af type I livmoderkræft; dog forbliver molekylær forbindelse mellem østrogen og endometrie carcinogenese dårligt forstået. Vores tidligere arbejde viste, at østrogen regulering af telomerase potentielt kan spille en rolle i den maligne transformation af endometriet [2].

Telomerer er specialiserede strukturer af den distale ende af kromosomer og funktion i kromosom beskyttelse, positionering, og replikation. Med aldring, humane telomerer uundgåeligt undergår progressiv afkortning i normale somatiske celler gennem replikationen-afhængige tab sekvens ved terminale ender af DNA. Den gradvise afkortning af telomerer i sidste ende resulterer i kromosomal ustabilitet, der fører til cellulær ældning. Telomerase er et ribonukleoprotein revers transkriptase der syntetiserer telomere DNA i kromosomalt ender. Dette enzym genkender G-rige streng i en eksisterende telomer gentagelsessekvens og syntetiserer en ny kopi af gentagelsessekvens i fravær af en komplementær DNA-streng, med et segment af sin interne RNA komponent tjener som en skabelon [3], [4 ]. Således er telomerase består af en RNA-template (human telomerase RNA, hTR) og den katalytiske protein hTERT (human telomerase revers transkriptase, hTERT), som har revers transkriptase-aktivitet [5] – [7]. Ekspressionen af ​​hTERT observeres ved høje niveauer i telomerase-positive cancerceller, men ikke i telomerase-negative celler, og betragtes som den hastighedsbegrænsende faktor for telomeraseaktivitet [7], [8].

Mere end 85% af humane endometriske carcinomer udtrykker telomeraseaktivitet [9] – [12], og niveauet af telomeraseaktivitet er blevet korreleret med fremskredent sygdom og med bækkensmerter lymfeknudemetastase [12]. Den menneskelige endometrium er et unikt dynamisk væv, der består af epitelial kirtler og bindevæv, der gennemgår komplekse mønstre af proliferation, sekretion, og fordelingen gennem reproduktive år. Under menstruationscyklus, er endometriske epitelceller reguleret af kønshormoner østrogen og progesteron og endometrisk carcionogenesis menes at være forbundet med langvarig udsættelse for østrogen, opponeret ved progesteron. I det normale endometrium, er ekspression af telomerase korreleret med cellulær proliferation, typisk lokaliseret i epiteliale kirtelceller, og reguleres i et hormonalt-drevet, menstruationssmerter fase-afhængig måde [13], [14]. Øget telomerase-aktivitet er observeret i den proliferative fase, hvor østrogen niveauer er maksimal efterfulgt af nær fraværende niveauer i sekretoriske fase, hvor progesteron niveauet er højt [13]. Sådanne beviser antyder en sammenhæng mellem koncentrationer af kønshormoner, modulering af telomeraseaktivitet og udvikling af endometriecancer.

Promotorregionen af ​​hTERT er blevet klonet og karakteriseret og indeholder to formodede østrogen responselementer (østrogenresponselementerne), hvilket indebærer en direkte forbindelse mellem østrogen og telomerase regulering [2], [15] – [18]. Vi har tidligere fundet, at telomeraseaktivitet og hTERT-mRNA blev forøget som respons på estrogen i en østrogenreceptor-α (ERa) afhængig måde i endometriske cancercellelinier [2]. Desuden viste vi binding af kompleks østrogen med ERa til østrogenresponselementerne findes inden hTERT-promotor, tegn på en mulig underliggende mekanisme mellem telomerase induktion og den maligne transformation af hormonafhængige endometrie celler [2].

Mitogen- aktiverede proteinkinaser (MAPK) er en vigtig familie af proteinkinaser er involveret i transmission af signaler fra cellemembranen til kernen. Det er velkendt, at p44 /42 MAPK-signalvejen aktiveres af mitogene stimuli fra vækstfaktorer og sex steroid hormoner såsom østrogen, progesteron, og epidermal vækstfaktor (EGF) i human bryst-, ovarie- og endometriske cancerceller, blandt andre [ ,,,0],19] – [21]. For at få indsigt i de molekylære mekanismer, der styrer reguleringen af ​​telomerase-aktivitet ved østrogen, vi undersøgte sammenhængen mellem MAPK pathway og østrogen-induceret telomerase-aktivitet i humane endometriecancer celler.

