PLoS ONE: Målretning Hypoxi i cancerceller ved Gendannelse homeodomæne interagerende protein-kinase 2 og p53 aktivitet og Undertrykkelse HIF-1α

Abstrakt

Baggrund

tumor suppressor homeodomænet-interagerende protein kinase-2 (HIPK2) ved phosphorylering serin 46 (Ser46) er en afgørende regulator af p53 apoptotiske funktion. HIPK2 er også en transkriptionel co-repressor af hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α) fastholdende tumorangiogenese og kemoresistens. HIPK2 kan dereguleret i tumorer af flere mekanismer, herunder hypoxi. Her har vi forsøgt at målrette hypoxi ved at genoprette HIPK2 funktion og undertrykke HIF-1α, med henblik på at dokumentere for inddragelse af både HIPK2 og p53 i modvirke hypoxi-induceret kemoresistens.

Metode /vigtigste resultater

ved eksponering af colon- og lunge cancerceller for hypoxi ved enten lav oxygen eller cobalt, blev HIPK2 funktion svækkede giver mulighed for øget HIF-1α ekspression og inhibere p53-apoptotiske respons på lægemidlet. Cobalt undertrykt HIPK2 rekruttering på HIF-1α-promotoren. Hypoxi induceret ekspression af p53 target MDM2 der nedregulerer HIPK2, således MDM2 inhibering med siRNA genoprettede HIPK2 /p53Ser46 respons på lægemidlet. Zinktilskud for hypoxi-behandlede celler forøget HIPK2 proteinstabilitet og kerneakkumulation, hvilket fører til genoprettelse af HIPK2 binding til HIF-1α promotor, undertrykkelse af MDR1, Bcl2, og VEGF-gener, og aktivering af p53 apoptotiske respons på lægemidlet. Kombination af zink og ADR stærkt undertrykte tumorvækst

in vivo

ved at hæmme HIF-1-vejen og opregulering p53 apoptotiske målgener.

Konklusioner /Betydning

Vi viser her til første gang, at hypoxi-induceret HIPK2 deregulering blev modvirket af zink, der restaurerede HIPK2 undertrykkelse af HIF-1-vejen og genaktiveret p53 apoptotisk reaktion på medicin, hvilket understreger den potentielle anvendelse af zinktilskud i kombination med kemoterapi for at løse hypoxi og forbedre tumor behandling.

Henvisning: Nardinocchi L, Puca R, Sacchi A, Rechavi G, Givol D, D’Orazi G (2009) Målretning Hypoxi i cancerceller ved Gendannelse homeodomæne interagerende protein-kinase 2 og p53 aktivitet og Undertrykkelse HIF-1α. PLoS ONE 4 (8): e6819. doi: 10,1371 /journal.pone.0006819

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 2, 2009; Accepteret: August 3, 2009; Udgivet: 28 August, 2009

Copyright: © 2009 Nardinocchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Grant fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (GDO) og kabinepersonalet Medical Research Institute (FAMRI) (GR); RP er blevet støttet af en Fellowship fra den italienske Foundation for Cancer Research (Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro -FIRC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Solide tumorer kan overleve hypoxisk tilstand (den høje celle tæthed af en tumor begrænser tilgængeligheden af ​​ilt. til celler) ved hjælp beskyttende mekanismer, herunder aktivering af hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α) en transkriptionsfaktor, der inducerer blandt andet antiapoptotisk Bcl2, multilægemiddelresistens (MDR), VEGF-genekspression, og omprogrammering af glucosemetabolisme, som hensyn til celleproliferation, angiogenese, og kemoresistens [1]. Desuden hypoxi dæmper respons oncosuppressor p53 til cellulær beskadigelse [2]. den p53-proteinet spiller en vigtig rolle i vækststandsning, cellulær reparation og celledød, hvilket minimerer formering af maligne celler [3]. Funktionen af ​​p53 som en tumorsuppressor er forbundet med dens aktivitet som en transkriptionsfaktor ved posttranslationelle modifikationer, der tillader proteinet at undslippe MDM2 kontrol, akkumuleres, og bliver aktive [4]. P53-genet er muteret i -50% af human cancer henviser til, i kræft huser vildtype (wtp53), kan dets aktivitet blive kompromitteret af andre mekanismer, herunder deregulering af regulatoriske proteiner [5], [6].

