PLoS ONE: Overekspression af Mcl-1L Splice Variant er forbundet med dårlig prognose og kemoresistens i oral cancer

abstrakt

Baggrund

ændret ekspression af Mcl-1, et anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-familien, er blevet forbundet med progression og resultatet af en række forskellige maligniteter. Vi har tidligere rapporteret overekspressionen af ​​Mcl-1-protein i humane oral cancer. Den foreliggende undersøgelse har til formål at evaluere klinisk-patologisk betydning af ekspressionen af ​​tre kendte Mcl-1 isoformer i orale tumorer og effekten af ​​at målrette Mcl-1L isoform på kemosensitivitet af orale kræftceller.

Metoder

udtrykket af Mcl-1 isoforms- Mcl-1L, MCL-1S MCL-1ES blev analyseret i 130 parrede orale tumorer og 9 orale cellelinjer under anvendelse kvantitativ real-time PCR protein ved western blotting. MCL-1 mRNA niveauer blev korreleret med klinisk-patologiske parametre og resultatet af orale kræftpatienter. Effekten af ​​Mcl-1L shRNA eller Obatoclax (et lille molekyle Mcl-1 hæmmer), i kombination med cisplatin på kemosensitivitet af orale kræftceller blev også vurderet.

Resultater

Anti-apoptotiske Mcl -1 L blev overvejende udtrykt over lave eller ikke-detekterbare pro-apoptotiske MCL-1S og Mcl-1ES isoformer. MCL-1L udskrifter signifikant overudtrykt i alle cancer cellelinjer og i 64% orale tumorer versus tilstødende raske (

P

0,02). I orale kræftpatienter, blev høj Mcl-1L udtryk signifikant associeret med node positivitet (

P

= 0,021), avanceret tumorstørrelse (

P

= 0,013) og dårlig samlet overlevelse (

P

= 0,002). Multivariat analyse viste Mcl-1L til at være en uafhængig prognostisk faktor for oral cancer (

P

= 0,037). MCL-1L shRNA knockdown eller dets hæmning af Obatoclax i kombination med cisplatin synergistisk nedsat levedygtighed og vækst af orale kræftceller end både behandling alene.

Konklusion

Vores undersøgelser tyder på, at overekspression af Mcl-1L er forbundet med dårlig prognose og kemoresistens i oral cancer. MCL-1L er en uafhængig prognostisk faktor og et potentielt terapeutisk mål i oral cancer

Henvisning:. Palve V, Mallick S, Ghaisas G, Kannan S, Teni T (2014) Overekspression af MCL-1L Splice variant forbundet med dårlig prognose og kemoresistens i oral cancer. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10,1371 /journal.pone.0111927

Redaktør: Kithiganahalli N. Balaji, Indian Institute of Science, Bangalore, Indien

Modtaget: 9. juni 2014, Accepteret: 9 okt 2014; Udgivet: November 19, 2014

Copyright: © 2014 Palve et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral cancer er den mest udbredte kræftform blandt indiske mænd og overvejende forbundet med tobak-tygge vane fremherskende i landet [1]. Trods de seneste fremskridt inden behandlingsmodaliteter som kirurgi, strålebehandling /kemoterapi, har overlevelsen af ​​orale kræftpatienter langsigtet ikke ændret sig væsentligt. De faktorer, der er forbundet med dårlig prognose af oral cancer omfatter, præsentation på et avanceret klinisk stadie ukontrolleret loco-regional tilbagefald [2]. Derfor er det vigtigt at belyse de mekanismer, der er involveret i udviklingen og progressionen af ​​kræft i mundhulen og identificere molekylære mål for bedre forvaltning sygdom.