Materialer og metoder

Cell Kultur og reagenser

reguleringen af ​​telomerase udtryk blev undersøgt i eR-positive (Ishikawa) og eR-negative (HEC-1B) humane endometriecancer cellelinjer [22], [23]. Disse cellelinjer blev leveret som gave af Dr. Bruce Lessey (Center for Kvinders Medicin, Greenville, SC). Som tidligere beskrevet, blev østrogeninducerede ERE chloramphenicolacetyltransferase (CAT) aktivitet bestemt i hver af disse cellelinier at bekræfte funktionel ER status [24]. Ishikawa og HEC-1B celler blev dyrket i MEM suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i nærvær 5% CO

2 ved 37 ° C. De endometriecancer cellelinjer blev dyrket i phenol-rød fri medium med 0,5% trækul-dextran-behandlet FBS for 1 dag før behandling med østrogen eller U0126.

Kemikalier og plasmid

Alle hTERT reporter promotor-luciferase plasmider blev tilvejebragt af Dr. I. Horikawa (National Institute of Health, Bethesda, MD). 17-β estradiol (E2) blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). UO126 blev indkøbt fra Calbiochem (La Jolla, CA). Den anti-phosphorylerede p42 /44 og anti-phosphorylerede P42 /44-antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Den anti-β-actin antistof var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). De forøget kemiluminescens Western blotting afsløring reagenser var fra Amersham (Arlington Heights, IL). Alle andre kemikalier var fra Sigma (St. Louis, MO).

E2 og U0126 behandling

Celler blev podet ved 4 × 10

5 celler pr T25 dyrkningskolbe eller 1,5 × 10

5 celler pr brønd af en 12-brønds plade, der indeholder enten 5 ml eller 1,2 ml regelmæssig medium hhv. Mediet blev derefter ændret til phenol-rød frit medium med 0,5% strippet FBS til inkubation ved 37 ° C natten over. Umiddelbart inden behandling blev mediet i dyrkningspladerne aspireret, tredobbelt vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og erstattet med frisk medium. E2 opløst i ethylalkohol eller U0126 opløst i DMSO blev efterfølgende tilsat til hver brønd. Samtidig blev den samme mængde ethanol eller DMSO tilsat til kontrolbrøndene.

telomeraseaktivitet Assay

Telomerase-aktivitet blev målt ved anvendelse af en PCR-baseret telomeriske repeat amplifikationsprotokol (TRAP) (TRAP -eze telomerase afsløring kit, ONCOR, Gaithersburg, MA). Kort fortalt blev cellepellets lyseret, homogeniseret med 105 pi iskold 1 × CHAPS, sat på is i 30 minutter og centrifugeret ved 13000 g i 21 min ved 4 ° C. Den resulterende supernatant blev derefter overført til et frisk rør og opbevaret ved -80 ° C. En prøve fra ekstrakten blev derefter taget og proteinkoncentrationen blev bestemt under anvendelse af BCA-kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Mellem 0,25 og 05 ug af protein, som er tilføjet i en reaktionsblanding 50-pi, blev anvendt for TRAP-assayet. Efter 30 minutters inkubation ved 30 ° C blev 27 cykler PCR-amplifikation udført (30 min ved 94 ° C efterfulgt af 30 minutter ved 59 ° C). PCR-produkterne blev derefter analyseret ved elektroforese på 10% polyacrylamid ikke-denaturerende geler. Geler blev analyseret og kvantificeret under anvendelse af phosphorafbildning systemet med ImageQuant software (Molecular Dynamics inc., Sunnyvale, CA). Hvert forsøg blev udført to gange.

Real-time RT-PCR for hTERT

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNAqueous kit (Ambion, Austin, TX) og yderligere oprenset under anvendelse af DNA-free kit (Ambion, Austin, TX). Revers transkription og PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af TaqMan Gold ettrins-RT-PCR kit i ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Revers transkription blev udført ved 48 ° C i 30 minutter. PCR-betingelserne bestod af en 10-min trin ved 95 ° C og 40 cykler mellem 95 ° C i 15 s og 65 ° C i 1 min. En housekeeping kontrol-genet, sur ribosomale phosphoprotein P0 (RPLP0, også kendt som 36B4), blev anvendt som en intern kontrol for at korrigere for forskelle i mængden af ​​RNA i hver prøve [25]. Primere og fluorogene prober til hTERT og RPLP0 er tidligere blevet [25] beskrevne. Standardkurven for hTERT blev dannet ved hjælp af fortyndinger af en kendt mængde af cRNA syntetiseret ved

in vitro

transkription af et klonet fragment. Den normaliserede niveau for hTERT i hver prøve blev bestemt ved et forhold mellem hTERT niveau til det RPLP0 niveau, som tidligere [25] beskrevne. Eksperimenter blev udført in duplo, og gentaget to gange for konsistens.

