PLoS ONE: VEZT, en roman Formodede tumorsuppressor, Undertrykker vækst- og tumorfremkaldende i Gastric Cancer

Abstrakt

Vezatin (VEZT), en adherensovergange transmembrane protein, blev identificeret som en formodet tumor suppressor i vores tidligere studere. Men den rolle VEZT i tumorigenese stadig undvigende. Vi havde til formål at tydeliggøre sin epigenetisk regulering og biologiske funktioner i mavekræft. I denne undersøgelse viser vi, at ekspressionsniveauet af VEZT er involveret i lymfe metastase, dybde af cancer invasion og TNM fase i 104 mavecancerpatienter. Bisulfat sekventering polymerasekædereaktion (BSP) metoder viste, at VEZT blev hypermethyleret i væv og tilsvarende blod mavecancerpatienter sammenlignet med raske kontroller.

Helicobacter pylori

(

H. Pylori

) infektion inducerer methylering og nedregulering af VEZT i GES-1 celler. Gendannelse VEZT udtryk i MKN-45 og NCI-N87 gastrisk cancerceller hæmmede vækst, invasion og tumorigenese

in vitro og in vivo

. Global microarray analyse blev anvendt til at analysere den molekylære basis for de biologiske funktioner af VEZT efter VEZT transfektion kombineret med real-time PCR og chromatin immunoprecipitation assay. G-protein-koblet receptor 56 (GPR56), cellevækst, celledeling cyklus 42 (Cdc42), migration /invasion og transskriptionsfaktor 19 (TCF19), cellecyklusprogression, blev identificeret som direkte VEZT målgener. TCF19, en roman mål for VEZT blev funktionelt valideret. Overekspression af TCF19 i MKN-45-celler forøget cellecyklus fremgang og vækst evne. Denne undersøgelse giver nye indblik i reguleringen af ​​VEZT genet, som kunne udgøre et potentielt mål for terapeutiske strategier anti-cancer

Henvisning:. Miao R, Guo X, Zhi Q, Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, en roman Formodede tumorsuppressor, Undertrykker Vækst og tumorfremkaldende i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: April 1, 2013; Accepteret: August 1, 2013; Udgivet: 17 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Miao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Ungdommelig Science Foundation of China (81101858), Natural Science Foundation i Shandong-provinsen i Kina (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key Research Project fra Shandong Videnskab og Teknologi Kommissionen (2011GGB14158, 2007H2071), den ungdommelige Science Foundation i Shandong-provinsen i Kina (BS2010YY060). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den anden førende årsag til mandlig cancer-relaterede dødsfald og den tredje hyppigste årsag til kvindelig cancer-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Det er et stort problem for folkesundheden i hele verden [2]. I Kina er der 400.000 nye tilfælde af mavekræft og 300.000 dødsfald årligt. Mange tilfælde, der lider mavekræft har mistet helbredende chance med ekstremt dårligt resultat [3]. Derfor udvikler nye og effektive terapeutiske metoder er afgørende for at reducere gastrisk dødelighed kræft. Det er kendt, at patogenesen af ​​gastriske carcinomer er multifaktoriel, som omfatter genetisk disposition og miljømæssige faktorer. Der er en række genetiske vekslinger herunder tumorsuppressorgener, onkogener, celleadhæsionsmolekyler og vækstfaktorer [4].

Selvom de molekylære mekanismer i gastrisk carcinogenese fortsat uklare, epigenetisk inaktivering af tumor-relaterede gener ved promotor hypermethylering har for nylig vist sig som en vigtig mekanisme af tumorigenese. Promotor hypermethylering profil adskiller sig hver kræft type og inden hvert gen, der giver tumor type- og gen-specifikke hypermethyleringsassocierede profiler, der kan inddrage i den tilsvarende molekylære mekanisme af tumorigenese. Identifikationen af ​​et hidtil ukendt gen målrettet med promoter hypermethylering kan give indsigt i mekanismerne for inaktivering af tumor-undertrykkende veje og er vigtig for identifikationen af ​​tumormarkører i gastrisk kræft [5,6].

For nylig , vi har identificeret, en adherensovergange transmembranprotein, VEZT som kandidat tumor-suppressor gen. Vi havde til formål at afklare epigenetiske regulering og biologiske funktioner af VEZT i mavekræft. VEZT, et allestedsnærværende integrerende protein, indirekte forbundet med E-cadherin-cateninkomplekset og aktincytoskelettet [7,8]. Dens funktioner er hovedsageligt blevet udforsket i epitelceller. Tab af VEZT er progressivt skader fosterudviklingen [9,10], og VEZT er kritisk for at bevare integriteten af ​​de cellulære junctions under langtidsbehandling mekanisk belastning forekommer på niveauet af indre øre-hårceller som svar på lyd. Desuden det indre øre-specifikke VEZT betinget ugyldiggørelse fører til progressiv døvhed [7]. VEZT er kraftigt udtrykt i hjernen [8,11]. VEZT er beriget i dendritiske spidser i muse hippocampale neuroner. Brug VEZT knock-down og betinget knockout før (D6cre) eller efter (CamKIIαcre) fødsel, VEZT regulerer rygsøjlen morfologi. Morfologiske ændringer er ikke forbundet med kompromitterede synaptiske kontakter, men postsynaptiske VEZT spiller en afgørende rolle i morfo-funktionelle modning af excitatoriske postsynaptiske elementer [12].

