Abstrakt
glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige voksne malignt gliom med dårlig prognose på grund af modstanden til radioterapi og kemoterapi, som kan være kritisk involveret i genoprettelse af cancer stamceller (CSCS) efter behandling. Vi havde undersøgt de særlige kendetegn ved cancer stamceller-lignende side population (SP) celler sorteret fra GBM celler, og studerede effekten af honokiol målretning på CSCS. GBM8401 SP celler besad de stamcelle markører, såsom nestin, CD133 og Oct4, og udtryk for selv-fornyelse relateret stemness gener, såsom
SMO
,
Notch3
IHH (indisk Hedgehog)
. Honokiol inhiberede proliferationen af begge GBM8401 parentale celler og SP-celler på en dosis-afhængig måde, IC
henholdsvis 50 var 5,3 ± 0,72 og 11 ± 1,1 pM,. Andelene af SP i GBM8401 celler blev formindsket ved honokiol fra 1,5 ± 0,22% ned til 0,3 ± 0,02% og 0,2 ± 0,01% ved doser på 2,5 uM og 5 uM, hhv. De SP celler syntes at have højere udtryk for
O
6-methylguanin-DNA methyltransferase (MGMT) og være mere modstandsdygtige over for Temozolomide (TMZ). Modstanden mod TMZ kunne kun svagt vendes ved MGMT inhibitor
O
6-benzylguanine (
O
6-BG), men markant forstærkes yderligere af honokiol tilføjelse. En sådan væsentlig forbedring blev ledsaget med den højere induktion af apoptose, større nedregulering af
Notch3
samt dens downstream
Hes1
udtryk i SP celler. Vores data viser, at honokiol kan have kliniske fordele for GBM patienter, som er refraktære over for TMZ behandling
Henvisning:. Lai IC, Shih PH, Yao CJ, Yeh CT, Wang-Peng J, Lui TN, et al . (2015) afskaffelse af Cancer Stem-lignende celler og Forstærket Temozolomide Følsomhed ved honokiol i glioblastoma multiforme Cells. PLoS ONE 10 (3): e0114830. doi: 10,1371 /journal.pone.0114830
Academic Redaktør: Waldemar Debinski, Wake Forest University, School of Medicine, UNITED STATES
Modtaget: April 1, 2013; Accepteret: November 14, 2014; Udgivet: 12 Mar 2015
Copyright: © 2015 Lai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Sundhed og Velfærd, Taiwan (MOHW103-TD-B-111-01), National Health Research Institutes, Taiwan (03A1 CAPP33-014) og Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (NSC 100-2632-B -038-001-MY3). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Malign hjernetumor er en af de mest dødelige kræftformer hos voksne. Baseret på WHO klassificering, klasse I tumorer er biologisk “godartet”, mens grad II tumorer er lav kvalitet maligniteter med længere kliniske kurser [1]. Grad III og IV er maligne gliomer, som er dødelig inden for få år og 9-12 måneder, henholdsvis [2]. High-grade gliom (glioblastoma multiforme, GBM), den hyppigste og ondartet hjernesvulst hos voksne er typisk resistente over for strålebehandling og kemoterapi. Overlevelsen af GBM efter kirurgi og strålebehandling blev begrænset i et år. Den kemoterapi, såsom Temozolomid (TMZ), kunne yderligere at forlænge overlevelsen op til omkring 20 måneder [3], men de fleste patienter døde inden for to år. Således søger efter innovative terapeutiske midler og udvikle nye strategier til ildfaste GBM patienter er bydende nødvendigt og presserende.
