PLoS ONE: melanom-associerede Kræft-Testikel Antigen 16 (CT16) Regulerer Expression af apoptotiske og antiapoptotiske Gener og Fremmer Cell Survival

Abstrakt

Kræft-testis (CT) antigener overvejende udtrykt i testiklerne eller placenta , men fraværende i de fleste voksne væv. Under malign transformation CT-gener er ofte aktiveret. CT-antigen 16 (CT16, side 5) er ofte udtrykt i fremskreden modermærkekræft, men dens biologiske funktion har været ukendt. For at undersøge, hvilken rolle CT16 i celle overlevelse vi bankede den ned i A2058 melanomaceller bruger specifikke siRNA’er og udsat cellerne til kræft narkotika cisplatin kendt for at inducere apoptose. Som et resultat blev celleoverlevelse markant nedsat. For at undersøge virkningerne af CT16 på celle overlevelse i mere detaljeret blev de cellulære genekspression profiler undersøgt efter CT16 lyddæmpning i CT16 positiv A2058 melanomaceller, samt efter CT16 overekspression i CT16 negative WM-266-4 melanom celler. Blandt de 11 gener både opreguleret af CT16 lyddæmpning og nedreguleres af CT16 overekspression eller omvendt, 4 gener var potentielt apoptotiske eller antiapoptotiske gener. CT16 blev anerkendt som en positiv regulator af antiapoptotisk metallothionein 2A og interleukin 8 gener, det hæmmede udtryk for apoptoseinducerende dickkopf 1 (DKK1) genet. Desuden forstærkede CT16 ekspressionen af ​​fedtsyrebindende protein 7, en kendt promotor af melanom progression. Virkningen af ​​CT16 på DKK1 ekspression var p53 uafhængige. Desuden har CT16 ikke regulere apoptotiske gener via DNA methylering. I tyve melanom metastase vævsprøver var gennemsnitlige DKK1 mRNA-niveau vist at være signifikant (p 0,05) lavere i høj CT16 udtrykkende tumorer (n = 3) sammenlignet med tumorer med lav CT16 ekspression (n = 17). Således er vores resultater viser, at CT16 fremmer overlevelsen af ​​melanom celler og er derfor et potentielt mål for fremtidig udvikling af lægemidler

Henvisning:. Nylund C, Rappu P, Pakula E, Heino A, Laato L, Elo LL, et al. (2012) Melanom-associeret Kræft-Testikel Antigen 16 (CT16) Regulerer Expression af apoptotiske og antiapoptotiske Gener og Fremmer Cell Survival. PLoS ONE 7 (9): e45382. doi: 10,1371 /journal.pone.0045382

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Maj 4, 2012; Accepteret: August 17, 2012; Udgivet: 21 september, 2012 |

Copyright: © Nylund et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Turku Universitetshospital EVO tilskud (projekter 13040 og 13041, https://www.tyks.fi), Southwest Funds af det finske Cancer Research Foundation (https://www.cancer.fi), Finlands Akademi (http : //www.aka.fi), den Sigrid Juselius Foundation (https://www.sigridjuselius.fi), og Kræftens Bekæmpelse Finland (https://www.cancer.fi). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cancer-testis-antigener (CTA’er) danner en heterolog gruppe af proteiner, som udtrykkes i kønsceller og trofoblaster [1]. CTdatabase Ludwig Institute for Cancer Research (https://www.cta.lncc.br/index.php) [2] indeholder mere end 140 CTA’er. Den CTA’er kan opdeles til X-kromosom-kodet (X-CTA’er) og ikke-X-kromosom-kodet CTA’er (ikke-X-CTA’er). Den mest almindelige mekanisme CTA genaktivering er promotor demethylering [1]. Gametogenese og tumorigenese har mange tilsvarende og fælles arrangementer, herunder den globale hypometylering og CTA udtryk [3]. Men det er uklart, om udtrykket af CTA’er er blot en konsekvens af demethylering begivenheder fælles i tumorigenese eller om den CTA’er har en aktiv rolle i at fremme udviklingen af ​​kræft.