homeodomæne-interagerende protein kinase-2 (HIPK2) er en vigtig regulator af p53 apoptotiske funktion, således vi har tidligere vist, at HIPK2 phosphorylerer p53 i serin 46 (Ser46) efter alvorlig DNA-skade, inducere p53 specifik apoptotisk transkriptionel aktivitet [7] – [9]. Phosphorylering på dette site er en sen begivenhed efter alvorlig DNA-skader og specifikt regulerer p53-induceret apoptose gennem f.eks opregulering af p53AIP1 gen i stedet for celle-cyklus anholdt relaterede gen og MDM2 genekspression [10], [11]. En større auto-regulerende, negativ feed-back loop af p53 involverer p53-afhængig MDM2 induktion, som igen binder og inaktiverer p53 ved at køre det til proteasomalaktivitet nedbrydning [12] – [14]. I denne forbindelse har vi vist, at HIPK2 neutraliserer MDM2 inhibition redning p53 transkriptionel aktivitet og apoptotiske funktion [15]. Derfor midler, såsom HIPK2 der kan øge den aktive p53 i tumorceller efter hindre MDM2-p53 interaktion kan have terapeutisk anvendelighed i tumorceller følsomme kemo- eller radioterapi.

HIPK2 er også en transkriptionel co- repressoren ofte i multiproteinkompleks med andre co-repressorer såsom Groucho og hystone deacetylase 1 (HDAC1) [16]. Vi har for nylig fundet, at HIPK2 co-undertrykker hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α) transskriptionsfaktoren fastholdende HIF-1-induceret tumor angiogenese og kemoresistens [17]. Inhibering af HIF-1α aktivitet ved HIPK2 reducerer VEGF, MDR1, og Bcl2 ekspression og stimulerer lægemiddel-induceret apoptose i p53-afhængige og uafhængige måder [18]. På grund af sin centrale rolle i målretningen af ​​celler mod apoptose på genotoksisk stress, har reguleringen af ​​HIPK2 været genstand for intens undersøgelse i de seneste år. HIPK2 blev fundet downmodulated i skjoldbruskkirtlen, bryst [19] og tyktarmskræft [20] i sammenligning med de respektive normale væv; muteret i speckle retention signal i humane akutte myeloblastisk leukæmier og myelodysplastisk syndrom [21]; og delokaliseret i cytoplasmaet ved høj mobilitet gruppe A1 (HMGA1) overekspression [22]. HIPK2 er en ustabil protein, som nedbrydes via proteasomforløb navnlig nylige undersøgelser viste, at HIPK2 kan downmodulated af p53-induceret MDM2 [23] og ved hypoxi-induceret Siah2 proteiner [24]. Vi har for nylig vist, at HIPK2 knockdown inducerer p53 misfoldning der kan fortrydes med zinktilskud [25], [26]. Derfor vil alle de betingelser, der fører til HIPK2 deregulering ende i en multifaktoriel reaktion fører til tumor kemoresistens ved kraftigt at påvirke p53 transkriptionel aktivitet og apoptose på den ene side og HIF-1-aktivitet på den anden side. Derfor kan en forståelse af, hvordan nedreguleret HIPK2 kunne genaktiveres føre til nye strategier til både begrænse HIF-1-vejen og genetablere p53 aktivitet for at overvinde resistens. Dette er også i tråd med nyere værker, der har vist, at behandling af cancer ved antiangiogene midler kan resultere i hypoxi, der vælger for radio og resistens, hvilket understreger behovet for at behandle tumor hypoxi i kræft [27].

zink er et vigtigt cofaktor for DNA-bindende aktivitet af p53, som nogle p53 mutationer, der forstyrrer den zink-bindingssted i p53 resulterer i tab af DNA-binding [28]. Zink er et sporstof, der er afgørende for den normale funktion af celler og er en cofaktor for strukturen og funktionen af ​​en lang række cellulære proteiner, herunder enzymer, transkriptionsfaktorer og strukturelle proteiner [29]. zink er således en væsentlig forudsætning for udviklingen af ​​mange signaleringsprocesser i eukaryoter og deregulering af dets metabolisme kan inducere DNA-skade og kræft risiko [30]. Behandling med zink viste sig at have en reel klinik potentiale, reducerer tumorvækst og aggressivitet med begrænset biotoksicitet, for eksempel i prostatacancer [31].