Mundtlige kræftformer har gentagne gange været forbundet med apoptotisk dysregulering [3]. Pro og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien er de vigtigste regulatorer af cellulær apoptose og spiller en kritisk rolle ved regulering af celleoverlevelse [4]. MCL-1 (myeloid celleleukæmi-1) er en vigtig anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-genfamilien, afgørende for udviklingen og differentiering og proliferation [5]. Cellulær ekspression af Mcl-1 reguleres stramt gennem flere transkriptionelle og post-transkriptionelle mekanismer [6]. Øget Mcl-1-ekspression kan producere moderat kort sigt forbedring i en bred vifte af celletyper. MCL-1 kan fremme celleoverlevelse ved at undertrykke frigivelse af cytochrom-c fra mitokondrier via heterodimerisering og neutraliseringen af ​​effektorceller pro-apoptotiske BH3-only proteiner, såsom Bak og Noxa [7]. Overekspressionen af ​​Mcl-1 er blevet rapporteret i mange forskellige maligniteter, herunder hæmatopoietiske, lymfoide og faste tumorer [8], [9]. Overekspression af Mcl-1 er blevet forbundet med aggressive tumor egenskaber, modstandsdygtighed over for behandling og dårlig prognose i bryst-, mave-, ovarie- livmoderhalskræft [10] – [13]

Selvom MCL-1-genet er blevet omfattende undersøgt i myelomatose og leukæmi, der er sjældne rapporter om Mcl-1 analyse i hoved- og halscancer.. Nylige undersøgelser fra vores laboratorium har vist signifikant overekspression af Mcl-1-protein i orale cancercellelinier, præmaligne læsioner (OSF) og orale tumorer ved immunhistokemi [14]. Vi har også påvist høj PCNA og Mcl-1-protein-ekspression at være associeret med dårlig prognose i orale kræftpatienter behandlet med endelig strålebehandling [15]. Men situationen er kompleks på grund af eksistensen af ​​tre forskellige MCL-1 isoformer har kontrasterende funktioner nemlig anti-apoptotiske Mcl-1L og pro-apoptotiske Mcl-1S MCL-1ES [16]. Interessant nok har vores laboratorium nylig rapporteret foreningen af ​​anti-apoptotiske Mcl-1L isoformen med overlevelse og radioresistance af orale skællede carcinomceller [17].

Mcl-1 har også vist sig at spille en rolle i kemoresistens af en række kræftformer, men den rolle, dens isoformer i kemoresistens er ikke undersøgt i kræft, herunder oral cancer. Stråling efterfulgt af kemoterapi er den almindelige behandling modalitet til oral cancer og Mcl-1 overekspression har vist sig at give resistens over for konventionelle kemoterapeutiske stoffer som cisplatin [18]. Adskillige rapporter har vist, at Mcl-1 fremmer celleoverlevelse og målretning Mcl-1 via BH3-mimetiske molekyler kan inducere celledød i Cisplatin resistente cancerceller [19], [20]. For nylig Obatoclax, et BH3 mimetisk lille molekyle inhibitor er blevet vist at antagonisere Mcl-1-protein og overvinde Mcl-1 medieret resistens over for apoptose [21], [22]. Vore nylige undersøgelser tyder Mcl-1 at være vigtige for overlevelse af orale cancerceller og dermed målrette Mcl-1 kunne være nyttige i behandling af orale kræftpatienter. Men til vor bedste viden, sådanne undersøgelser er ikke tilgængelige i kræft i mundhulen. Den foreliggende undersøgelse blev således forpligtet sig til at evaluere den kliniske betydning af Mcl-1 isoformer i kræft i mundhulen og effekten af ​​at målrette Mcl-1 til chemosensitize mundtlige kræftceller

in vitro

.

Materialer og metoder

Cellekulturer

Seven oral cancer celle linjer-SCC25, QLL1 (fra Dr. Park, Yonsei University College of Medicine, Korea [23] Dr. Rheinwald, Harvard Medical School, Boston [ ,,,0],24]); UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 UPCI: SCC074 (Fra Dr. S Gollin, University of Pittsburgh, PA) [25]; AW8507 AW13516 [26] blev anvendt i undersøgelsen. Derudover en udødeliggjort Fetal mundslimhinden (FBM) [27] og en Dysplastisk Oral Keratinocyt (DOK) (fra Dr. Ken Parkinson, Queen Marys School of Medicine Tandpleje, UK) [28] cellelinier blev også brugt i studie. Cellerne blev holdt i MEM eller IMDM suppleret med 10% FBS 1% standard antibiotisk blanding i 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C som beskrevet tidligere [17], [23], [29].