Ifølge CTdatabase, mange ikke-X- CTA’er synes at have en rolle i spermatogenese og sperm funktion i normal testikel. I modsætning hertil biologiske rolle X-CTA’er er hovedsagelig ukendt. Funktionen af ​​genprodukter der kodes af to X-CTA familier, MAGE og SSX, er tidligere blevet undersøgt. MAGE-A-antigen er blevet rapporteret at interagere direkte med p53 og undertrykke dens funktion [4], [5]. Endvidere er MAGE-proteiner blevet vist at danne et kompleks med et stillads protein, KRAB-associeret protein 1 (KAP1) og til at undertrykke p53-afhængig apoptose [6]. MAGE er også blevet vist at interagere med RING E3 ubiquitin ligaser og øge ubiquitineringsaktivitet af RING domæne proteiner hen imod deres mål, såsom p53 [7]. SSX familiemedlemmer, der kan fuse med SS18, som et resultat af en specifik kromosomal translokation i human synovial sarkom [8], er blevet foreslået at virke som transkriptionelle regulatorer [9]. Gær to-hybrid-screening og glutathion-S-transferase pull-down assays har vist, at SSX2-protein binder til RAB3IP og SSX2IP proteiner [10]. På den anden side har SSX-proteiner blevet rapporteret at colocalize med medlemmerne af Polycomb gruppe kompleks [11], og i senere undersøgelser beviser for den rolle, SSX-proteiner i histon modifikation og DNA-methylering er blevet fundet [12], [13] .

CT16 (også kendt som side 5, GAGEE1, CT16.1) er en X-CTA og dets nærmeste slægtninge tilhører prostata-associeret antigen familie (PAGE-gener), som igen er relateret til Xage og GAGE genfamilier [14]. CT16 blev først rapporteret i en undersøgelse, hvor Unigene databasen blev søgt efter gen-klynger indeholder udtrykte sekvens tags udelukkende stammer fra både normale humane testis og tumor cDNA biblioteker. Ekspressionen af ​​CT16 i melanomer samt i lunge og nyre cancere blev vist på mRNA-niveauet [15]. For nylig vi rapporteret ekspressionen af ​​CT16 mRNA i 11 ud af 22 melanom hud metastase. Endvidere viste vi, at på trods af homologi til kendte prostata-associerede antigener CT16 ikke udtrykkes i primær prostatacancer [16]. Vi har også udviklet et følsomt assay til måling af CT16 direkte fra patientsera og viste, at 14 ud af 23 (61%) patienter med metastatisk melanom havde påviselige CT16 niveauer [16].

Den biologiske rolle af CT16 har været ukendt , men der er nogle rapporter om de formodede funktioner af CT16 homologer. One GAGE-familiemedlem har 30% identitet med CT16 er blevet rapporteret at inhibere apoptose og at interagere med nucleophosmin /B23 og interferon regulatorisk faktor 1 [17]. Tilsvarende er det for nylig blevet vist, at prostatakræft associeret antigen 4 (Side4), som har 43% identitet med CT16, er et anti-apoptotisk protein [18]. I den samme undersøgelse, forfatterne også rapporteret, at Side4 er i sig selv en uordnet protein (IDP), som binder til GC-rige sekvenser dobbeltstrenget DNA [18]. NMR-analyse af CT16 har også tilkendegivet, at det er en IDP [19]. Faktisk sekvensanalysen med IUPred algoritme (https://iupred.enzim.hu) [20] forudsiger, at alle proteiner relateret til CT16 er uløseligt uordnede. IDP er proteiner, der ikke danner en stiv 3-D struktur i fysiologiske betingelser [21]. Desuden en nylig

i silico

analyse tyder på, at de fleste CTA’er er internt fordrevne [22]. Ca. 25% af de mammale proteiner forudsiges at være IDP, og omkring 75% af de mammale signalsystemer proteiner forudsiges at have lange uordnede områder [23]. Det er blevet foreslået, at IDP ofte have flere funktioner, en egenskab betegnes som sort arbejde [24]. Således kan også CT16 og CT16-relaterede CTA’er har forskellige funktioner afhængig af biologiske kontekst og cellulære lokalisering.