Formålet med vores undersøgelse var at vurdere, om hypoxi kunne deregulere HIPK2- induceret p53 afhængig apoptotisk transkriptionel aktivitet som reaktion på narkotika og dermed bidrage til kemoresistens og om zink kunne modvirke denne HIPK2 /p53Ser46 hæmning. Vi fandt, at eksponering af tumorceller for hypoxi ved enten lav oxygen eller cobalt, inhiberede p53Ser46 phosphorylering og p53 apoptotisk transkriptionel aktivitet som respons på lægemidlet. Denne inhibering var en følge af HIPK2 nedregulering skyldes i det mindste delvis, på hypoxi-induceret MDM2 opregulering. På den anden side, cobalt inhiberede HIPK2 rekruttering på HIF-1α-promotoren. Især zinktilskud for hypoxi-behandlede celler modvirket inhiberingen af ​​HIPK2 tillader dets kerneakkumulation som korrelerede med HIF-1α nedmodulering og undertrykkelse af HIF-1-vejen og med restaurering af p53Ser46 apoptotisk transkriptionel aktivitet som respons på lægemidlet. Alt i alt viser disse resultater, at hypoxi-tilstand kan påvirke HIPK2 /p53Ser46 pathway, navnlig viser vi her for første gang, at zink kan neutralisere hypoxi-induceret HIPK2 inhibering. Da tumorer indeholder områder med hypoxiske forhold, hvor wtp53 er inaktiv, disse resultater understøtter den potentielle anvendelse af zinktilskud til kemoterapi i behandlingen af ​​tumorer med ikke fungerende wtp53 eller HIPK2.

Resultater

Cell udsættelse for kobolt ophæver p53 apoptotiske-gentranskription og reducerer HIPK2 rekruttering på HIF-1α promotor

Vi spurgte, om cobaltchlorid (CoCl

2), der stabiliserer HIF-1α og inducerer HIF-1 responsive gener med kinetik svarende til den i hypoxi [32], kan påvirke lægemiddelinduceret p53 apoptotisk gentranskription. Som vist i figur 1A, cobalt kraftigt afskaffede ADR-induceret PARP-spaltning og Ser46 phosphorylering. Cobalt alene inducerede p53 niveauer, selvom det hverken fremkalde Ser46 fosforylering eller PARP spaltning (figur 1A). P53 apoptotiske transkriptionel aktivitet blev evalueret ved luciferase assay. Som vist i figur 1B, blev ADR-induceret p53AIP1-luc aktivitet væsentligt svækket af cobalt, mens cobalt alene påvirkede ikke det, og

in vivo

analyse af mRNA-niveauer viste, at lægemiddelinduceret opregulering af p53 apoptotisk målgener

Bax

Puma

var stærkt svækket af cobalt (figur 1C), som vist også af udtrykket forholdet til GAPDH. Omvendt havde vi tidligere vist, at kobolt kan fremkalde

MDR1

, og

Bcl2

genekspression [18].

(A) RKO celler blev behandlet med CoCl

2 og ADR i 16 timer, alene eller i kombination. Tilsvarende mængde af totale celleekstrakter blev analyseret ved Western immunblotting med specifikke antistoffer detekterer Ser46 phosphorylering og PARP-spaltning (pile: uspaltede og spaltede former); samlede p53 er også vist. Anti-tubulin blev anvendt som protein loading kontrol. (B) RKO-celler, stabilt transficeret med p53AIP1-luc reporter, blev behandlet med CoCl

2 og ADR i 16 timer før luciferaseaktivitet blev analyseret. RLU: relative luciferase enhed.

Kolonner

, betyder af tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer;

barer

, S.D. *

P

0,01. (C) I alt mRNA blev revers transkriberet fra RKO celler behandlet med CoCl

2 og ADR alene eller i kombination, i 16 timer til PCR-analyser af p53 målgener

Bax

Puma

. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. Expression forhold til GAPDH blev evalueret ved densitometrisk analyse af genekspression. *

P

. 0,01

Som hypoxi tilstand fremmer i hvert fald delvis HIPK2 proteinnedbrydning [24] vi spurgt, om kobolt var i stand til på samme måde påvirke HIPK2 udtryk og aktivitet. Til dette formål blev HIPK2 proteinniveauer undersøgt i RKO og A549-celler behandlet med CoCl