Western blot-analyse

Ishikawa-celler blev udpladet med en tæthed på 3 x 10

5 celler /brønd i seks-brønds plader. Efter 24 timer blev mediet aspireret og erstattet med serum-frit medium. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med E2, UO126 eller begge i kombination i mindst 15 minutter og højst 24 timer. Pladerne blev skrabet med RIPA-buffer og cellelysater blev fremstillet i 2 × SDS-buffer. Cellelysaterne blev adskilt ved 12% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret i 1 time i TBS-T + 5% fedtfri tørmælk, og derefter inkuberet med phosphophorylated-p44 /42 MAPK-monoklonalt antistof (1:2000) eller pan-p44 /42 MAPK polyklonalt antistof (1:1000) natten over ved 4 ° C (Cell Signaling, Beverly, MA). Membranen blev derefter vasket i TBS-T og inkuberet med et sekundært peroxidase-konjugeret antistof i 1 time. Antistofbinding blev detekteret ved anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (ECL). Band netto intensiteter blev kvantificeret under anvendelse af et Millipore Digital Bioimaging System (Bedford, MA). Hvert forsøg blev udført to gange.

In Vitro

kinaseassay

Aktivitet af P44 /42 kinase aktivitet blev målt

in vitro

hjælp af P44 /42 MAP-kinase-assay kit (Cell Signaling, Danvers, MA). Kort beskrevet blev Ishikawa-celler udpladet med en tæthed på 3 x 10

5 celler /brønd i seks-brønds plader. Efter E2 og UO126 behandling blev pladerne vasket 4 gange med iskold PBS, og 0,5 ml iskold lysepuffer +1 mM PMSF blev tilsat til hver brønd. Celler blev skrabet, sonikeret og centrifugeret ved 10.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Den resulterende supernatant blev inkuberet med 15 pi resuspenderet immobiliserede phospho-p44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204) monoklonalt antistof i 12 timer ved 4 ° C. Immunkomplekset blev vasket med lyseringspuffer 5 gange og en gang med kinasebuffer uden substrat. Immunpræcipiteret MAPK blev derpå inkuberet i 30 minutter ved 30 ° C i kinasepuffer med 2 ug Elk1 fusionsproteinet og 200 uM ATP. Kinasereaktionen blev standset ved tilsætning af 25 ul af 3 × SDS-buffer. Elk1 blev separeret ved SDS-PAGE-gel, og blev derefter inkuberet med anti-phospho-Elk1 (Ser 308) antistof ved 4 ° C natten over. Elk1 blev påvist med ECL som beskrevet for Western blot-analyse. Hvert forsøg blev udført to gange.

Luciferase assay

Transient transfektion af luciferase reporter plasmider blev udført under anvendelse af TransFast Transfection Reagent (Promega, Madison, WI). Kort fortalt, 8 × 10

4 af Ishikawa-celler blev podet i 24-brønds plader natten over og transficeret med promotor luciferase-plasmider (0,5 ug /brønd). PRL-SV40 (2 ng /brønd) indeholdende Renilla reniformis luciferase blev cotransficeret i hver transfektion som en intern kontrol til at normalisere den transskriptionelle aktivitet af hTERT-promotoren plasmider. Luciferase assay blev dernæst udført under anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) ifølge protokollerne leveret af producenten. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt for hvert plasmid, og hvert eksperiment blev udført to gange.

ERK 1/2 siRNA assay

ERK 1/2 lille interfererende RNA (siRNA) blev købt hos Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Ifølge producentens instruktioner, blev Ishikawa-celler udpladet i plader med 6 brønde eller plader med 12 brønde i den anbefalede cellekoncentration. Efter 24 timer blev transfektioner udført ved ca. 60% konfluens ved hjælp af transfektionsreagens (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). For hver transfektion reaktion blev 100 nM ERK 1/2 siRNA eller kontrol siRNA anvendt til fremstilling af siRNA-transfektionskomplekser ved stuetemperatur i 15 min. Transfektioner blev udført i 0,5 (12-brønds plade) eller 1,5 ml (6-brønds plade) serum-frit medium i 8 timer. Efter inkubation blev transfektionskomplekser fjernet og erstattet med deres tilsvarende medier. I hvert eksperiment blev ubehandlede kontroller modtager transfektionsreagens inkluderet. Transfektionseffektivitet (80% -90%) blev bestemt ved fluorescens mikroskop i fluoresceinmærkede uspecifikke siRNA transficerede celler og ved Western blotting-analyse. Cellerne blev anvendt til Western blotting-analyse, TRAP assay, lucifersae aktivitet og real time PCR på 36-48 timer efter transfektion.