TMZ er et alkylerende kemoterapeutisk middel, der i øjeblikket anvendes til behandling af GBM. Den terapeutiske fordel ved TMZ afhænger af dets evne til alkylering /methylat nuklear syre, som oftest finder sted ved de N-7 eller O-6 positioner af guaninrester [4]. Denne methylering skader DNA replikation ved mispairing
O
-6-alkylguanin med thymin og udløser død af tumorceller. Det er påvist, at kræftceller, hvis udtrykkelig højere aktivitet af
O
6-methylguanin-DNA methyltransferase (MGMT), at en DNA reparation enzym fjerner TMZ-DNA addukt, kan mindske den terapeutiske effekt af TMZ og synes at være mere modstandsdygtig og modstandsdygtig over for TMZ behandling. Kombineret med MGMT-hæmmer, O
6-benzylguanine (
O
6 fotos -BG), kan øge cytotoksicitet af TMZ [3]. Men det kliniske fase II forsøg med
O
6-BG med TMZ viste ikke svaret fordel for GBM undtagen patienter med anaplastisk astrocytoma (AA) [5]. Årsagerne til denne uoverensstemmelse kan skyldes de forskellige maligne adfærd, herunder tilstedeværelsen af højere andel af cancer stamceller (CSC) i GBM [6]. Denne kliniske beviser gav anledning til vores motivation for at søge blandt alle midler, som er i stand til at målrette på CSC af TMZ-resistente GBM.
Forskningen for CSC eller tumor-initierende celle (TIC) blev en interessant område siden 2000. ligegyldigt hvad slags metoder, der anvendes til at identificere CSC, havde flere faste tumorcellelinier indeholdende CSC blevet rapporteret i medulloblastom, neuroblastom, gliom, brystcancer, gastrisk cancer og tyktarmskræft, etc. [7] det var også blevet påvist at patienter med recidiv eller refraktær til TMZ korrelerede med den højere andel af CSC forblev i tumormasse [6]. Derfor søger efter nye lægemidler rettet på CSC bliver en ny strategi for at opnå et bedre klinisk resultat af ildfaste GBM patienter.
CSCS besidder kendetegnende for selv-fornyelse kapaciteter, tumorigenese og afstamning differentiering i ikke-stamceller tumorceller samt ekspression af multidrug-resistens proteiner. Ud over at bruge CD markører for at identificere CSCS, en almindelig metode til isolering af CSCS er den side befolkning (SP) teknik, som blev mere og mere populær siden 2004. Denne sortering til isolering SP celler ved dobbelt bølgelængde flowcytometri er baseret på evnen af disse celler til udstrømning det fluorescerende DNA-bindende farvestof Hoechst 33342 [8]. Fænotypen af SP-celler er kendetegnet ved høj ekspression af brystcancer-resistent protein-1 (BCRP1 eller ABCG2), en af ATP-bindende kassette (ABC) transportere, som er forbundet med multiresistens i mange cancere ved udpumpning lægemidlerne [ ,,,0],9]. Da multiresistens er en vigtig egenskab ved CSCS, er det også blevet vist, at de sorterede SP celler er beriget af CSCS [10]. Således sortering SP celler postuleres at være en rig kilde til CSCS og repræsenterer en teknologiplatform til screening midler, som er i stand til at målrette på CSCS.
Traditionel kinesisk medicin er ofte blevet brugt i sygdomsbekæmpelse i tusinder af år .
Magnolia officinalis
, også kaldet Houpo i kinesisk eller Saiboku-tu på japansk, er en gammel slægt fordelt primært i Syd- og Østasien samt Øst og Nordamerika. Flere aktive forbindelser afledt af sine barks var blevet identificeret, såsom Magnolia, honokiol, 4-
O
-methylhonokiol, Obovatol og andre neolignan forbindelser, som besad mange forskellige biologiske funktioner, herunder forbedring af allergiske og astmatiske reaktioner [11 ]. Honokiol, en af de biphenolic bioaktive komponenter, besidder multifunktionelle aktiviteter, såsom antioxidant, anti-inflammatorisk, kemoforebyggende og neurobeskyttende virkninger [12, 13, 14, 15]. Som litteratur rapporteret, honokiol specielt hæmmet PI3K /mTOR signalering aktivering i gliomer [16]. Desuden foreslog vores nylige fund, at honokiol kunne rejse gennem blod-hjerne-barrieren (BBB), hvilket indikerer potentialet for malignt gliom behandling [17]. Men der er lidt oplysninger om sin anti-cancer effekt mod GBM celler, især virkningen på CSCS.
I dette papir, vi undersøgte virkningerne af honokiol om afskaffelse af CSCS og tilbageførsel af TMZ modstand i GBM8401 SP celler og studerede hvad underliggende mekanismer er ansvarlige.