Inaktivering af VEZT genet er blevet identificeret i mavekræft, og methylering af CpG-øer i promotorregionen af ​​VEZT genet bidrage til dens inaktivering som bestemt ved en tidligere undersøgelse foretaget af vores laboratorium [13]. Mekanismen af ​​methylering og den præcise rolle VEZT i udviklingen af ​​mavekræft er endnu ukendt. Målgenerne og relaterede veje for VEZT endnu ikke er blevet identificeret. I denne undersøgelse har vi systematisk analyseret mekanismen for methylering og status for methylering af promotoren af ​​VEZT genet. Vi analyserede også sine funktionelle egenskaber efter rekonstituering af VEZT udtryk

in vitro og in vivo

.

Materialer og metoder

cellelinjer og vævsprøver

MKN -45, MKN-28, SGC-7901, den udødeliggjort menneskelige maveslimhinden cellelinie GES-1 (leveres af institut for fordøjelsessystemet kirurgi af Ruijin hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] og humane navlevene endotelceller (HUVEC’er) blev bevaret i vores institut. Gastric cancercellelinier SNU-1 og NCI-N87-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Kort beskrevet blev celler dyrket i RPMI1640 tilsat 10% føtalt kalveserum og 2 mM L-glutamin. Celler blev holdt ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2.

Primær gastrisk tumor og normale gastriske mucosale væv blev indsamlet fra enten rutinemæssig terapeutisk kirurgi eller gastrointestinal endoskopi på kategorien. Resten var

H. pylori

infektion status blev bestemt på grundlag af den hurtige urease test som tidligere beskrevet [18].

Etik Statement

Skriftligt informeret samtykke i undersøgelsen blev opnået fra alle deltagere. 4 uger gammel mand BALB /c nøgne mus blev købt fra Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i Animal Laboratory Center Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University (Jinan, Kina) på en 12/12 timers lys /mørke-cyklus (lyset slukket ved 19: 00) med mad og vand tilgængeligt ad libitum. Forsøgene dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University (Permit Nummer: SHANS87492). Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité af Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University.

Behandling af Laser mikrodissektion for væv og celler

Væv blev fjernet så hurtigt som muligt efter resektion og fikseret i formalin, indlejret i paraffin og skæres i 8-um-tykke sektioner for hematoxylin og eosin (H 95% “homogen” som bestemt ved mikroskopisk visualisering af de indfangede celler. Hætterne med indfangede celler blev derefter monteret på 0,5 ml microcentrifage rør. Efter mikrodissektion kan DNA, RNA eller protein ekstraheres fra portioner af Mikrodissekterede prøver. Salg

Methyleringsanalyse

Genomisk DNA opnået fra de Mikrodissekterede cellelinier, gastriske cancer væv og plasma (0,2 ml ) blev oprenset ved anvendelse DNAzol (Invitrogen). Oprenset DNA blev behandlet med natriumbisulfit (Sigma, Phoenix, USA) og derefter analyseret ved BSP eller specifik polymerasekædereaktion (MSP) som tidligere beskrevet [13,15]. Amplificerede bisulfit PCR-produkter blev subklonet ind i en TA-vektor-system (Promega) ifølge producentens instruktioner. DNA-sekventering blev udført på tre individuelle kloner (Sangong). PCR-produkterne blev bekræftet ved agarosegelelektroforese og fremkaldes med ethidiumbromidfarvning. De anvendte primere er sammenfattet i tabel S1.

Electron mikroskopisk observation

H. pylori

stammer NCTC11637 (både CagA- og VacApositive) blev leveret af professor Guo af Institut for Medicinsk Mikrobiologi og Parasitologi, Institutes of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

H. pylori

stammer blev dyrket rutinemæssigt i 72 timer om Columbia agar base (bioMérieux, Frankrig) med 5% fåreblod i blandet luft indeholdende 10% CO

2, 5% O2 og 85% N

2 ved 37 ° C. Så vi konverterede

H. pylori

til flydende medium indeholdende Brain Heart Infusion (BD, USA), 10% fåreblod, og de samme antibiotika som dem, der anvendes i Columbia agar base. Det flydende medium blev rystet på et rysteapparat (Forma Scientific, USA) med en konstant rotationshastighed på 120 rpm.