Resultater

Effekten af ​​E2 på hTERT mRNA og telomerase-aktivitet i Ishikawa celler

i Ishikawa cellelinie, E2 fandtes at stige telomeraseaktivitet på en dosis-afhængig måde som bestemt ved TRAP-assay (figur 1A). Den øgede aktivitet var afhængig af både E2 koncentration og varighed af eksponering. Når 0,1-10 uM E2 blev tilsat, blev telomeraseaktivitet opreguleret ved 12 timer, hvilket varede indtil mindst 72 timer efter behandling. Behandling af celler med 1-10 uM E2 i mere end 48 timer inducerede maksimal telomerase-aktivitet. Ingen effekt af E2 på telomeraseaktivitet blev detekteret i ERa negative endometriecancer cellelinje (HEC-1B), under de samme behandlingsbetingelser (data ikke vist).

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af E2 (0,1 -10 pM) i 48 timer eller behandles med 1 uM E2 i en tidsforløbet mode (a). Telomeraseaktivitet blev bestemt ved TRAP-assay. hTERT RNA-ekspression blev bedømt ved real-time RT-PCR (B). Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af duplikerede prøver af mindst to uafhængige forsøg. (ITAS = intern telomerase assay standard, C = kontrol).

For at forstå den underliggende mekanisme for induktion af telomerase-aktivitet, vi kvantificeret ved real-time RT-PCR assay niveauet af hTERT mRNA ekspression under de samme betingelser. HTERT-genet koder den katalytiske subunit af telomerase og er sædvanligvis det hastighedsbegrænsende faktor for telomerase enzymatisk aktivitet. E2 øget hTERT mRNA-ekspression i en dosis-afhængig måde (1-10 uM). Denne opregulering af aktivitet blev observeret i løbet af 6 timer efter E2 behandling, og maksimal induktion af hTERT-mRNA-ekspression blev observeret ved 48 timer. E2-induceret hTERT mRNA-ekspression forblev forhøjede i mere end 72 timer (figur 1 B). Disse resultater tyder på, at reguleringen af ​​telomerase-aktivitet ved E2 kan forekomme ved transkriptionsniveauet i endometrie kræftceller.

Effekten af ​​UO126 på telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression i Ishikawa celler

Til adresse rolle MAPK-vejen i E2-induceret telomeraseaktivitet i Ishikawa-celler, vi oprindeligt vurderet evne UO126, en specifik MEK1 og MEK2 inhibitor, til direkte at inhibere telomeraseaktivitet. I Ishikawa-celler, UO126 inhiberede telomeraseaktivitet i en dosisafhængig måde (0,1-10 uM) som påvist ved TRAP-assay (figur 2A og 2B). Parallelt hermed UO126 faldt hTERT mRNA-ekspression i en dosis-afhængig måde, som kvantificeret ved real-time RT-PCR (figur 2C). Disse resultater viser, at UO126 er tilstrækkelig til at inhibere telomeraseaktivitet og hTERT mRNA transcription i endometriecancer-celler.

Ishikawa-celler blev behandlet med UO126 ved varierende koncentrationer (0,1-10 uM) i 24 timer. Telomeraseaktivitet blev bedømt ved TRAP-assay (A og B) hTERT-ekspression blev vurderet ved real time RT-PCR (C). (C = kontrol).

Effekten af ​​UO126 på E2-induceret telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression i Ishikawa celler

For at undersøge virkningen af ​​UO126 på E2-induceret telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression blev celler behandlet med 10 uM UO126, 1 uM E2 eller begge i kombination (10 uM UO126 + 1 uM E2) i 24 timer, og telomeraseaktivitet og hTERT-ekspression blev efterfølgende bestemt. Som vist i figur 3 inducerede E2 øget telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspression til ca. 2-3 gange den for kontrollen, og disse stimulerende virkninger blev næsten afskaffet i nærvær af UO126 (10 uM). Disse data antyder, at funktionen af ​​MEK-inhibitor, UO126, forekommer ikke kun på niveau med telomerase-enzymet selv, men også på det transskriptionelle niveau af hTERT-genet.