Materiale og metoder
celler og materialer
honokiol (5,3′-diallyl-2,4′- dihydroxybiphenyl), sulforhodamin B (SRB), Hoechst 33342, Verapamil, reserpin,
O
6
benzylguanin (
O
6
–
BG) og Temozolomid (TMZ) blev købt fra Sigma Aldrich (Shanghai, Kina). Trizol RNA-ekstraktion reagens opnåedes fra MDBio Co. (Frederick, MD, USA). Menneskelig glioblastoma multiforme (GBM8401, BCRC No. 60.163) og human glioblastom /anaplastisk astrocytoma (U-87 MG, BCRC No. 60360) cellelinier blev indkøbt fra Bioresource Indsamling og Research Center (BCRC) Taiwan Food Industry Research og Development Institute . Andre høj kvalitet reagenser blev købt fra kommercielle virksomheder.
Cellekultur
humane glioblastom multiforme GBM8401 celler blev opretholdt med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) og human glioblastom /anaplastisk astrocytoma U87 MG-celler blev opretholdt i Eagles Minimum Essential Medium (MEM). Celler blev holdt i komplet medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 x ikke-essentielle aminosyrer og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin /
L-glutamin (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA ) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære.
SRB cellelevedygtighed assay
cytotoksicitet virkning honokiol blev bestemt ved anvendelse af en modificeret SRB kolorimetrisk anticancer-drug screening assay [18]. Kort fortalt blev passende mængder af celler udsået på 96-brønds fladbundede plader i 200 pi medium. Efter en 24 timers inkubation blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af honokiol (opløst i DMSO, blev slutkoncentrationen justeret til mindre end 0,05%), efterfulgt af inkubation i 3 flere dage ved 37 ° C, 5% CO
2. Mediet blev derefter aspireret, og cellerne blev fikseret på plasten underkonstruktion ved tilsætning af 100 pi 10% trichloreddikesyre (TCA) og inkubation i 2 timer ved 4 ° C. Pladerne blev vasket fem gange med vand til fjernelse af TCA og lufttørret i mindst 1 time. Dette blev efterfulgt af farvning med 200 pi 0,065% SRB (sulforhodamin B) i 30 minutter ved stuetemperatur, vask fem gange med 1% eddikesyre for at fjerne ubundet farvestof og efterfølgende lufttørring. Bundet farvestof opløstes med 200 pi 10 mM Tris-base (pH 10,5). Absorbansen blev læst ved hjælp af et spektrofotometer ved 570 nm.
Isolering af Side Befolkning (SP) og Non-SP (NSP) Celler
Identifikation af side befolkning blev udført med mindre ændring som beskrevet tidligere [19]. GBM8401 eller U-87 MG-celler (10
6 /ml) blev inkuberet i medium indeholdende Hoechst 33342 (5 ug /ml) med eller uden positiv kontrol (ABC transporter inhibitor, verapamil eller reserpin) i 3 timer ved 37 ° C . Efter inkubation blev cellerne analyseret under anvendelse af et fluorescerende cellesortering system med en DIVA software (FACSAria III, Becton Dickinson). Levende celler blev gated hjælp propidiumiodid og analyseret ved anvendelse af en kombination af en 450 nm (Hoechst blå) og en 675 nm (Hoechst Red) filter efter excitation med en 350 nm NUV laser. De SP celler blev afgjort identificeret på behandling af specifikke inhibitorer mod ATP-bindende kassette transportører. Den største cellepopulation, opkaldt ikke-SP (NSP) -celler, blev signifikant farvet med Hoechst 33342. Både SP og ikke-SP-celler blev sorteret og høstet henholdsvis til yderligere undersøgelse. SP-celler blev vedligeholdt med HEscGro medium (Millipore, Billerica, MA, USA) indeholdende epidermal vækstfaktor (EGF, 10 ng /ml) plus basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 8 ng /ml), men uden nogen serum, og ikke-SP celler blev inkuberet med DMEM komplet medium.