2 i nærvær eller fravær af proteasominhibitor MG132. Som vist i figur 2A, cobalt nedregulerede HIPK2 proteinniveauer, der kunne reddes af MG132 behandling. Analyse af mRNA-ekspression viste, at HIPK2 gentranskription ikke var påvirket af cobalt (figur 2B). Vi ræsonnerede, at ved at holde HIPK2 protein niveauet lavt, kunne kobolt påvirke HIPK2 rekruttering på mål initiativtagere og dermed påvirke HIPK2 co-repressor aktivitet. Til støtte for denne hypotese, udførte vi ChIP assay henviser chromatin immunkomplekser blev immunfældet med anti-HIPK2 og anti-Histondeacetylase-1 (HDAC1) antistoffer og PCR-analyse udført ved anvendelse af specifikke primere, der flankerer HIF-1α-promotor [17]. Som vist i figur 2C (venstre panel), den HIPK2 og HDAC1 rekruttering på

HIF-1α

promotoren blev kraftigt forringet af cobalt. Som kontrol af HIPK2 bindende specificitet til

HIF-1α

promotor, vi brugte specifikke primere spænder mennesket

GAPDH

promoter region. Som forventet (figur 2C, højre panel), ingen

GAPDH

amplifikation blev observeret efter kromatin immunpræcipitering med anti-HIPK2 og anti-HDAC1 antistoffer mens en klar PCR bånd blev påvist under anvendelse af genomisk DNA som template. Alt i alt viser disse resultater, at kobolt kan påvirke både p53 og HIPK2 aktivitet.

(A) RKO og A549-celler blev behandlet med cobalt i 16 timer i nærvær eller fravær af proteasominhibitor MG132 (40 pmol /L for 6 h) og køretøjet DMSO. Tilsvarende mængde af totale celleekstrakter blev analyseret ved Western immunblotting med specifikt antistof detektion endogene HIPK2 proteinniveauer; anti-Hsp70 blev anvendt som protein loading kontrol. (B) I alt mRNA blev revers transkriberet fra RKO og A549 celle behandlet med kobolt i 16 timer til PCR-analyser af HIPK2 genekspression. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. (C) kromatin immunofældning (chip) analyse udført med anti-HIPK2 og anti-HDAC1 antistoffer på RKO celler behandlet med kobolt til 8 og 16 timer. PCR-analyser blev udført på de immunopræcipiterede DNA-prøver ved hjælp af specifikke primere for mennesket

HIF-1α

promotor. Amplifikation af

GAPDH

promotoren (højre panel) blev anvendt som kontrol af HIPK2 bindingsspecificitet til

HIF-1α

promotoren. En prøve, der repræsenterer lineær forstærkning af det samlede input kromatin (Input) blev inkluderet som kontrol. Yderligere kontroller inkluderet immunopræcipitation udføres med ikke-specifikke immunoglobuliner (Ingen Ab).

Hypoxi-induceret hæmning af p53 transskription aktivitet kan fortrydes med MDM2 udtømning

HIPK2-medieret p53Ser46 fosforylering er induceret af alvorlig DNA-beskadigelse [7] – [9], at det i en feedback-regulering loop, styrker HIPK2 aktivitet gennem en p53-medieret caspase-induceret mekanisme [33] og selektivt inducerer apoptotiske gener og inhiberer celle-cellecyklusstandsnings-relaterede og MDM2 gener [10], [11]. På den anden side kan en ikke-alvorlig stress nedregulerer HIPK2 gennem p53-induceret MDM2 opregulering [23]. Derfor har vi spurgt, om hypoxi kunne fungere som ikke-alvorlig stress i stand til at aktivere p53-target MDM2 og dermed hæmme HIPK2 og prædisponere til resistens. Semikvantitativ RT-PCR-analyser viste, at kobolt samt lavt iltindhold induceret MDM2 opregulering (figur 3A). Dernæst undersøgte vi, om MDM2 var ansvarlig for inhibering af p53 apoptotisk aktivitet. Analyse af p53 transkriptionel aktivitet efter cobalt behandling blev udført i 293-celler co-transficeret med p53AIP1-luc reporter og enten HIPK2-Flag eller HIPK2-K1182R-Flag punkt mutant, der ikke kan nedbrydes af MDM2 [23]. Som vist i figur 3B, blev HIPK2-induceret AIP1-luc aktivitet signifikant reduceret med cobalt mens K1182R-induceret AIP1-luc aktivitet ikke ændrede. Western immunoblotting viste, at HIPK2 ekspression blev reduceret med cobalt mens ekspressionen af ​​nedbrydningen-resistente K1182 mutant ikke blev påvirket (figur 3C). Efter aftale, også HIPK2-induceret Ser46 fosforylering blev reduceret med kobolt, mens det ikke ændre sig efter K1182 overekspression (figur 3C). Begge resultater foreslog en inddragelse af MDM2 i HIPK2 regulering, som til gengæld påvirkes p53Ser46 aktivitet. For at teste denne hypotese blev RKO-celler udtømt for MDM2 funktion ved siRNA (figur 3D), og denne MDM2 udtømning var tilstrækkelig til at redde ADR-induceret Ser46 phosphorylering og PARP-spaltning inhiberes af cobalt (figur 3E og sammenligne med 1A). Endvidere MDM2 udtømning modvirket cobalt-induceret hæmning af p53AIP1-luc aktivitet som respons på ADR (figur 3F og sammenligne med 1B). Tilsammen antyder disse data, at hypoxi-induceret resistens var afhængig, i det mindste delvist, på opregulering af MDM2 udtryk, der på sin side inhiberede HIPK2 /p53Ser46 apoptotisk aktivitet som respons på lægemidlet. Salg