Celler blev behandlet med 10 uM UO126 ( U), 1 uM E2 eller begge i kombination i 24 timer. (A) Telomerase-aktivitet blev vurderet ved TRAP-assay. (B) Telomerase-aktivitet vist grafisk i at bruge TPG (samlede produkt genereret), som svarer til relative telomeraseaktivitet. TPG beregnes ud fra forholdet mellem TRAP produkt båndet til intern telomerase assay standard band. (C) hTERT-mRNA-ekspression blev bestemt ved real time RT-PCR. (C = kontrol).

Effekten af ​​UO126 på E2-induceret aktivering af p44 /42

For at vurdere samspillet mellem E2 og MAPK vej, vi brugte en phosphoryleret-specifikke p44 /42 MAPK-antistof til at identificere E2-induceret tyrosinphosphorylering af disse kinaser i Ishikawa cellelinie. Under serum-udsultede betingelser, vi iagttog et lavt basalniveau af tyrosin-phosphorylerede former af p44 /42. Efter behandling med 1 uM E2, phosphorylering af p44 /42 blev hurtigt induceret og nåede maksimal induktion 30 min efter behandling. Niveauet af phosphorylering af p44 /42 forblev forhøjede i ca. 60 min (figur 4A). Den samlede p44 /42 MAPK proteinniveauet forblev konstant gennem disse eksperimenter, som bestemt ved anvendelse af et ikke-phosphoryleret antistof mod p44 /42 for de samme cellemembraner. Inkubering med 10 pM UO126 blokerede fuldstændigt E2-induceret phosphorylering af p44 /42 (figur 4B og 4C).

Celler blev behandlet med 1 uM E2, 10 uM UO126 (U) eller begge i kombination i mindst 15 min og højst 24 timer. Phosphorylering af p42 /44 blev bestemt ved Western blotting-analyse. MAPK-aktivitet blev vurderet ved immunfældning assay for Elk1. E2 induceret phosphorylering af p42 /44 (A) og MAPK-aktivitet i en tidsafhængig måde (D). UO126 inhiberede phosphorylering af p42 /44 og MAPK-aktivitet induceret af E2 (B, C og E). (C = kontrol).

For at bekræfte at den øgede phosphorylering af p44 /42 repræsenterede den enzymatiske aktivitet af proteinet, målte vi p44 /42 kinaseaktivitet via et immunkompleks kinase assay, hvori Elk1 tjente som substrat. Den Elk1 transskriptionsfaktoren er et velkendt nedstrømsmål af p44 /42 og behandlede en markør for MAPK-aktivitet. Vi observerede en målbar stigning i aktiviteten af ​​p44 /42 efter E2 stimulation, med en maksimal top ved 30 min. Den p44 /42 kinaseaktivitet var proportional med graden af ​​phosphorylering af p44 /42. UO126 sænkede også p44 /42-kinaseaktivitet induceret af E2 (figur 4D og 4E). Disse data bekræfter en sammenhæng mellem E2 signalering og MAPK pathway i Ishikawa cellelinje.

Effekten af ​​E2 og UO126 på hTERT promoter aktivitet

Baseret på vores tidligere arbejde i endometrie cancer cellelinjer [2] kan den transkriptionelle aktivitet af hTERT-promotoren medieres af ERa binding til østrogenresponselementerne placeret på denne promotor. Den regulerende promotorsekvens af hTERT genet indeholder to formodede østrogenresponselementerne i den 5′-flankerende sekvens: den distale en på -2777 /-2755 og den proksimale en på -979 /-956, der overlapper med en-SP1-bindingssted [16], [ ,,,0],17]. For at bestemme om UO126 er involveret i reguleringen af ​​hTERT-promotor-aktivitet induceret af E2, udførte vi en række transiente transfektioner med luciferase reporter plasmider, der indeholder de varierende længder af 5′- promotorregionen af ​​hTERT-genet. Kort fortalt blev Ishikawa-celler transficeret med to ERE-reagerende reportere, hvoraf den ene indeholdt både EBS sites, og det andet, som kun indeholdt den proximale ERE /Sp1 (figur 5A). Som vist i figur 5B, E2 øget luciferaseaktivitet fra begge reportere til ca. 2,5 til 3 gange den for kontrollen. UO126 blokeres effektivt luciferaseaktivitet fra disse reportere i nærvær af E2 (figur 5B). Disse resultater antyder, at MAPK-vejen er involveret i E2 /ERa-aktivering af østrogenresponselementerne i hTERT-promotoren; og således kan denne pathway være kritisk ved mediering hTERT transkriptionsaktivitet induceret af E2.