flowcytometrisk analyse af differentiering og celleoverflademarkører
Enkeltcellesuspensioner blev selekteret ved anvendelse af en 4-laser FACScalibur (BD Science) og farvet med forskellige af antistoffer mod CD-markører, som er højt udtrykt i cancer stamceller: anti-humant CD24-FITC, anti-humant CD26-FITC, anti-humant CD29-FITC, anti-humant CD90-FITC, anti-humant CD133-PE, anti -human CD44-PE. Parentale, SP og ikke-SP-celler blev inkuberet med specifikke antistoffer, der er nævnt ovenfor i 1 time, og derefter analyseret med flowcytometri efter vask. I tilfælde af at studere differentieringen evne SP-celler, blev den differentierede SP (d-SP) celler opnået efter dyrkning i komplet medium i en uge. D-SP, SP og parentale celler blev derefter inkuberet med fluorescerende farvestof-konjugerede antistoffer, såsom anti-GFAP-PE og anti-MAP2B-Alexa Fluor488 henholdsvis i 1 time. Intensiteterne af cellulær fluorescens blev derefter analyseret med flowcytometri efter vask. Alle de fluorescerende antistoffer blev indkøbt fra BD Biosciences, San Jose, CA, USA, undtagen det anti-humane CD24-FITC (eBioscience, San Diego, CA, USA).
Reverse Transcription PCR-analyse
Celler blev behandlet med honokiol eller Temozolomid i 48 timer blev det totale cellulære RNA isoleret ved anvendelse MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller, og derefter kvantificeret ved en absorbans ved 260 nm. RNA renhed blev bestemt ved anvendelse af A260 /A280-forhold (gennemsnit ≥ 1,8). Totalt RNA fra hver prøve blev først revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af en MMLV revers transkriptase 1st-Strand cDNA Synthesis Kit (Epicentre Biotechnologies), og derefter target gener blev amplificeret ved anvendelse af Taq DNA Polymerase Master Mix (Ampliqon, Lars Quist, Danmark). Prøver blev udsat for 30 cyklusser af amplifikation (cDNA-syntese ved 37 ° C i 1 time efterfulgt af præ-denaturering ved 94-C i 2 min, og PCR-amplifikation blev udført med denaturering ved 94 ° C i 30 sek, annealing ved 58- 60 ° C i 30 sek, forlængelse ved 72 ° C i 1 min, og den endelige forlængelse ved 72 ° C i 10 min). PCR-produkter blev blandet med EZ-Vision DNA Dye (Amresco, Solon, OH, USA) og derefter elektroforesebehandlet på en 1,8% agarosegel, endelig visualiseret ved UV-Visible Transilluminators System. Dataene blev derefter kvantificeret med Image J software.
Western Blotting
Efter behandling blev cellelysaterne fremstillet under anvendelse ReadyPrep Protein Extraction Kit (Bio-Rad) ifølge instruktionerne. Samlede cellelysater (20 ug) blev separeret elektroforetisk af en 10% polyacrylamid SDS-PAGE-gel og overført til en polyvinylidenfluoridmembran anvendelse af Bio-Rad Mini-Protean transfersystemet. Membranen blev beskåret og yderligere inkuberet natten over ved 4 ° C med specifikke antistoffer mod CD133 (St Johns Laboratory Ltd, London, UK), MGMT (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) og tubulin (Abcam, Cambridge, MA, USA ), henholdsvis. Efter inkubation med primære antistoffer, blev de beskårne membraner vasket med TBST 3 gange og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-mærket sekundært antistof i 90 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med TBST 3 gange, blev den endelige afsløring udført med forøget kemiluminescens (ECL) Western blotting reagenser (Minipore) og BioSpectrum Imaging System (UVP, Upland, CA, USA).
Cell Cycle Evaluation
Celler blev behandlet med honokiol eller Temozolomid i 48 timer. Ved slutningen af inkubationen blev cellerne høstet og fikseret med 70% ethanol natten over og derefter inkuberet med en 25 ug /ml PI, 0,5% Triton X-100, og 0,2 ug /ml RNase A opløsning i 30 minutter efter vask med kold PBS . Endelig blev cellerne resuspenderet i 500 pi PBS og derefter analyseret ved flowcytometri (Cytomics FC500, Beckman Coulter). Data blev indsamlet fra 10.000 celler og evalueret af CXP software.