Mundtlige væv

Denne undersøgelse var godkendt af Institutional Review Board of Tata Memorial Centre og Sharad Pawar Dental College, Indien. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. Behandling naive primære orale tumorprøver og deres tilstødende normale væv blev opnået fra 130 patienter, der gennemgår kirurgi på hoved og hals enhed og fra ICMR National tumorvæv Repository, Tata Memorial Center, Mumbai, Indien. Betændte orale væv (n = 20) blev indsamlet som sunde normale væv fra patienter, der gennemgår mindre dental kirurgisk procedure ved Institut for Oral Patologi, Sharad Pawar Dental College, Wardha, Indien. Alle væv blev frosset øjeblikkeligt i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. De klinisk-patologiske karakteristika kohorten er illustreret i tabel 1.

RNA-isolering og Real-time PCR

RNA fra cellepellets og væv blev ekstraheret ved anvendelse af TRI-reagens (Sigma, USA) ifølge fabrikantens protokol. RNA’et blev opløst i DEPC-behandlet vand og kontaminerende DNA blev fjernet ved DNasel behandling (Sigma, USA). RNA integritet blev analyseret ved elektroforese og prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil analyse, som beskrevet tidligere [17]. cDNA blev syntetiseret med 500 ng total RNA, ved anvendelse af en første streng cDNA-syntese kit (MBI Fermentas, Canada) ifølge producentens instruktioner. CDNA’et blev dernæst udsat for kvantitativ real-time PCR under anvendelse Taqman universal PCR Master Mix (ABI, 4.304.437) og MCL-1 isoformspecifik genekspression prober (ABI,

Mcl-1L

: Hs00172036_m1;

Mcl -1S

: Hs00766187_m1

Mcl-1ES

: 4.331.348). Amplifikationen blev udført på ABI-7900HT real time PCR-system (Applied Biosystems, USA). GAPDH (ABI, Hs99999905_m1) blev anvendt som intern kontrol for at normalisere inter prøve variation i RNA input amplifikationseffektivitet. Alle amplifikationsreaktioner blev udført in triplo ved hjælp DEPC behandlet vand som negative kontroller. Analysen af ​​genekspression data blev udført ved hjælp af sammenligningseksempel C

fremgangsmåde til relativ kvantificering [30].

Western blotting

Proteiner blev ekstraheret fra cellepellets og tumorvæv T som beskrevet tidligere [14]. Kort fortalt blev 30 mg frosset væv pulveriseret i dødelige pistil anvendelse af flydende nitrogen, opløst i afkølet ProteoJET Mammalian Cell Lysis Reagent indeholdende ProteoBlock Protease Inhibitor Cocktail (Fermentas, USA) og sonikeret på is. vævs- eller cellelysater de blev klaret ved centrifugering ved 14000 rpm ved 4 ° C. Proteinet estimering blev udført ved Bradford-metoden. Vævet /cellelysater (30-50 ug) blev opløst på 12% SDS-PAGE geler og overført til PVDF-membraner (Millipore, USA). Membraner blev blokeret med 5% skummetmælk i TBS i 2 timer. og inkuberet natten over ved 4 ° C med monoklonalt museantistof mod Mcl-1L (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Membranerne blev strippet og testet igen med kanin polyklonalt antistof mod ß-actin (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, USA) som ladningskontrol. Sekundære antistoffer blev anvendt, var peberrodsperoxidasekonjugeret IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteiner blev visualiseret med forøget kemiluminescens-kit (GE Healthcare, US). Densitometrianalyse af udviklet røntgenfilm blev udført under anvendelse ImageJ software (NIH, Bethesda, MD).

Mcl-1L knockdown

Ekspressionen af ​​Mcl-1L blev nedreguleret ved kloning Mcl-1L shRNA kassette i pTRIPZ lentiviral systemet ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems, USA). En ikke-targeting oligonukleotidsekvens blev klonet som kontrol. De virale partikler blev dannet ved co-transfektion af de rekombinante Mcl-1LshRNA-pTRIPZ konstruktioner og emballering plasmider i HEK293FT celler. Endvidere tre mundtlige kræft cellelinjer nemlig AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040 blev transduceret og den stabile selektion blev udført ved anvendelse puromycinselektion markør. Udtrykket for shRNA blev induceret af doxycyklin og skrive 72 timer. af behandlingen blev niveauerne af Mcl-1L vurderet ved QRT-PCR og western blotting. Den specifikke lyddæmpning af Mcl-1L blev bekræftet i tre uafhængige forsøg.