Skematisk diagram af hTERT promotor- luciferase-plasmider viser to EBS bindingssteder og kernepromotor (A). Ishikawa-celler blev transficeret med hTERT promotor- luciferase-plasmider og luciferaseaktivitet blev analyseret efter udsættelse for 1 uM E2 eller 10 uM UO126 (U) i 36 timer. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD af duplikerede prøver af mindst to uafhængige forsøg. (C = kontrol).

Virkningerne af ERK1 /2-specifikke siRNA i kombination med E2 på telomerase-aktivitet, hTERT udtryk og hTERT promoter aktivitet i Ishikawa celler

For at verificere inddragelse af MAPK-vejen i E2-induktion af telomeraseaktivitet, undersøgte vi konsekvenserne af transfektion med ERK 1/2-specifikke siRNA i kombination med E2 på telomeraseaktivitet, hTERT-ekspression og hTERT-promotoraktivitet i Ishikawa cellelinie. ERK1 /2-specifikt siRNA reduceret phosphorylering af p42 /44 induceret af østrogen ved 48 timer som bestemt ved Western blotting-analyse (figur 6A). Ved densitometrisk kvantificering normaliseret til at styre protein eIF4E, E2 øget phosphorylering af p42 /44 med 29%, og E2 i nærvær af ERK1 /2 specifik siRNA faldt phosphorylering af p42 /44 med 79%. Telomeraseaktivitet og hTERT-ekspression blev analyseret ved TRAP-assay og real time RT-PCR ved 48 timer (figur 6B og 6C). Svarende til behandling med U0126, E2 inducerede forøgede telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspression til ca. 2-3 gange den for kontrollen, og disse stimulerende virkninger blev næsten afskaffet i nærvær af ERK 1/2-specifikke siRNA. Lucifersae blev analyseret efter celler blev transficeret med ERK1 /2 siRNA i 24 timer, efterfulgt af transfektion med hTERT-promotoren luciferase plasmid (P3915) og derefter behandling med 1 uM østrogen i 36 timer (figur 6D). Som fundet for UO126, transfektion med ERK 1/2-specifikke siRNA blokeres effektivt luciferaseaktivitet fra P3915 promotor i nærvær af E2. Disse resultater giver yderligere bevis på det indbyrdes forhold mellem MAPK pathway og E2-medieret induktion af hTERT transkriptionsaktivitet.

Cellerne blev enten transficeret med ERK1 /2 siRNA eller negativ kontrol (Neg) i 8 timer og derefter behandlet med 1 uM estrogen i 36-48 timer. Virkningen af ​​transfektion med ERK 1/2-specfic siRNA på phosphorylering for p42 /p44 fremkaldt af østrogen blev bedømt ved Western blotting ved 48 timer (figur 6A). Telomeraseaktivitet og hTERT-ekspression blev analyseret ved TRAP-assay og real time RT-PCR ved 48 timer (figur 6B og 6C). Lucifersae blev analyseret efter celler blev transficeret med ERK1 /2 siRNA i 24 timer, efterfulgt af transfektion med hTERT-promotoren luciferase plasmid (P3915) og derefter behandling med 1 uM østrogen i 36 timer (figur 6D). (ITAS = intern telomerase assay standard, C = kontrol).

Diskussion

Vi har tidligere vist, at E2 fremkalder telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression i ER-positive endometriecancer cellelinjer , eventuelt gennem binding af kompleks østrogen med ERa til østrogenresponselementerne findes inden hTERT-promotoren. I den foreliggende undersøgelse ønskede vi at fremkalde den underliggende molekylære mekanisme involveret i reguleringen af ​​telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression induceret af E2 i ERa-positive Ishikawa cellelinie. I betragtning af den veletablerede forhold mellem ERa og MAPK vej, virkede det logisk, at denne vej kan være involveret i induktion af telomerase af E2.