Statistisk analyse
Alle forsøg blev udført mindst tre gange og data præsenteres som gennemsnit ± SD. Statistisk signifikante forskelle blev baseret på sammenligning med de ubehandlede grupper, og blev beregnet ved en en- eller to-vejs variansanalyse (ANOVA) og Studerendes
t
-test statistisk software. Værdier af p 0,05 blev anset for signifikant
Resultater
Isolering af Side Befolkning (SP) Celler fra GBM8401 og U-87 MG cellelinier
Andelen af Verapamil-. følsomme SP celler af GBM8401 eller U-87 MG blev analyseret ved flowcytometri baseret på udelukkelsen af DNA-bindende Hoechst 33342 farvestof. Som vist i fig. 1, er der 1,3 ± 0,2% og 1,7 ± 0,3% af SP-celler detekteret i U-87 MG og GBM8401 celler. Disse SP-celler blev derefter dyrket i et ophængningssystem med stamcelle dyrkningsmedium. Kuglerne optrådte i suspensionen blev tydeligt observeret på dag 7-10, der kunne høstes for efterfølgende molekylære assays.
(A) SP procentdel blev analyseret i GBM8401 og U-87 MG-celler ved Hoechst-farvning og flowcytometri. Cellerne blev inkuberet med fravær eller nærvær af specifik inhibitor Verapamil (100 pM) i 3 timer. SP blev udført efterfulgt af farvning af cellerne med Hoechst33342 (5 ug /ml) i 90 minutter. Morfologien af GBM8401 (B) og U-87 MG (C) parentale og SP-celler blev monitoreret og fotograferet efter udførelsen af SP flowcytometri. SP-celler blev inkuberet i serumfrit konditioneret medium i 1 uge og sfæroiden morfologi blev observeret. De SP celler blev differentieret i ikke-SP (NSP) celler for langsigtet kultur i komplet serum medium.
Differentiering Funktion for SP Celler
I tilfælde af at studere differentiering evne af SP-celler blev differentieret SP (d-SP) celler opnået efter dyrkning i komplet medium i en uge. Som vist i fig. 2 (A), GBM8401 SP-celler besad meget lavere ekspression af neuronal markør MAP2B (2 ± 0,4%), hvilket indikerer deres udifferentierede status. Når GBM8401 SP cellerne blev differentieret til d-SP celler, udtryk for neuronal markør MAP2B blev så høj som forældrenes celler (50 ± 1,9% i forældrenes og 55 ± 2,7% i d-SP-celler). Tilsvarende ekspression af astrocyt-specifikke markør GFAP (glial fibrillært surt protein) i U-87 MG SP-celler (1,7 ± 0,2%) var meget lavere end i de parentale celler (30 ± 1,8%). Når disse U-87 MG SP celler blev differentieret til d-SP celler blev ekspression af GFAP markant øget til 8 ± 1,1% (fig. 2 (B)).
Parental, SP og differentieret SP ( d-SP) celler blev høstet for at analysere ekspressionen af specifikke markør protein, såsom mikrotubulus-associeret protein 2B (MAP2B) i GBM8401 (A) og glial fibrillært surt protein (GFAP) i U-87 MG (B) celler. Signaler blev justeret ved at fratrække baggrund af respektive isotypekontrol.
Karakterisering af GBM8401 SP Cells med Cancer Stem celleoverflademarkører
CD24, CD26, CD29, CD44, CD90 og CD133 har været meget anvendt til at identificere CSCS af faste tumorer [20]. Ekspressionen af disse CD markører i de friske SP og ikke-SP-celler sorteret fra GBM8401 celler blev vist i fig. 3. Udtrykkene af CD24, CD26, CD44 og CD133 i SP-celler var signifikant (p 0,05) højere end i de ikke-SP-celler, graden af folderne var 1,8 ± 0,2, 2,5 ± 0,3, 1,7 ± 0,1 og 1,8 ± 0,2, hhv. Der var ingen signifikante forskelle i angivelsen af de to andre markører, CD29 og CD90 (data ikke vist).
GBM8401 SP og ikke-SP celler blev sorteret og derefter inkuberet med specifikke anti-CD markør antistoffer eller med isotypekontrol i 1 time hhv. Efter vask med PBS og centrifugering blev cellerne resuspenderet med PBS og analyseret ved flowcytometri. Histogrammerne af flowcytometri analyse af CD133 (A), blev CD24 (B), CD26 (C), og CD44 (D) vist. Udtrykkene for de ovennævnte stemness markører i SP-celler var signifikant højere end i ikke-SP-celler. Imidlertid udtrykkene for andre markører, såsom CD29, CD90, og SSEA-4, var tilsyneladende ikke forskellige (data ikke vist).