Cell døden ved PI farvning

PI (propidiumiodid, Santa Cruz Biotechnology, CA) farvning blev gjort til påvisning af celle død i de tre mundtlige kræft cellelinjer (AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040) efter forskellige behandlingsmetoder kombinationer. Kort beskrevet blev celler opsamlet ved trypsinering, sende forskellige behandlinger som beskrevet tidligere. Celler blev vasket med PBS og 10 pi PI blev tilsat. Cellerne blev derefter inkuberet i 2 min i mørke og analyseret ved 488 nm, på et flowcytometer (FACS kaliber, BD, USA).

MTT assay

Celler blev podet ved 2000 celler pr brønd i 96-brønds plader indeholdende DMEM med 10% FBS. Efter 24 timer blev celler enten ubehandlede eller behandlet med forskellige koncentrationer af cisplatin (0,025 til 10,0 ug /ml) (MP Biomedicals, Indien) eller Obatoclax (0, 1,0-10,0 nM) (Selleck chem USA). De 50% hæmmende koncentrationer (IC50) for cisplatin og Obatoclax blev beregnet ud fra overlevelseskurverne for alle cellelinjer. DMSO medium tjente som den respektive kontrol. Efter inkubation af celler med Obatoclax og /eller cisplatin i 72 timer blev cellevæksten vurderet ved MTT-assayet, i henhold til producentens instruktioner (Sigma, USA). Kort fortalt blev det brugte medium fjernet, og 50 gi MTT-opløsning (1 mg /ml) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C i CO

2 inkubator og formazankrystallerne i levedygtige celler blev opløst ved anvendelse af dimethylsulfoxid (DMSO, 100 ul per brønd). Pladen blev rystet på en orbitalryster i 10 minutter, og absorbansen blev målt ved 540 nm under anvendelse reference bølgelængde på 690 nm på mikro-pladelæser (Spectramax, USA). Fem brønde blev anvendt til hver lægemiddelkoncentration, og eksperimentet blev gentaget tre gange. I et andet forsøg for at vurdere, om kombination af behandlinger ville opnå højere vækstinhibering end individuel behandling blev orale cancerceller behandlet med doxycyclin at knockdown Mcl-1-ekspression eller Obatoclax (5 nM) til at inhibere Mcl-1-aktivitet, efterfulgt af cisplatin koncentration lavere end IC50-dosis. Alle forsøg blev udført in triplo

Trypan blue assay Konfokal Mikroskopi

Celler blev podet i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 per brønd. MCL-1 ekspression blev målrettet enten ved doxycyclin eller Obatoclax behandlinger eller i kombination med cisplatin som beskrevet ovenfor. Celler blev trypsinzed efter 48 timer. behandling og trypanblåt (0,4%) farvning blev udført. Antallet af levedygtige celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer og sammenlignet med ubehandlet kontrol. Dataene er vist fra tre uafhængige forsøg. Billeddannelse af celler efter forskellige behandlinger blev udført under anvendelse af et omvendt mikroskop med LSM Image Browser 4.2 software (Carl Zeiss, USA).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af en licenseret version af SPSS softwarepakke 15.0. Til statistisk korrelere udtryk for Mcl-1 isoformer med klinisk-patologiske parametre blev data dikotomiseret i to grupper nemlig: MCL-1 isoform høje expressers og lave expressers. Til sammenligning betyde ekspression af Mcl-1-isoformer i raske normaler og histologisk normale tilstødende væv blev anvendt. Sammenhængen mellem klinisk-patologiske parametre (køn, alder, site, vaner, størrelse, node, metastase, gentagelse) blev udført ved hjælp af Chi Square test (χ

2). Kaplan Meier-kurver blev anvendt til vurdering af den samlede overlevelse og forskellen i grupperne blev beregnet med log rank test af signifikans. De prædiktive parametre i univariate analyse blev indarbejdet i multivariat analyse ved hjælp af Cox ‘proportionale hazard test for at identificere de faktorer, der var uafhængige prædiktorer for overlevelse. Den Graphpad Prism5 software blev brugt til at plotte grafer og data fra to ens uens grupper blev statistisk analyseret ved Student-t-test Mann Whitney test. Variationen mellem gruppegennemsnit blev analyseret ved envejs variansanalyse (ANOVA). Dataene er rapporteret som middelværdi ± SD. Den p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Angivelse af Mcl-1 isoformer i orale cellelinjer