Behandling med UO126, en meget selektiv hæmmer af både MEK1 og MEK2, inhiberede telomeraseaktivitet og hTERT-mRNA-ekspression i Ishikawa-celler. Desuden U0126 blokerede fuldstændigt E2-stimuleret telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspression. Lignende resultater blev også fundet efter transfektion med ERK 1/2 -specifik siRNA. Behandling med E2 resulterede i hurtig phosphorylering af p44 /42 MAPK og øget MAPK funktionel aktivitet, og denne effekt kunne afskaffes ved tilsætning af UO126. Luciferaseassays demonstrerer, at udsættelse for UO126 eller ERK 1/2-specifikke siRNA modvirket den stimulerende virkning af E2 behandling på østrogenresponselementerne placeret i hTERT-promotoren. Således giver vi dokumentation for, at E2 fremkalder telomerase-aktivitet og hTERT mRNA-ekspression i ERa–positive endometriecancer celler, der er afhængig af signalering gennem MAPK pathway. Så vidt vi ved, har kun en anden undersøgelse impliceret et kooperativ rolle for MAPK i reguleringen af ​​hTERT med ER, og det var specielt til ERp i humane pancreas cellelinjer [26].

En række undersøgelser har vist, at reaktion af målgener til østrogen afhænger af flere vigtige faktorer, herunder arten af ​​østrogenreceptoren, liganden og celle sammenhæng target genpromotor og specifikke transkriptionelle faktorer, såvel som midler, der påvirker proteinkinaseaktivering og proteinphosphorylering [2] [16], [27] – [29]. Den humane hTERT-promotor indeholder en ufuldkommen østrogenresponselement (ERE) og en ERE /Sp1 halv site. Vi og andre har fundet, at østrogen-induceret hTERT-genekspression og telomeraseaktivitet kan skyldes den direkte binding af ERa til to ERE anlægsområder i promotorregionen af ​​hTERT-genet [2], [15] – [17]. Foruden østrogenresponselementerne, denne region besidder konsensussekvenser for bindingen af ​​transkriptionsfaktorer, såsom Sp1, Ap2, AP4, c-Myc, NF-1 og E-box [8], [29] – [31]. Det er blevet påvist, at E2 aktivering af kernen hTERT-promotoren helt kan elimineres, når c-myc sites er ophævet af mutationer [16]. E2 har også vist sig i væsentlig grad at aktivere c-myc-promotoren i luciferaseassays ved anvendelse c-myc-promotor-reporter plasmider [16]. Baseret på dette kulminerede beviser, kan det postuleres, at østrogen kan mediere hTERT transkriptionsaktivitet gennem ERa- direkte bindende østrogenresponselementerne i hTERT-promotoren eller alternativt ved E2-aktivering af transkriptionsfaktorer, som interagerer med denne promotor, eller sandsynligvis via en kombination af begge mekanismer.

MAPK signaleringskaskade regulerer en række cellulære aktiviteter, herunder cellevækst, differentiering, overlevelse og celledød. Denne vej menes at være afgørende i reguleringen af ​​ERa transskription, herunder en roman mekanisme, hvormed ERa og ERK2 co-lokalisere på kromatin bindingssteder og samarbejde i reguleringen af ​​hormon stimulering af proliferation [32], [33]. Østrogenreceptor signalering og aktivering af MAPK-vejen er også blevet impliceret i udviklingen og progressionen af ​​hormonelt-drevne cancerformer, såsom brystcancer og endometriel cancer. Progesteron har vist sig at inhibere østrogen-induceret aktivering af telomerase-aktivitet i bryst- og endometriecancer cellelinier [34], og MAPK-vejen blev påvist at være delvist ansvarlig for denne antagonistiske virkning. Tamoxifen, en fælles adjuverende behandling for brystcancer, har østrogenlignende egenskaber i livmodervæv og er forbundet med en øget risiko for endometriecancer. Behandling af endometriecancer-celler med tamoxifen er blevet vist at føre til induktion af telomeraseaktivitet som kunne blokeres effektivt ved en MEK-inhibitor. SP1-bindingssteder og ETS familiemedlem motiver er blevet fundet i hTERT-promotoren 5′-flankerende sekvens [30], [35] – [37], og disse repræsenterer potentielle transkriptionsfaktorer, der er målrettet af MAPK-vejen og kan induceres gennem østrogen og progesteron signalering.