Ekspressionen af Stemness Gene er anderledes i SP og ikke- SP (NSP) celler
for yderligere at undersøge den differentielle ekspression af stemness gener i SP og ikke-SP celler, undersøgte vi mRNA ekspressionen af
Oct-4
,
CD133
,
Nestin
,
β-tubulin-III
,
Notch3
,
IHH
og
SMO
i GBM8401 forældrenes, SP og ikke-SP-celler. Undtagen
β-tubulin-III
, udtrykkene for mRNA’er ovennævnte var alle signifikant (p 0,05). Højere i SP-celler i forhold til den parentale og de ikke-SP-celler (figur 4 (A ) og 4 (B)). Desuden mRNA niveauet af multiresistent protein, såsom
MDR1
ABCG2
, og
MGMT
udtryk i SP cellerne var også højere end i parentale og ikke-SP-celler (fig. 4 (A) og 4 (b)). I overensstemmelse med mRNA data, protein niveauer af GBM CSC markør CD133 og TMZ resistens-associeret protein MGMT var naturligvis meget højere i SP-celler sammenlignet med de parentale og ikke-SP-celler (fig. 4 (C)).
(A) RT-PCR-analyse for udtryk for stemness markører (
CD113
,
Oct-4
), neuronal differentiering markører (
nestin
,
β-tubulin III
), DNA-reparation enzym (
MGMT
), stemness signalvej (
Notch3
,
IHH
,
SMO
) og lægemiddel-resistensgener (
ABCG2
,
MDR1
,
MGMT
). Undtagen neuronal differentiering markør
β-tubulin III
, alle de stemness gener udtryk i SP-celler var signifikant højere end i forældrenes og ikke-SP (NSP) celler.
β-Actin
GAPDH
blev brugt som lastning kontrol. (B) Kvantitativ og statistisk dataanalyse af (A) og to uafhængige lignende forsøg. *, P 0,05 i forhold til forældrenes celler. (C) Western blot analyse for protein niveauer af GBM CSC markør CD133 og TMZ modstand-associeret protein MGMT. Både CD133 og MGMT proteinniveauer var naturligvis meget højere i SP-celler sammenlignet med de parentale og ikke-SP-celler. Den tubulin blev anvendt som lastning kontrol.
honokiol Eliminerer SP og Hæmmer spredning af GBM8401 Celler
GBM8401 forældre- og SP-celler blev behandlet med forskellige doser af honokiol. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved SRB-assay og andelen af SP-celler blev analyseret ved flowcytometri. Resultatet viste, at honokiol inhiberede proliferationen af GBM8401 parentale og SP-celler på en dosis-afhængig måde (Fig. 5A). De GBM8401 SP-celler var mere resistente over for honokiol sammenlignet med parentale celler, IC
50 var 11,2 ± 1,1 og 5,3 ± 0,7 uM. Følsomheden af ikke-SP (NSP) celler til honokiol var den samme som af parentale celler (S1 Fig.). På den anden side blev den del af SP population i parentale celler mindskes ved honokiol fra 1,5 ± 0,23% ned til 0,3 ± 0,02% og 0,2 ± 0,02% ved doser på 2,5 pM og 5 pM, henholdsvis som vist i fig. 5B.
(A) GBM8401 parentale eller SP-celler blev inkuberet med serie koncentrationer af honokiol i 48 timer, og cellelevedygtigheden blev undersøgt ved SRB-assay. (B) GBM8401 celler blev inkuberet med fravær eller nærvær af specifik inhibitor Verapamil (50 uM) og honokiol (2,5 og 5 uM) i 48 t. Efter vasket med PBS og centrifugering blev SP-assay udført efterfulgt af farvning af cellerne med Hoechst33342 (5 ug /ml) i 90 minutter.