QRT-PCR-analyse afslørede, overvejende høj ekspression af. anti-apoptotiske Mcl-1L isoformen over svag eller målbart pro-apoptotiske MCL-1S og Mcl-1ES udtryk i alle de mundtlige cellelinjer (Figure1a). MCL-1L viste sig at være signifikant overudtrykt på både mRNA protein niveau i alle syv mundtlige kræft cellelinjer (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 og AW13516) sammenlignet med foreviget normal FBM dysplastiske DOK cellelinje (figur 1)

(a) Ekspression af Mcl-1L MCL-1S-mRNA i orale cellelinier; MCL-1 ES niveauer var målbart (* P≤0.03) (b) MCL-1L proteinekspression i orale cellelinjer.

Angivelse af MCL-1 isoformer i orale væv

QRT-PCR-analyse viste betydelig (p≤0.02) høj ekspression af Mcl-1L mRNA i 64% (84/130) af orale tumorer af forskellige subsites sammenlignet med normalt væv (figur 2a). Desuden blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem Mcl-1L ekspression fra tumorer af forskellige subsites. Den relative ekspression af Mcl-1L isoform blev -5 gange højere end MCL-1S og -10 gange højere til Mcl-1ES isoform i orale tumorer (data ikke vist). Tilsvarende viste western blot-analyse høj Mcl-1L-proteinekspression i orale tumorer versus tilgrænsende normale væv (figur 2B).

(a) Ekspression af Mcl-1L-mRNA i normale vs. orale tumorer i forskellige subsites (* P≤0.02); (B) Mcl-1L proteinekspression i tilstødende normale versus tumorer

Korrelation af Mcl-1-ekspression med klinisk-patologiske parametre Resultatet

univariat analyse viste signifikant sammenhæng med høj Mcl-1L udtryk med node positivitet (p = 0,021) og avancerede tumorer (p = 0,013). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem ekspressionen af ​​Mcl-1 isoformer og køn, alder, tobak /alkohol vaner, primære sted differentiering af orale cancerpatienter (tabel 2). Især lav ekspression af pro-apoptotiske MCL-1S isoform viste en tendens til positiv betydning med dårligt differentierede tumorer (p = 0,053).

Korrelation af Mcl-1-ekspression med samlet overlevelse

Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for lave og høje expressers af Mcl-1L viste en statistisk signifikant forskel (p = 0,002). Patienter, der udtrykker høje anti-apoptotiske Mcl-1L udviste ringe samlet overlevelse versus dem udtrykker lav Mcl-1L (figur 3a). Omvendt patienter udtrykker høje pro-apoptotiske MCL-1S udviste signifikant bedre samlet overlevelse (p = 0,051) sammenlignet med dem, der har lave MCL-1S (figur 3b). Især det relative forhold mellem Mcl-1L /MCL-1S viste også en positiv korrelation (p = 0,006) med de fattige samlet overlevelse af orale kræftpatienter (figur 3c). Derudover univariate analyse viste også fattige samlede overlevelse i node positive versus node negative orale kræftpatienter (p = 0,003). De andre parametre som alder, tobak /alkohol vaner og differentiering ikke signifikant indflydelse samlede overlevelse af disse patienter.

(ac) Kaplan-Meier-estimater for samlet overlevelse af orale kræftpatienter med lav eller høj ekspression af Mcl- 1 isoformer; (D) Multivariate analyser af orale kræftpatienter

multivariat analyse

Blandt de to isoformer (MCL-1L MCL-1S). Analyseret, theMcl-1L udtryk påvirket den samlede overlevelse af orale kræftpatienter. MCL-1L variabel, som var opstået betydelige i univariat analyse, blev undersøgt ved hjælp af Cox-regressionsmodel i den multivariate analyse (Figure3d). Patienter, der udtrykker høj Mcl-1L udviste kortere samlet overlevelse og 3,2 tidens højere risiko for ringe overlevelse i forhold til dem, der udtrykker lave Mcl-1L (p = 0,037). Dette indebærer, at Mcl-1L er en uafhængig prognostisk faktor for kræft i mundhulen