I dette papir har vi undersøgt den rolle, CT16 i melanom. Vi viser, at lukke munden af ​​CT16 med siRNA’er forbedrer cisplatin-induceret celledød. Transkriptom analyse udnytte CT16 overekspression og knockdown afslørede, at CT16 negativt regulerer, formentlig indirekte udtryk for en antiapoptotisk protein DKK1. Vi viser, at denne forordning er p53 uafhængig og CT16 har ingen indflydelse på methylering af overlevelse regulere gener. Vi foreslår også, at menneskelige melanom hud metastase prøver med højt CT16 mRNA-niveau kan have mindre DKK1 mRNA end dem med lav CT16 mRNA-niveau.

Resultater

CT16 udtrykkes i melanom metastase og melanom cellelinjer på proteinniveau

Vi har tidligere rapporteret produktion af specifikt polyklonalt antistof mod human rekombinant CT16 [16]. Her blev antistoffet anvendes til at verificere CT16 ekspression på proteinniveauet i melanom hud metastase. De frosne vævsprøver blev undersøgt under anvendelse af immunhistokemi. CT16 udtryk var kun synlig i melanom metastase væv, udtrykte CT16 mRNA (figur 1A, B). Desuden er mængden af ​​CT16-specifik farvning korrelerede godt med mRNA-niveauer (figur S1). De primære prostatakræft prøver anvendt som negative kontroller viste ingen farvning for CT16 (figur 1C). En testis prøve blev anvendt som en positiv kontrol og CT16 blev placeret i den basale kammer af spermatogene epitel, hovedsagelig i spermatogonier (figur 1D). I melanom metastase prøver syntes CT16 at være hovedsagelig cytoplasmatisk, men i nogle celler kerner blev også positivt farvet (figur 1A).

CT16 blev påvist i vævsprøver med CT16-specifikt antistof visualiseret ved Vectastain ABC kit og diaminobenzidin, og blev snittene modfarvet med hematoxylin. (A, B) Melanom hud metastase prøver fra to patienter. (C) Primære prostatacancer (negativ kontrol). (D) Testis prøve (positiv kontrol). Både cytoplasmatiske og nukleare CT16-specifik farvning kan ses i det forstørrede område (indsat) af melanom hud metastase prøve. I testiklerne prøve forstørrelsen viser CT16-specifik farvning af spermatogonier. Skalaen bar i testiklerne billedet repræsenterer forstørrelsen som 150 um for alle billeder.

Den intracellulære placering af CT16 blev undersøgt yderligere i SK-MEL-2 melanomaceller samt i WM, 266- 4 melanomceller stabilt transficeret med CT16 cDNA-indeholdende eller intakte (kontrol cDNA) indeholdende ekspressionsvektoren. The CT16 ekspression af CT16 transficerede celler var blevet kontrolleret både på mRNA og proteinniveauet (Fig S2). Immunofluorescens assay under anvendelse af CT16-antistof (figur 2A) bekræftede specificiteten af ​​antistoffet, eftersom CT16 negative WM-266-4-celler transficeret med kontrol plasmid viste nogle baggrundsfluorescens kun (figur 2A). I CT16-positive celler CT16 synes at lokalisere både i kernen (ekskl nucleoli) og cytoplasma. For at bekræfte lokaliseringen i kernen, blev SK-MEL-2 kerneekstrakt fremstillet og analyseret ved Western blotting. CT16 blev fundet både i den nukleare og cytosoliske fraktion, mens en cytosolisk kontrol protein MEK1 /2 var kun til stede i cytosol fraktion (figur 2B).