H. pylori

blev talt under anvendelse af et spektrofotometer (Biospec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) og vasket med sterilt PBS (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) før brug. GES-1-celler (4 × 10

5) blev dyrket indtil konfluens på dækglas i seks-brønds plader, og derefter GES-1-celler blev inficeret med

H. pylori på

en infektionsmultiplicitet (MOI) på 100: 1. Efter inkubation i 24 timer blev morfologiske ændringer af GES-1 celler observeret ved anvendelse af en H-800 transmissionselektronmikroskop.

Real-time QRT-PCR-analyse

Oprenset total RNA blev opnået fra Mikrodissekterede celler, blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af Trizol-opløsning. Revers transkription (RT) blev udført i en 20-pi reaktion ifølge producentens anbefalinger (Qiagen). Real-time QRT-PCR analyser blev udført ved anvendelse af primere, der er opført i tabel S1. Transcript ekspressionsniveauer blev bestemt ved kvantificering af intensiteten af ​​PCR-produktet normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) ekspression. Kvantitativ måling af mRNA-niveauer blev udført under anvendelse af ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Disse data blev analyseret ved hjælp af den sammenlignende Ct-metoden.

Western blotting

Samlet protein blev udvundet fra Mikrodissekterede celler. Signal protein ekstraktionsbuffer 1 systemet (430-7608-MSDS) af Bio-Rad Corporation blev anvendt for protein ekstraktion i vores eksperimenter og koncentrationen blev målt ved DC-protein-assay-metoden ifølge Bradford (Bio-Rad). I alt 100 ug protein fra hver prøve blev separeret ved 10% SDS-PAGE-gel og overført til en ækvilibreret polyvinylidendifluoridmembran (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) blev proteinerne detekteret ved forøget kemiluminescens (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) efter inkubering med specifikt primært antistof VEZT (1: 2.000), IL-6 (1: 2.000), AKT (1: 1.000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3.000), ATF3 (1: 2.000), og IRX5 (1: 2.000) ved 4 ° C natten over og derefter det sekundære antistof. Proteinniveauer blev normaliseret til total GAPDH anvendelse af et monoklonalt anti-GAPDH-antistof (Sigma) som tidligere beskrevet [15].

Konstruktion af ekspressionsvektor til VEZT og TCF19

VEZT og TCF19 overekspression vektor pEGFP -N1-VEZT og pEGFP-N1-TCF19 blev konstrueret under anvendelse af overlappende PCR eller PCR-fremgangsmåden, henholdsvis og primerne anvendt til to vektorer er opsummeret i tabel S1. PCR-produkterne blev bekræftet ved direkte DNA-sekventering og klonet ind i den mammale ekspressionsvektor pEGFP-N1 som tidligere beskrevet [15]. MKN-45 og NCI-N87 gastrisk cancer cellelinier blev anvendt til overekspressionen studier. Vi opnåede stabilt transficeret kloner ved G418-selektion (Promega). En stabil transfektant af pEGFP-N1 tom vektor blev anvendt som kontrol. Til transfektion blev komplekser af lipofectamin 2000 (Invitrogen Corp, Carlsbad, USA) og en af ​​de ovennævnte plasmider fremstillet ifølge producentens instruktioner, og disse komplekser blev blandet direkte med celler i 24-brønds celledyrkningsplader plader ved en densitet på 4 × 10

4 celler pr. Niveauet af VEZT eller TCF19 ekspression efter transfektion blev analyseret ved real-time PCR.

Invasion, migration og endotel kanaldannelse assays

Cell invasion, migration og endotele rørdannelse assays blev udført under anvendelse MKN -45 og NCI-N87 celler. Celledyrkning blev udført i Transwell kamre (Corning, NY, USA). For invasionen assayet blev insert membranerne overtrukket med fortyndet Matrigel (San Jose, CA, USA). Celler (1 x 10

5) blev tilsat til det øvre kammer og blev dyrket i 48 timer. For migration assay blev de indsætte membraner beklædt med Matrigel men blev dyrket under de samme betingelser. Endelig blev insert membranerne skåret og farvet med krystalviolet (0,04% i vand; 100 ml), og de migrerede celler blev talt under et omvendt mikroskop og blev fotograferet

In vitro angiogenese blev vurderet ved anvendelse af et. endotel rørdannelse assaykit (San Diego, CA, USA). Kort fortalt blev hver brønd af forafkølet 96-brønds dyrkningsplader overtrukket med et tyndt lag af ECM gel. HUVEC’er blev resuspenderet i supernatanter opsamlet fra transficerede celler. HUVEC’er (2 × 10