shRNA medieret nedregulering af Mcl-1L

I de tre mundtlige kræft cellelinjer (AW8507, UPCI:. SCC040 UPCI: SCC029B) transduceret med Mcl-1L shRNA-pTRIPZ lentivirale partikler, blev MCL-1L udtryk held nedreguleret indlæg doxycyclin behandling. De kontrolbrøndene repræsenterer celler uden doxycyclin behandling. Den kvantitative real time PCR og western blot analyse bekræftede nedregulering af Mcl-1L både mRNA og protein niveauer, i alle tre cancercellelinier (figur 4). Men niveauet af Mcl-1S MCL-1ES forblev uændret (data ikke vist)

(a b). ShRNA medieret nedregulering af MCL-1L mRNA protein i AW8507, UPCI: SCC040 SCCC29B cancer oral celler sammenlignet med kontrollen

Effekt af Mcl-1L knockdown . /Eller cisplatin på celledød

induktion af celledød blev analyseret ved PI farvning efterfulgt ved FACS-analyse i de tre mundtlige kræft cellelinjer (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) bogføre forskellige behandlinger, som beskrevet tidligere. The shRNA medieret knockdown af rigeligt udtrykt Mcl-1L isoform eller cisplatin behandling afslørede induktion af celledød i alle cellelinjer. Den celledød induceret i AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC29B, post Mcl-1L knockdown var 31% (SD 2.5), 27% (SD 1.5) og 24% (SD 3.5) eller post Cisplatin behandling var 50% (SD 2.1), 42% (SD 2.7), og 46% (SD 3.1) henholdsvis. Desuden shRNA medieret Mcl-1L knockdown efterfulgt af cisplatin behandling sammen viste 78% (SD, 1.2), 71% (SD 1.8) og 82% (SD 2.0) af celledød henholdsvis. De kombinerede behandlinger af Mcl-1L knockdown og Cisplatin viste en statistisk signifikant (p 0,05) forskel i induktion af celledød i forhold til enten behandlinger alene (figur 5b), hvorved der, hvilket antyder en synergistisk virkning af de kombinerede behandlinger på celledød.

Effekt af BH3 mimetiske Obatoclax og /eller cisplatin på cellernes levedygtighed og vækst

Figur 6a illustrerer repræsentative konfokal mikroskopi billeder af AW8507 celler behandlet med cisplatin og /eller Obatoclax. Interessant de kombinerede behandlinger af Obatoclax Cisplatin viste forøget celledød i forhold til individuelle behandlinger. Derudover blev trypanblåt udelukkelse farvestof assay udført for at bestemme effekten på cellelevedygtighed i orale cancer cellelinjer (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) efter forskellige behandlinger. Navnlig kunne BH3 mimetiske Obatoclax eller Cisplatin held reducere cellernes levedygtighed i alle de tre cancercellelinier. Desuden er en kombination af Obatoclax og cisplatin sammen signifikant (p 0,05) reducerede cellelevedygtighed sammenlignet med enten behandlinger alene. Den kombinerede behandling af Obatoclax Cisplatin udviste en 3-7 gange reduktion i cellelevedygtighed sammenlignet med de individuelle behandlinger (figur 6b). Desuden MTT proliferationsassay afslørede også en signifikant (p 0,05) reduktion i cellevækst (2-4 gange) efter kombineret behandling af cisplatin og Obatoclax sammenlignet med enten behandlinger alene (figur 6C), hvorved, hvilket antyder en synergistisk virkning af . kombineret behandling på cellernes levedygtighed og vækst af orale kræftceller