(A) Billeder af angivne humane melanom cellelinjer mærket med kanin polyklonalt antistof mod human cancer testis antigen protein CT16 efterfulgt af sekundært antistof Alexa Fluor 488 ged anti-kanin IgG (H 0,001 (ANOVA, Tukeys HSD)

CT16 fremmer melanom celleoverlevelse

For at teste yderligere biologiske rolle CT16 vi udsat melanomceller til en apoptoseinducerende cancer drug, cisplatin. A2058 celler blev først behandlet enten med CT16 specifikke siRNA’er eller kontrol siRNA i 48 timer, og efter tilsætning af cisplatin cellekulturerne blev overvåget i 30 timer i 10-minutters intervaller ved hjælp xCELLigence teknologi. I denne teknologi, dyrkes cellerne på en overflade, der indeholder integrerede mikro-elektroder, og den elektriske impedans mellem elektroderne forårsaget af cellerne måles. Den relative ændring i målte elektriske impedans udtrykkes som Cell Index (CI). Både celle nummer og morfologi påvirker CI, og celle løsrivelse og død ses som et fald i CI.

Cisplatin faldt CI af CT16 siRNA behandlede celler markant flere end for kontrol siRNA behandlede celler (figur 3D, E ). Forskellen var mest tydeligt, når anvendtes cisplatin koncentration på 50 uM. I modsætning hertil CT16 havde ingen effekt på overlevelsen i nærvær af staurosporin (fra 0 til 600 nm) (ikke vist). Det fremgår således, at CT16 inhiberer cisplatin inducerede men ikke staurosporin-induceret død A2058 melanomceller.

I nærværelse af cisplatin CT16 siRNAs kunne øge aktiveringen af ​​caspase-3, som vist ved Western blotting med antistoffer, der specifikt genkender spaltet caspase-3 (figur 3C). Således kunne CT16 beskytte melanom celler fra apoptose.

CT16 regulerer overlevelse-associerede gener

For yderligere at undersøge den rolle, CT16 i celle overlevelse, blev gennemført to transkriptom profilering eksperimenter. I det første eksperiment blev CT16 positive A2058 melanomaceller behandlet med CT16 specifik siRNA og derefter sammenlignet med A2058 celler behandlet med kontrol siRNA. I det andet forsøg, stabilt styre cDNA transficerede WM-266-4 melanomceller blev sammenlignet med stabilt CT16 cDNA transficerede celler. De microarray data er blevet deponeret, ifølge MIAME retningslinjer, i NCBI s Gene Expression Omnibus [25], tiltrædelse nummer GSE31352 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE31352 ). Nummer produkt algoritme blev anvendt til at vælge differentielt udtrykte gener [26]. Algoritmen registrerer gener, der konsekvent findes blandt de mest op- eller nedreguleret gener på tværs af replikater. Anvendelsen af ​​rækker i stedet for ekspressionsvektorer værdier forøger robustheden mod støj. Generne med rang produkt falsk opdagelse sats (FDR) 0,05 blev forelagt gen ontologi analyse af GoTermMapper værktøj, der kortlægger gener til udvalgte cellulære komponent og biologiske proces gen ontologi kategorier (GO Slims). Den samlede fordeling af cellulær komponent eller biologisk proces af de differentielt udtrykte gener fandtes at være ens i både CT16 overekspression og Knockdown eksperimenter (figur 4). For at identificere de biologiske processer de differentielt udtrykte gener kan deltage i, blev en funktionel annotation analyse foretaget ved hjælp af DAVID værktøj. Kun vilkår med Benjamini-Hochberg FDR 0,05 blev inkluderet i resultaterne. Generne, der blev opreguleres af CT16 overekspression blev væsentligt beriget i de biologiske processer, der fremmer overlevelse eller er relateret til inflammation, kemisk homeostase samt reaktion på stimuli og sårede (tabel 1). Generne, der blev nedreguleret ved CT16 overekspression blev væsentligt udelukkende overrepræsenteret i antigenet forarbejdning og præsentation af peptid eller polysaccharidantigen via MHC II proces klasse (tabel 1). Analyse af differentielt udtrykte gener i CT16 knockdown eksperiment afslørede ingen biologiske processer med Benjamini-Hochberg FDR 0,05 (ikke vist)