honokiol yderligere øger cytotoksicitet og apoptose induceret af kombinationen af temozolomid og MGMT Inhibitor
O
6
-BG i GBM8401 SP Celler
Som fig. 6A viser, GBM8401 SP celler var yderst højere resistente over for TMZ end de parentale celler, IC
50 var 490 ± 5,3 uM og 15 ± 0,4 uM hhv. Lignende resultat blev også observeret i de U-87 MG parentale og SP-celler. Da GBM8401 celler var relativt resistente over for TMZ end U-87 MG-celler, valgte vi derefter GBM8401 celler for at undersøge virkningerne af honokiol på denne modstand af SP-celler til TMZ. Ved en dosis på 50 uM, TMZ faldt kun lidt omkring 20% af SP cellelevedygtighed. Co-behandling med enten
O
6
–
BG (10 uM) eller honokiol (5 uM), cellen levedygtighed 50 uM TMZ-behandlet gruppe blev faldet lidt fra ca. 80% til 60% og 40%, henholdsvis (fig. 6B). Den co-behandling på 50 uM TMZ plus 10 uM
O
6
-BG kunne ikke forbedres yderligere ved at øge dosis af
O
6 fotos -BG til 20 pM (fig. 6B). Dog kunne det være betydeligt forbedret ved honokiol i en dosisafhængig måde. Cellelevedygtigheden blev yderligere faldt betydeligt til 23% (p 0,05) og 10% (p 0,01) ved honokiol i doser på 2,5 pM og 5 pM, henholdsvis i forhold til 50 pM TMZ plus 10 uM
o
6 fotos -BG-behandlede gruppe (fig. 6C). I tråd med dette, blev kun minimal apoptotiske virkninger fremkaldt af enkeltstof alene blev observeret, og ingen væsentlig forøgelse af sub-G1 procenter observeres, hvis kombineret TMZ med enten
O
6
–
BG eller honokiol. Men slående stigninger i apoptose (ca. 30% sub-G1 celler, p 0,05) blev fundet, mens celler blev behandlet med TMZ (10 uM),
O
6
–
BG (10 uM) og honokiol (5 uM) sammen (fig. 7). De sub-G1 proportioner GBM8401 SP celler behandlet med honokiol og TMZ med eller uden
O
6
–
BG blev vist i tabel 1.
(A) U-87 MG og GBM8401 parentale celler og SP-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af TMZ. Både GBM8401 og U87 MG SP celler var mere resistente over for TMZ end deres parentale celler. (B) Virkningerne af
O
6
-BG (uM) eller honokiol (uM) på TMZ (uM) -suppressed GBM8401 SP cellelevedygtighed. *, P 0,05 sammenlignet med blanke; #, P 0,05 sammenlignet med 50 pM TMZ-behandlede gruppe. Ingen signifikant forskel mellem hver to pund sign grupper. (C) De kombinerede virkninger af honokiol og TMZ plus
O
6 fotos -BG på cellens levedygtighed GBM8401 celler. *, P 0,05; **, P 0,01 i forhold til anden gruppe angivet i søjlediagrammet. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved SRB-assay med tredobbelte prøver. H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6 fotos -BG.
GBM8401 SP celler blev behandlet med 0,05% DMSO (A), 5 uM honokiol (B) , 10 uM TMZ (C), 5 uM honokiol kombineret med 10 pM TMZ (D), 10 uM TMZ plus 10 uM
O
6
-BG (E), og 5 uM honokiol kombineret med 10 pM TMZ plus 10 uM
O
6
-BG (F) i 72 timer, hhv. Efter høst blev cellerne fikseret og farvet med PI i 30 minutter og cellecyklussen blev undersøgt ved flowcytometri. Honokiol forbedret
O
6
-BG kombineret med TMZ-cytotoksicitet ved at fremme apoptotisk celledød. H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6 fotos -BG.
honokiol i kombination med
O
6
–
BG Yderligere Hæmmer Temozolomid-induceret Notch3 /Hes1 Cascade i GBM8401 SP Celler
Som vist i fig. 8 (A) og 8 (B), mRNA niveauerne af
MGMT
samt
Notch3
og dens nedstrøms
Hes1
var signifikant (p 0,05) steg med TMZ (100 uM) behandling i forhold til kontrolgruppen. Honokiol (5 uM) effektivt afskaffede TMZ-inducerede udtryk for
Hes1
MGMT
. Ved tilstedeværelse af
O
6
–
BG (20 uM) blev protein niveau af MGMT markant formindsket (. Figur 8 (C)) . Når det kombineres med
O
6
–
BG (20 uM), honokiol yderligere (p 0,05) formindsket TMZ-inducerede ekspression af
Notch3
og
Hes1
mRNA, hvilket indikerer potentielle rolle honokiol i kombination med
O
6
–
BG for at vende TMZ modstand i GBM SP celler.