(a) Konfokal mikroskopiske repræsentative billeder af AW8507 celler skrive forskellige behandlinger; (B) Vurdering af procent cellelevedygtighed af orale cancerceller skrive forskellige behandlinger ved trypanblåt farvestof udelukkelse assay (* P 0,05 vs. individuelle behandlinger); (C) Analyse af proliferation af orale cancerceller efter forskellige behandlinger af MTT-assayet. (* P 0,05, vs. individuelle behandlinger).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vurderede vi udtryk for Mcl-1 isoformer (MCL-1L, MCL-1S Mcl-1ES) i orale tumorer versus normale væv, for at afgøre, om de ville være nyttige som prognostiske markører i orale kræftpatienter. Indtil videre begrænsede oplysninger om den rolle, Mcl-1 isoformer i patogenesen af ​​oral cancer. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at korrelere ekspressionen af ​​de tre Mcl-1-isoformer med klinisk-patologiske parametre af orale kræftpatienter. Vores undersøgelse viser signifikant høj ekspression af anti-apoptotiske Mcl-1L i størstedelen af ​​oral cancer cellelinjer og tumorer (64%) sammenlignet med tilsvarende normale. Vi viser også, at høj Mcl-1L udtryk var signifikant associeret med dårligt resultat af oral kræftpatienter. Endvidere målretning Mcl-1L af shRNA eller Obatoclax i kombination med cisplatin kunne synergistisk inducere celledød i orale cancerceller. Derfor kan overekspression af Mcl-1L en vigtig mekanisme bidrager til oral cancer celle overlevelse og dermed bidrage til udvikling og progression af kræft i mundhulen.

dysregulering af apoptose regulerer gener er blevet rapporteret at spille en central rolle i udviklingen og progressionen af ​​adskillige humane maligniteter. Den anti-apoptotiske Mcl-1 er et vigtigt medlem af apoptose regulering Bcl-2-familien og er blevet vist at være overudtrykt i mange forskellige cancere, herunder, cervical, ovarie-, pankreas-, hepatocellulær, ikke-småcellet lunge, testikel kim cellecancere og melanomer [8]. Især den foreliggende undersøgelse for første gang viser overekspression af Mcl-1L splejse variant i orale cancer cellelinjer flertal af orale tumorer versus normale væv. Der er kun en enkelt rapport, der analyserer Mcl-1 isoformer deres kliniske betydning hidtil clear cell renal carcinomer [31]. I modsætning til vores resultater, men denne undersøgelse viste en sammenslutning af lav Mcl-1L udtryk med aggressive fænotyper i klare celle nyrecarcinomer. Også der er ingen oplysninger om ekspression af Mcl-1 isoformer i oral cancer. I den foreliggende undersøgelse korrelationen mellem Mcl-1-isoformer og klinisk-patologiske parametre af orale kræftpatienter, som viste betydelig sammenslutning af Mcl-1L splejsningsvarianten med avanceret tumorstørrelse (p = 0,013) og lymfeknude positivitet (p = 0,021). Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af lav versus høj expressers af Mcl-1L mRNA viste, at høj Mcl-1L ekspression blev signifikant associeret med dårlig samlet overlevelse (p = 0,002). Som observeret i den foreliggende undersøgelse for Mcl-1 isoformer, har høj Mcl-1 protein-ekspression og dens association med dårlig prognose blevet demonstreret i livmoderhalsen, gastrisk, lunge- og ovariecancer [11] – [13], [32]. Imidlertid kunne en tidligere undersøgelse fra vores laboratorium ikke finde ovennævnte forening på proteinniveau MCL-1 [14]. Den foreliggende undersøgelse blev foretaget for at belyse ekspressionsprofilen af ​​Mcl-1-isoformer i orale cellelinjer og en stor gruppe af tumorer, som demonstreret sammenslutningen af ​​anti-apoptotiske Mcl-1L-ekspression med prognosen hos oral cancer. Dette er den første undersøgelse, der viser korrelationen af ​​Mcl-1L splejsningsvariant med resultatet af orale kræftpatienter og Mcl-1L som en uafhængig prognostisk markør for oral cancer.