De differentielt udtrykte gener fra CT16 Knockdown og overekspression eksperimenter blev analyseret separat.. Antallet af gener forsynet med noter bestemt kategori er i parentes. Kortlægningen at GO slank ontologi blev gjort med GoTermMapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper).

For at begrænse antallet af gener, der skal undersøges, vi har valgt kun de gener, der er blevet nedreguleret af CT16 specifikke siRNA og opreguleres på grund af CT16 overekspression eller

omvendt

(rang produkt FDR 0,1 i begge forsøg). Af de i alt 11 gener, der opfylder disse kriterier, har fem tidligere blevet rapporteret at være involveret i cancer progression (tabel 2). Baseret på disse eksperimenter CT16 blev anerkendt som en positiv regulator af antiapoptotisk metallothionein 2A (MT2A) og interleukin 8 (IL8) gener, det hæmmede udtryk for apoptoseinducerende dickkopf 1 (DKK1) genet. Desuden CT16 forøgede ekspression af fedtsyrebindende protein 7 (FABP7), en kendt promotor af melanom progression. Den differentierede regulering af FABP7, MT2A og DKK1 generne blev bekræftet af real-time QRT-PCR-analyse af CT16 overekspression WM-266-4-celler (figur 5A, figur S4).

(A) Verifikation af differentieret DKK1 mRNA-ekspression i (WM-266-4-celler transficeret med kontrol cDNA eller CT16-cDNA. ved QRT-PCR. (B) Differential DKK1 mRNA-ekspression var også reproducerbar i A2058 celler behandlet med angivne siRNA’er i 48 timer. (C) Western blot for DKK1 i dyrkningsmedium af A2058 celler behandlet med angivne siRNA’er i 48 timer. (D) DKK1 nedreguleres i melanom prøver med høj CT16 ekspression. CT16 og DKK1 mRNA niveauer af melanom hud metastase vævsprøver blev påvist ved QRT-PCR.

s Drømmeholdet værdi blev opnået ved at teste forskellen i DKK1 mRNA-niveau mellem melanom prøver med højt CT16 mRNA-niveau ( 22% af β-actin mRNA) og dem med lav CT16 mRNA-niveau ( 7% af β actin mRNA) af Tukey-Kramer test.

for at teste kriterierne i generne udvælgelseskriterier i tabel 2, vi brugte real-time QRT-PCR til at analysere tre gener, CTSL, DDAH1 og BIRC5 der blev nedreguleret af CT16 specifikke siRNA og opreguleret grund CT16 overekspression eller

omvendt

men havde rang produkt FDR 0,1. I disse målinger ikke kunne bekræftes virkningen af ​​CT16 på ekspression (figur S4). Således valgte rang produkt FDR tærskelværdi effektivt filtreres falske positiver, og samtidig bevare de sande dem.

CT16 er en negativ regulator af DKK1 i melanom

Det ekstracellulære Wnt antagonisten DKK1 blev valgt til yderligere undersøgelser, da det tidligere er blevet vist at aktivere apoptose og til at blive nedreguleret i melanom og andre cancere [27], [28]. To uafhængige CT16 siRNA’er steg DKK1 mRNA-niveauer i A2058-celler (figur 5B). Virkningen af ​​CT16 på DKK1 ekspression blev også bekræftet på proteinniveau i celledyrkningsmedium af A2058 celler ved Western blots. Knockdown af CT16 specifikke siRNA resulterede i en stigning i ophobning af DKK1 protein i mediet (figur 5C).