(A) Total mRNA’er blev revers transkriberet fra RKO og A549-celle behandlet med cobalt eller 2% O

2 i 16 timer til PCR-analyser af MDM2 genekspression. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. (B) 293-celler blev co-transficeret med p53AIP1-luc reporter og HIPK2-Flag eller K1182R-Flag (MDM2 nedbrydning-resistent mutant) ekspressionsvektorer og 24 timer senere behandlet med CoCl

2 i 16 timer, før luciferaseaktivitet var analyseret. RLU: relative luciferase enhed.

Kolonner

, betyder af tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer;

barer

, S.D. *

P

0,01. (C) Celler blev behandlet som i (B) og efter behandling ens mængder af totale celleekstrakter blev underkastet Western immunoblotting ved anvendelse af de viste antistoffer: anti-Flag (til påvisning af ektopisk HIPK2-Flag-ekspression), anti-Ser46 og anti-p53 antistoffer. (D) RKO-celler blev transficeret med siMDM2 og 36 timer senere samme mængde total celleekstrakter blev analyseret ved Western immunblotting med specifikke anti-MDM2 antistof. (E) RKO-celler blev transficeret med siMDM2 og 24 timer senere blev behandlet med CoCl

2 og ADR i 16 timer. Tilsvarende mængde af totale celleekstrakter blev analyseret ved Western immunblotting med specifikke antistoffer detekterer p53Ser46 phosphorylering og PARP-spaltning (pile viser spaltede og uspaltede former); samlede p53 er også vist. Anti-tubulin blev anvendt som protein loading kontrol. (F) RKO-celler, stabilt transficeret med p53AIP1-luc reporter, blev transficeret med siMDM2 og 24 timer senere behandlet med CoCl

2 og ADR i 16 timer før luciferaseaktivitet blev analyseret. RLU: relative luciferase enhed.

Kolonner

, betyder af tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer;

barer

, SD

Zink genskaber ADR-induceret p53 apoptotiske-gentranskription i kobolt-behandlede celler

Vi har for nylig vist, at HIPK2 udtynding er ansvarlig for p53 protein misfoldning der kan fortrydes med zinktilskud [25], [26]. Derfor har vi en hypotese her, at hypoxi-induceret HIPK2 deregulering kan spejle HIPK2 knockdown tilstand og derved påvirke p53 DNA-bindende og transkriptionelle aktiviteter. Vi fandt, at cobalt forøget p53 reaktivitet over for PAb240 antistof (mutant, udfoldet p53 form) og reducerede p53 reaktivitet til Pab1620 antistof (vildtype, foldet form) (figur 4A), hvilket viser p53-protein misfoldning, og derfor testet, om zink tilskud var i stand til at genoprette wtp53 aktivitet som respons på lægemidlet. Til dette formål vi først vurderet

in vivo

wtp53 DNA-bindende aktivitet ved hjælp af chip-analyse. RKO-celler blev behandlet med cobalt og ADR i nærvær eller fravær af zink og endogent p53 immunorecipitated med polyklonalt anti-p53-antistof (FL393). Mængden af ​​co-udfældet p53-bindende elementer i mål initiativtagere blev bestemt ved PCR. Resultaterne viste, at kobolt markant reduceret p53 binding til initiativtagere til apoptotiske gener som