Mcl-1 reguleres stramt på det transskriptionelle, skrive transkriptionelle og translationelle niveauer [6], og den nøjagtige mekanisme af Mcl-1 overekspression i oral cancer er ikke kendt. Den pro-apoptotiske Mcl-1S MCL-1ES isoformer blev udtrykt ved lave eller ikke-detekterbare niveauer i forhold til den overvejende udtrykte MCL-1L og korrelerede ikke med klinisk-patologiske parametre af orale kræftpatienter. Især de korte pro-apoptotiske MCL-1S kun binder til Mcl-1L muligvis neutraliserende sin anti-apoptotiske funktion [33]. Desuden kan den nyligt identificerede pro-apoptotiske Mcl-1ES isoform også binde og neutralisere det anti-apoptotiske funktion fuld længde Mcl-1L isoform, selvom det udtrykkes ved meget lave eller ikke-påviselige niveauer. Vi analyserede derfor de relative forhold mellem MCL-1L /MCL-1S isoformer, som viste en signifikant positiv sammenhæng med de fattige samlet overlevelse af patienter, hvilket indebærer, at den lave ekspression af MCL-1S MCL-1ES i oral cancer er muligvis utilstrækkelig til helt neutralisere høj ekspression af anti-apoptotiske MCL-1L isoformen. Så vidt vi ved er dette den første undersøgelse kvantificering udtryk for de tre Mcl-1 isoformer og deres korrelation med klinisk-patologiske parametre Resultatet af orale kræftpatienter. Vores resultater er også understøttet af de tidligere rapporter i gastrisk og livmoderhalskræft demonstrerer sammenhængen mellem høj Mcl-1 protein udtryk med tumorstørrelse, histologisk klasse, lymfeknude involvering, metastaser dårlig klinisk resultat [11], [34]. Desuden har den prognostiske betydning af høj Mcl-1-protein-ekspression også blevet påvist i bryst-, ovarie-, ikke-småcellet lungekræft og flere hæmatologiske maligniteter [10], [13], [35].

MCL -1 overudtrykkes i en række humane maligniteter og foreslås at være et potentielt terapeutisk mål [8]. MCL-1 overekspression synes også at være en afgørende faktor i modstanden af ​​forskellige cancertyper til konventionelle behandlinger, herunder stråling og kemoterapi. Nedreguleringen af ​​Mcl-1 har vist sig at sensibilisere neuroblastomceller for cytotoksisk kemoterapi og modstandsdygtig melanomceller til Fas-medieret apoptose [36], [37]. Desuden er der i vores nuværende undersøgelse, shRNA medieret nedregulering af Mcl-1L har vist sig at chemosensitize mundtlige kræftceller (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) til cisplatin indikerer en afgørende rolle for Mcl-1 i behandling modstand i oral cancer . Undersøgelser rettet Mcl-1 via antisense-terapi har også vist at chemosensitize levercellecancer celler

in vitro

[38], [39]. Selvom vores undersøgelse indikerer depletering af Mcl-1L ekspression fra 90% til 20% efter shRNA (fig.4a) en minimal celledød (25%) blev observeret. Dette antyder, at ud over Mcl-1 der kan være andre faktorer, der bidrager i overlevelse af celler skrive Cisplatin behandling. Flere andre undersøgelser har også rapporteret proteiner som Survivin [40], Oct4 Nanog [41], MUC4 [42], sekretær Kin17 [43] osv spiller en vigtig rolle i kemoresistens af orale skællede carcinomceller. Men dette er den første undersøgelse korrelere associering Mcl-1L splejsningsvariant med kemoresistens af oral cancer.

Nylige undersøgelser fra vores laboratorium har vist en rolle for Mcl-1L isoform i radioresistance af orale skællede carcinomceller og som en prognostisk faktor i forudsigelse af sygdomsfri overlevelse af orale kræftpatienter behandlet med endelig strålebehandling. [15], [17]. Derfor, udtømning af Mcl-1 synes at være en forudsætning for radio /kemo sensibilisere kræftceller, der overudtrykker Mcl-1 protein, for at fremme apoptose. Adskillige forsøg er blevet gjort på at målrette anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, herunder Mcl-1 i tumorer ved hjælp af forskellige inhibitorer. Blandt disse er den mest lovende inhibitor, en BH3 mimetisk ABT-737 ikke har overvinde resistens skyldes Mcl-1 overekspression. Yderligere undersøgelser viser, Mcl-1 nedregulering alene kan potensere ABT-737 letalitet i leukæmiceller [44]. I den foreliggende undersøgelse en pan Bcl-2 småmolekyle-inhibitor, Obatoclax (GX15-070), som er kendt for at antagonisere Mcl-1 og overvinde Mcl-1 medieret resistens over for apoptose blev anvendt [21]. Obatoclax har vist sig at udskille anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner og opregulere ekspression af Puma, Noxa Bim som yderligere induceret apoptose i neoplastiske mastceller [45].