For at finde beviser for, at CT16 regulerer også DKK1 ekspressionsniveauerne i tumorer, 20 melanom hud metastase prøver blev analyseret af real-time QRT-PCR. The CT16-mRNA niveau i forhold til p-actin var under 7% i 17 prøver, som blev grupperet så lave CT16 melanom prøver. CT16 mRNA-niveauet var over 22% af β-actin i tre prøver, som blev grupperet som høje CT16 melanom prøver. Interessant, de høje CT16 prøverne havde væsentligt (p 0,05, Tukey-Kramer test) lavere gennemsnitlig DKK1 mRNA-niveau sammenlignet med den for lave CT16 prøver (figur 5D), hvilket antyder, at højt CT16 niveau kan være en grund til tidligere beskrevne nedregulering af DKK1 udtryk i melanom.

CT16 regulerer sit mål gener i en p53 og DNA methylering uafhængig måde

De molekylære interaktioner mellem X-CTA’er kendes kun i få tilfælde. Da MAGE-proteiner er kendt for at påvirke p53 funktioner (Yang et al., 2007), ønskede vi at undersøge virkningerne i forskellige CT16-positive cellelinier. Ingen ændring i p53-protein-ekspression blev detekteret ved immunoblotting i CT16 siRNA Knockdown SK-MEL-2-celler sammenlignet med kontrol siRNA behandlede celler (fig S5A). Lignende resultat blev også modtaget mellem CT16 og kontrol cDNA transfekterede WM-266-4-celler (Figur S5B). Vi testede også virkningerne af CT16 i human osteosarcom Saos-2-celler, som vides at have nogen p53-ekspression. Den negative ekspression af p53 i Saos-2-celler blev bekræftet med QRT-PCR (ikke vist). Resultatet viste, på samme måde som i A2058-celler, en klar opregulering af DKK1 efter CT16 knockdown, hvilket indikerer, at p53 ikke er involveret i processen (figur S5C). Hverken havde CT16 nogen effekt på konformationsændring af p53 i den rå ekstrakt af WM-266-4-celler (Figur S5D). Desuden var der ingen forskel i p53 stabilitet mellem CT16 siRNA behandlet A2058 celler og kontrol- celler efter hæmning af proteinsyntesen med CHX Figur S5E). I overensstemmelse med dette blev ingen signifikant berigelse af p53 målgener blandt differentielt udtrykte gener fundet (ikke vist). Tilsammen understøtter disse resultater den ide, at p53 ikke medierer virkningerne af CT16 eller deltage i apoptose.

Nogle X-CTA’er påvirker også gen methylering og post-translationelle modifikationer i histoner. For at undersøge dette blev en genom-dækkende promotor-specifik chromatin immunoprecipitation analyse for WM-266-4-celler stabilt transficeret med CT16 eller kontrol cDNA udført under anvendelse af DNA-methylering specifik og acetyleret histon H3 specifikke antistoffer og et mikroarray der omfatter 30.000 humane promotorer. De sample-specifikke gener, der er defineret som dem med toppe (registreres og evalueres af NimbleScan software), der har FDR 0,05 i prøven og FDR≥0.2 i kontrollen eller omvendt, blev analyseret ved hjælp af DAVID. Der var ingen signifikant beriget gener i helst gen ontologi kategorier blandt prøvespecifikke gener (ikke vist). Vi sammenlignede også listerne over varierende regulerede gener i WM-266-4 afledte cellelinier med prøven-specifikke gen-lister fra både methylering specifik og histonacetylering specifik immunpræcipitation analyser (tabel S1). Resultaterne viser, at der er en sammenhæng mellem histon H3 acetylering og genekspression af CT16 regulerede gener. Men det er uklart, om CT16 er involveret i histonacetylering begivenheder eller resultatet afspejler blot den velkendte sammenhæng mellem histon H3 acetylering og genekspression. I modsætning til histon H3 acetylering, viste DNA-methylering ingen korrelation med CT16 regulerede gener tyder på, at ændringer i genekspression profil ved CT16 ikke medieres af DNA-methylering.