Puma

DR5

som svar til ADR og at denne hæmning var stærkt vendt ved zinktilskud (figur 4B). P53 specifik binding til

Puma

DR5

promotorer blev bekræftet ved

GAPDH

promotor amplifikation efter kromatin immunofældning med anti-p53-antistof (figur 4B). Således p53 apoptotisk transkriptionel aktivitet specifikt induceret af ADR (Noxa-luc versus p21-luc), blev inhiberet af cobalt og restaureret af zinktilskud (figur 4C). Især zink alene inducerede ikke p53 transkriptionsaktivitet. Endvidere har vi vurderet om HIPK2-induceret p53 transkriptionel aktivitet inhiberes af cobalt (figur 3B) kunne genoprettes ved zink. Til dette formål blev 293 celler co-transficeret med p53AIP1-luc reporter og HIPK2 ekspressionsvektor. Som vist i figur 4D, zinktilskud fuldt restaureret HIPK2-induceret p53AIP1-luc aktivitet reduceret med cobalt, mens behandlinger med cobalt eller zink alene inducerede ikke p53AIP1 luciferaseaktivitet. Efter aftale blev ADR-induceret p53 apoptotisk gen transskription hæmmes af kobolt (figur 4E, sammenligne bane 2 med bane 3) og restaureret af zinktilskud (figur 4E, sammenligne bane 3 med 4) til de samme niveauer af ADR behandling (figur 4E sammenligne bane 4 med bane 2). Især havde zinktilskud til cobalt fremprovokere apoptotisk gentranskription (figur 4E, bane 5). Endelig blev apoptotisk celledød evalueret ved Western immunoblotting viser, at inhibering af PARP-spaltning og Ser46 phosphorylering med cobalt eksponering af ADR-behandlede celler (figur 4F, sammenlign bane 2 med bane 4) var stærkt restaureret af zink (figur 4F, sammenlign bane 4 med bane 5). Disse data antyder, at zink var i stand til at reaktivere de hypoksi-inhiberet endogene wtp53 DNA-bindings- og apoptotiske transskriptionelle aktiviteter som reaktion på lægemidlet, ved at modvirke, i det mindste delvist, HIPK2 deregulering. Salg

(A) RKO-celler blev behandlet med cobalt i 16 timer og tilsvarende mængde af totale celleekstrakter blev immunpræcipiteret med konformation-specifik Pab1620 (for vildtype, foldede p53 form) og Pab240 (for mutant, udfoldet p53 form) antistoffer og analyseret ved Western immunoblotting med anti p53 polyklonalt antistof (FL393). De repræsentative bands fra mindst to uafhængige forsøg er præsenteret, viser stigning på PAb240 reaktivitet og reduktion af Pab1620 reaktivitet efter kobolt behandling. En ikke specifik (N.S.) signal er vist som protein loading kontrol. (B) kromatin immunpræcipitering (chip) analyse udført med anti-p53 antistof på RKO celler udsat for ZnC

2 og CoCl

2 i 24 timer og Adriamycin i 16 timer. PCR-analyser blev udført på de immunopræcipiterede DNA-prøver ved hjælp af specifikke primere for p53 mål

Puma

og

DR5

initiativtagere. Forstærkning af

GAPDH

promotor (højre panel) blev anvendt som kontrol af p53 bindende specificitet til

Puma

DR5

initiativtagere. En prøve, der repræsenterer lineær forstærkning af det samlede input kromatin (Input) blev inkluderet som kontrol. Yderligere kontroller inkluderet immunopræcipitation udføres med ikke-specifikke immunoglobuliner (Ingen Ab). (C) RKO-celler blev transficeret med p21-luc og Noxa-Luc reportere og 24 timer senere behandlet med ZnC

2 og CoCl

2 i 24 timer og Adriamycin i 16 timer henholdsvis før luciferaseaktivitet blev analyseret. Resultater er normaliseret til p-galactosidase-aktivitet vist som fold induktion i forhold til ubehandlede celler;

barer

, S.D. (D) 293-celler blev co-transficeret med p53AIP1-luc reporter og HIPK2-Flag ekspressionsvektor og 24 timer senere behandlet med ZnC

2 og CoCl

2 i 16 timer, før luciferaseaktivitet blev analyseret. RLU: relative luciferase enhed.