(A) RT-PCR-analyse for ekspression af
Notch3
,
Hes1
MGMT
mRNA i SP-celler. GBM8401 SP-celler blev behandlet med 2,5 og 5 uM honokiol (bane 2 og 3, henholdsvis), 100 uM TMZ (bane 4), 100 uM TMZ plus 5 uM honokiol (bane 5), 100 uM TMZ plus 20 pM
O
6
-BG (bane 6), og 2,5 og 5 uM honokiol kombineret med 100 uM TMZ plus 20 uM
O
6
-BG (bane 7 og 8, henholdsvis) i 48 timer.
18S
blev anvendt som lastning kontrol. Honokiol i kombination med
O
6
–
BG Yderligere undertrykt Temozolomid-induceret forhøjelse af
Notch3
Hes1
mRNA’er. (B) Kvantitativ og statistisk dataanalyse af (A) og to uafhængige lignende forsøg. (C) Western blot-analyse for proteinniveauet af MGMT i GBM8401 SP celler behandlet med midler som beskrevet i (A). Den tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. CTL, DMSO mock kontrol; H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6 fotos -BG. *, P 0,05 sammenlignet med DMSO mock kontrolgruppe. #, P 0,05 sammenlignet med 100 uM TMZ-behandlede gruppe
Diskussion
“side befolkning” (SP) teknik er en veletableret metode til at isolere kræft stem-. lignende celler. For nylig havde Fukaya og hans kolleger offentliggjort en artikel ved hjælp af SP teknik til at isolere cancerstamceller-lignende celler fra forskellige humane glioblastom-cellelinier [21]. Deres undersøgelse viste, at SP-celler havde højere drug efflux kapacitet, mere stemness gener ekspression og større tumorigenesity sammenlignet med ikke-SP-celler. Ligeledes i denne undersøgelse, SP isoleret fra GBM8401 celler syntes at have CSC egenskaber. Ud over
Nestin
,
Notch-1
og
ABCG2
, vi havde også viste andre stemness gener, såsom
CD133
,
Oct4
,
MGMT
MDR1
blev mere udtrykt i SP celler sammenlignet med ikke-SP celler. Endvidere kunne SP-celler differentiere til forskellige fænotype af celler med differentieringsmarkører, såsom GFAP og MAP2B. De naturligvis meget højere CD133 og MGMT protein niveauer af SP celler yderligere karakteriseret deres stamceller-lignende celle egenskaber, og derfor GBM8401 SP repræsenterede en beriget CSC befolkning.
Gliom CSCS kunne isoleres og identificeres ved celleoverflademarkører, såsom Nestin og CD133, som også blev højt udtrykt i vore SP-celler. CD133 er den mest almindelige celleoverflademarkører for hjernesvulst stamcelle identifikation og adskillelse; Men de procentdele af CD133-positive celler isoleret fra humane hjerne tumorvæv var ikke konsekvent, varierede fra 3% til 45% [22]. Derfor er det ikke convincible at karakterisere cancer stamceller ved anvendelse af kun en specifik celleoverflademarkør [23]. Baseret på vores resultater, blev andre markører, såsom CD24, CD26 og CD44 også mere udtrykt i GBM8401 SP-celler sammenlignet med ikke-SP-celler, varierede fra 1,7 til 2,5 folder. CSC egenskaber SP celler blev yderligere bekræftet af beviser for højere udtryk for flere stemness markører beskrevet ovenfor.
Det blev påvist, at CD133-højt udtrykte celler placeret på den centrale del af tumor viste mere modstandsdygtige over for TMZ i modsætning til dem, der findes ved den perifere lag [6]. Følgelig TMZ resistente GBM var blevet vist, at indeholde større andel af CD133
+ celler og TMZ resistente SP celler i denne undersøgelse også besad højere niveau af CD133.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.