For nylig er det blevet vist, at klasse I-MAGE-proteiner regulere KAP1 og KRAB-domænet zinkfinger-transkriptionsfaktor-medieret genrepression via interaktion med KAP1 [34]. Det er imidlertid ikke sandsynligt, at også CT16 ville interagere med KAP1, eftersom KAP1 mål identificeret i et genom-dækkende chromatin immunoprecipitation analyse af KAP1 bindende [35] blev ikke beriget blandt differentielt udtrykte gener fra enten CT16 knockdown eller overekspression eksperimenter ( ikke vist).

Vi har tidligere afviste, at CT16 direkte kunne binde til GC-rige sekvenser i dobbeltstrenget DNA [19] på en lignende måde som dens paralog Side4 [18]. Her kunne vi ikke vise lokalisering af CT16 til de umiddelbare initiativtagere til sit mål gener (Figur S6). Således mekanismen for CT16 indsats, ligesom funktionen af ​​de fleste andre X-CTA’er, forbliver ukendt.

Discussion

Den effektive behandling af metastatisk melanom er et stort uløst problem. Derfor er der et presserende behov for at få nye oplysninger om molekylære mekanismer, der regulerer overlevelse og resistens i melanom. Nylige resultater fra kliniske forsøg har genereret optimisme, i den nærmeste fremtid nye specifikke lægemidler, såsom Ipilimumab [36] og BRAF inhibitorer [37], kunne bruges til at stoppe progressionen af ​​en fremskreden sygdom. Men mange melanomer synes også at udvikle resistens mod de nye lægemiddelmolekyler hurtigt, undertiden i måneder [38].

Vi har for nylig rapporteret, at ekspressionen af ​​CT16 ofte induceres i humant melanom. Endvidere kan serum CT16 måles og anvendes til at følge sygdomsprogression [16]. Her viser vi, at CT16 beskytter melanomceller mod cisplatin (50 uM) inducerede celledød. Platinkomplekser binde til og tværbinder DNA, som fører til apoptose. Interessant, CT16 kunne ikke forhindre staurosporin-induceret celledød. Staurosporin er et alkaloid, som inhiberer et bredt spektrum af proteinkinaser [39], og kan således aktivere apoptose ved flere forskellige mekanismer [40]. De cellulære funktioner fleste CTA’er er ukendte, men udover CT16 også visse andre X-CTA’er har været knyttet til celleoverlevelse. Transfektion af ovariecancerceller af MAGE-A2 og MAGE-A6 kan inducere paclitaxel og doxorubicin resistens ved en ukendt mekanisme [41]. Desuden har GAGE-7 blevet beskrevet at virke som et anti-apoptotisk protein i HeLa-celler [17], [42]. Senest har en prostata cancer-associeret antigen, Side4, blev rapporteret at inhibere stressinduceret celledød [18].