Kolonner

, betyder af tre uafhængige forsøg udført i to eksemplarer;

barer

, S.D. *

P

0,01. (E) Total mRNA blev revers transkriberet fra RKO celler behandlet som i (C) til PCR-analyser af p53 målgener

Noxa

Puma

. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. (F) RKO-celler blev behandlet med ZnC

2 og CoCl

2 i 24 timer og ADR i 16 timer og tilsvarende mængde af totale celleekstrakter analyseret ved Western immunblotting med anti-PARP (pile viser det uspaltede og spaltes PARP ), anti-Ser46 og anti-p53-antistoffer. Anti-Hsp70 blev anvendt som protein lastning kontrol.

Zink vender dysfunktionel HIPK2 i hypoxi-behandlede celler

Næste vi forsøgt at vurdere, om zink kunne modvirke hypoxi-induceret HIPK2 nedregulering og påvirke HIPK2 binding til kromatin. Som vist i figur 5A (venstre panel) cobalt-induceret HIPK2 protein nedregulering blev reddet ved zinktilskud mens zink alene ikke ændrede HIPK2 niveauer. Omvendt kobolt behandling opreguleret HIF-1α udtryk og denne virkning blev håndfast vendt ved zinktilskud (figur 5A, højre panel). Subcellulær fraktionering viste, at kobolt behandling reducerede både cytoplasmatiske og nukleare HIPK2 nukleare niveauer, selv om HIPK2 nukleare niveauer blev mere stærkt påvirket af kobolt og at denne effekt blev vendt ved zinktilskud (figur 5B). Zink alene påvirkede ikke HIPK2 niveauer (Figur 5B). Lignende resultater blev opnået med lav oxygen behandling (figur 5C). Dernæst analyserede HIPK2 katalytisk aktivitet efter cobalt behandling. Til dette formål blev 293-celler transficeret med tom vektor Flag eller HIPK2-Flag-ekspressionsvektor i nærvær eller fravær af cobalt eller zink, efterfulgt af immunfældning af ektopisk HIPK2 med anti-Flag-antistof og

in vitro

kinaseassay med den kendte HIPK2 phosphoryleringssubstrat myelin basisk protein (MBP) [7]. Som vist i figur 5D, ektopisk HIPK2 var stadig i stand til at phosphorylere MBP efter behandlinger, hvilket antyder, at hypoxi sandsynligvis ikke påvirker HIPK2 katalytisk aktivitet, i det mindste i vores eksperimentelle betingelse. Salg

(A, venstre panel) Subkonfluente RKO-celler blev udsat for CoCl

2 og ZnC

2 alene eller i kombination i 16 timer, og tilsvarende mængde af totale celleekstrakter analyseret ved Western immunoblotting med specifikt antistof viser endogen HIPK2 niveau. Anti-tubulin blev anvendt som protein loading kontrol (højre panel). Lige mængde af nukleare ekstrakter af RKO celler behandlet som ovenfor, blev analyseret ved Western immunblotting med specifikke antistoffer afsløre HIF-1a-niveauer. Anti-Hsp70 blev anvendt som protein loading kontrol. (B) RKO celler behandlet som i (A) blev lyseret for nuklear og cytoplasmatisk fraktionering og analyseret ved Western immunblotting under anvendelse af anti-HIPK2 antistof. Anti-tubulin og anti-NFYB antistoffer blev anvendt for protein loading kontrol af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, henholdsvis. (C) RKO og A549-celler blev behandlet med 2% O

2 i nærvær eller fravær af zink i 16 timer, og lige så stor mængde celleekstrakter nukleare analyseret ved Western immunblotting med specifikke antistoffer detektering HIF-1α og HIPK2 nukleare niveauer . Anti-Hsp70 blev anvendt som protein loading kontrol. (D) kinaseassay for ektopisk HIPK2 i 293-celler transficeret med Flag tom eller HIPK2-Flag ekspressionsvektor efterladt ubehandlet eller behandlet med cobalt eller zink i 16 timer. Tilsvarende mængde af totale celleekstrakter blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-FLAG-antistof og undersøgt for kinaseaktivitet under anvendelse MBP som substrat. Lige ekspression af MBP-protein blev bekræftet ved Coomassie-farvning af kinaseassay. (E) kromatin immunpræcipitering (chip) analyse udført med anti-HIPK2 antistof på RKO celler behandlet som i (A). PCR-analyser blev udført på de immunopræcipiterede DNA-prøver ved hjælp af specifikke primere for mennesket