Baseret på vores genom bred genekspression analyse kan CT16 negativt regulere specifikke biologiske processer, såsom apoptose og antigenpræsentation at forbedre overlevelsen af ​​cancercelle. Mekanismen for CT16 indsats synes at være i det mindste delvist relateret til det faktum, at det kan regulere ekspressionen af ​​apoptotiske og antiapoptotiske gener, såsom metallothionein 2A, IL-8 og DKK1. Disse tre gener var blandt de elleve gener, der viste sig at være reguleret af CT16 både i CT16 lyddæmpnings- og overekspression eksperimenter. Metallothionein 2A er kendt for at beskytte HeLa-celler mod ROS-induceret død [30], hvorimod IL-8 inhiberer trail og lægemiddelinduceret apoptose af prostatacancerceller [33] og øger tumorigenicitet og metastatiske potentiale melanomceller [32]. Mest interessant, CT16 viste sig at være en negativ regulator af DKK1, beskrevet et gen, der skal betydeligt nedreguleret i malignt melanom [43]. DKK1 er et ekstracellulært inhibitor af anti-apoptotiske Wnt-signalering pathway [44], der kan inducere apoptose i melanomceller [27]. Derfor er fald i DKK1 ekspression anses for at være en vigtig overlevelse mekanisme i melanomceller. Når vi analyserede 20 melanom hud metastaser i deres DKK1 og CT16 mRNA-ekspression, viste tre prøver usædvanligt høje CT16 niveauer og samtidig meget lavt DKK1 udtryk. Således er vores data antyder, at CT16 overekspression er en, men sandsynligvis ikke den eneste mekanisme, der fører til DKK1 undertrykkelse i melanom. CT16 øger også ekspressionen af ​​fedtsyrebindende protein 7 (FABP7), en kendt promotor af melanom progression [29].

Den nøjagtige mekanisme for, hvordan CT16 regulerer ekspressionen af ​​disse gener er endnu ikke undersøgt. Side4, en paralog af CT16, blev for nylig vist at binde direkte til DNA [18]. Desuden både CT16 og Side4 er uløseligt uordnede proteiner [18], [19], [45]. Men CT16 binding til DNA er ikke observeret [19]. På trods homologien mellem Side4 og CT16 virkningsmekanismen kan være markant forskellige mellem disse to proteiner. Desuden har vi udelukket de to andre kendte mekanismer CTA-X handling. Vores data indikerer, at p53 ikke medierer virkningerne af CT16 trods af, at MAGE-proteiner virker på denne måde. Hverken kunne vi opdage nogen forbindelse mellem DNA methylering og CT16 regulerede gener.

For at konkludere, har de seneste fremskridt i udviklingen af ​​medicinsk behandling mod fremskreden modermærkekræft medført presserende behov for at udvikle nye biomarkør for sygdomsprogression. Vi har for nylig foreslået, at serum CT16-niveauerne kunne anvendes til overvågning af effektiviteten af ​​behandlingen og formodede tilbagefald. Her rapporterer vi, at CT16 også bidrager til patogenesen af ​​sygdommen ved at regulere både apoptotisk og antiapoptotiske gener og fremme melanom celleoverlevelse. Derfor CT16 er en formodet målmolekyle for lægemiddeludvikling til formål at forstærke virkningen af ​​apoptose inducerende lægemidler.

Materialer og metoder

Etik erklæring

De kliniske studier blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Turku Universitetshospital, og hver patient forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage i forsøg, og /eller for at tillade hans /hendes vævsprøver, der skal bruges til forskningsformål.

cellelinjer og transfektioner

De melanom cellelinjer A2058, SK-MEL-2, og WM-266-4 oprindeligt fås fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) blev bekræftet af Health Protection Agency Culture Samlinger (Porton Down, UK) ved hjælp STR analysemetode. Melanom cellelinier blev holdt ved 5% CO

2 og 37 ° C i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Den CT16 cDNA inklusive stopkodonet blev klonet ved PCR fra ekspressionsvektoren for CT16 [16] og indsættes i

Xba

I og

Eco

RI steder af pEXPR-IBA103 plasmidet (IBA GmbH, Göttingen, Tyskland). En mængde på 1 ug af CT16-cDNA-indeholdende eller intakte (kontrol cDNA) pEXPR-IBA103 vektor blev transficeret i WM-266-4-celler under anvendelse af Fugene 6 transfektionsreagens (Roche, Basel, Schweiz) ifølge producentens instruktioner. Efter inkubation i 48 timer blev G418-resistente celler udvalgt med 0,8 mg /ml G418 (Invitrogen). De stabilt transficerede celler blev holdt i medium indeholdende 0,2 mg /ml G418.