HIF-1α

promotor. Forstærkning af

GAPDH

promotor (højre panel) blev anvendt som kontrol af HIPK2 bindende specificitet til

HIF-1α

promotoren En prøve, der repræsenterer lineær forstærkning af det samlede input kromatin (Input) blev inkluderet som kontrol. Yderligere kontroller inkluderet immunopræcipitation udføres med ikke-specifikke immunoglobuliner (Ingen Ab). (F, øvre panel) blev Samlede mRNA’er revers transkriberet fra RKO celler behandlet med ZnC

2 og CoCl

2 i 24 timer og ADR i 16 timer henholdsvis til PCR-analyser af HIF-1 målgener

Bcl2

,

MDR1

, og

VEGF

. Ratio: udtryk ratioen til GAPDH. (F, lavere niveau) densitometrisk analyse af genekspression afbildet som udtrykket ratioen til GAPDH, anvendt som intern kontrol. Studerendes

t

test blev anvendt til statistisk analyse af sammenligning mellem værdierne af kobolt og kobolt plus zink, og CoCl

2 /ADR og CoCl

2 /ADR /ZnC

2 som vist. *

P

0,01. (G) RKO-celler udtømt for HIPK2 funktion ved siHIPK2 blev behandlet med ZnC

2 i 24 timer og ADR i 16 timer henholdsvis og total mRNA’er revers transkriberet til PCR-analyser som i (F)

2 og CoCl.

de modsatrettede virkninger af hypoxi på HIPK2 og HIF-1α niveauer er indbyrdes forbundet ved den repressor effekt HIPK2 på

HIF-1α

promotor. Således kobolt-induceret afskaffelse af HIPK2 rekruttering på

HIF-1α

promotor var stærkt vendt ved zink (figur 5E). Den HIPK2 specifik binding til

HIF-1α

promotor blev bekræftet af

GAPDH

promotor forstærkning efter kromatin immunofældning med anti-p53 antistof. Følgelig RT-PCR-analyse viste, at cobalt-inducerede

Bcl-2

,

MDR1

VEGF

genekspression blev signifikant undertrykt af zink (fig 5FD, sammenlign CoCl

2 baner med CoCl

2 /ZnC

2 baner), som også fremgår af udtrykket forholdet til GAPDH (Figur 5F, nederste panel). Desuden ADR behandling i kombination med kobolt ikke var i stand til at hæmme kobolt-induceret HIF-1-vejen (figur 5E, sammenligne CoCl

2 baner med CoCl

2 /ADR baner), med mindre i kombination med zink (figur 5F , sammenligne CoCl

2 /ADR baner med CoCl

2 /ADR /ZnC

2 baner). Rolle HIPK2 i kobolt-induceret HIF-1-mål blev yderligere evalueret efter HIPK2 udtynding. Som vist i figur 5G, det basale niveau af

MDR1

Bcl2

genekspression allerede var høj i siHIPK2 celler efter aftale med vores tidligere resultater på HIPK2 repressoraktivitet af HIF-1α [17 ], [18], og kunne ikke undertrykkes af zink behandling (figur 5G og sammenligne med 5F). Virkningen af ​​zink modvirker hypoxi Resultatet var specifik, da en anden antioxidant, dvs. C-vitamin, gjorde hverken nedmodulere HIF-1-målgener eller påvirket lægemiddelrespons (data ikke vist). Samlet set viser disse resultater, at zink modvirket hypoxi-induceret HIPK2 nedmodulering, genvundet HIPK2 rekruttering på kromatin og førte til undertrykkelse af HIF-1-vejen.

Zink forbedrer kemoterapeutiske respons in vivo

Til evaluere den terapeutiske effektivitet af kombinationen af ​​zink og kemoterapi

in vivo

vi genereret tumorxenotransplantater i athymiske nøgne mus. Musene blev derefter forbehandlede med ZnC

2 i 8 timer før ADR injektion og derefter behandlet dagligt med zink. Mus behandlet med ADR alene i løbet af 2 uger viste reduktion af tumorvolumen på en sammenlignelig måde med patienter behandlet med zink alene (figur 6A). Interessant tilsætning af zink signifikant forøget effekten af ​​ADR fører til markant hæmning af tumorvækst (Adriamycin + zink

versus

Adriamycin:

P

0,01) (figur 6A og 6B). Tumorer blev høstet ved dag 18 og genekspression blev bestemt ved RT-PCR og densitometriske analyser.