4 celler /brønd) blev tilsat til den polymeriserede ECM gel med 300 ml supernatanterne. Efter 18 timers inkubation blev rørdannelse evne vurderes ved at bestemme den rørformede nummer, den rørformede længde og antallet af rørformede skærende knudepunkter i fem tilfældige felter hjælp af Image Pro Plus software (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) i overensstemmelse til Mirshahi metode [19].

cellevækst og blød agar-kolonidannelse assayet

mavekræft celler (2 x 10

3-celler) blev inkuberet med 100 pi kulturmedium i 96 -multiwell plader én dag ved 37 ° C i 5% CO

2. Cellerne blev transficeret med plasmid til 24, 48, 72, 96, og 120 timer. Celleantallet vurderet ved anvendelse af celletælling kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan). Kort fortalt blev CCK-8 (10 pi) tilsat til hver brønd. Efter 1 time inkubation ved 37 ° blev absorbansen ved 450 nm målt ved anvendelse af ARVO MX pladelæser (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Antallet af celler blev bestemt ved den relative absorbans ved 450 nm.

mavekræft celler blev trypsinbehandlet til encellede suspensioner af 3 x 10

3-celler og derefter blev udpladet i seks-brønds plader i komplet dyrkningsmedium indeholdende 0,3% agar lag oven på 0,6% agar. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2 i 16 dage. Kolonier indeholdende mindst 50 celler blev scoret. Dataene er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse på fem tilfældigt scorede felter.

Tumorvækst i nøgne mus Salg

Celler (1 x 10

6 celler i 100 ml) fra kræftceller linjer transficeret med tom vektor eller en VEZT ekspressionsvektor blev indsamlet og podet subkutant i højre fløj regioner af 4-ugers gammel mand BALB /c nøgne mus (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). Tumorknuder blev målt hver 4. dag med passere. Mus blev aflivet efter 1 måned. Tumor vækstkurver og væksthæmning blev beregnet. To mus blev anvendt til de eksperimentelle grupper og kontrolgrupper og blev udført tre uafhængige forsøg som tidligere beskrevet [15,16].

Global cDNA microarray analyse og målgen verifikation

Oprenset total RNA var opnået fra Mikrodissekterede celler. Hele humane genom oligo microarray (Agilent, Santa Clara, CA, USA) blev anvendt. Efter hybridisering og vask blev microarray objektglas scannet med en Agilent mikromatrice scanner. De resulterende tekstfiler udvundet fra Agilent Feature Extraction Software (version 9.5.3), blev indført i Agilent GeneSpring GX-software (version 7.3) til yderligere analyse. Differentielt udtrykte gener blev identificeret ved screening fold-change. For målgenet verifikation brugte vi real-time PCR og kromatin immunopræcipitationsassay. Primerne til målgenerne er anført i tabel S1.

Flowcytometrisk analyse af cellecyklus

En dag før transfektion, 1 x 10

6 celler af MKN-45-celler blev podet til 6-brønds dyrkningsplader uden antibiotika. Cellerne blev transficeret med tom vektor eller en TCF19 ekspressionsvektor. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne høstet og fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C natten over, og derefter farvet med 250 ug /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich), 5 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich) og 5 mmol /l EDTA i PBS (pH 7,4) i 30 minutter. Cellecyklus-analyse blev udført ved FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse SPSS15.0 software (SPSS Inc., USA). Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse fra mindst tre separate forsøg. Korrelationen mellem VEZT ekspression i tumorerne og clinicopathologic variable blev beregnet med Kruskal-Wallis rank-test og Mann-Whitney U test. Forskelle mellem grupper blev analyseret under anvendelse af Students t-test og Chi-square test. En værdi på

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Forholdet mellem VEZT ekspressionsniveauerne og klinisk-patologiske faktorer hos patienter med mavekræft

Vi undersøgte sammenhængen mellem VEZT ekspressionsniveauerne i 104 parret gastrisk cancer væv og klinisk-patologiske faktorer i patienter med gastrisk cancer. Vi fandt, at ekspressionsniveauet af VEZT var forbundet signifikant med lymfatisk metastase, dybde af cancer invasion og TNM fase (tabel 1,

P

0,05). Imidlertid blev VEZT ekspressionsniveauer ikke forbundet med køn, alder, tumorstørrelse, celledifferentiering, brutto udseende, stedet for tumoren og fjernt metastase.

Faktorer

No. af patienterne

Mean ekspression af VEZT（mean±SD)

P

-value

GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year) 654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor størrelse 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site af tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth af kræft invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 distal metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Forholdet mellem VEZT ekspressionsniveauerne i kræft væv og klinisk-patologisk faktorer i patienter med gastrisk cancer.

Vi analyserede forholdet mellem VEZT ekspressionsniveauer i cancervæv og klinisk-patologiske faktorer i gastriske tumor prøver versus tilgrænsende normalt væv (n = 104). Vi fandt, at ekspressionsniveauet af VEZT blev signifikant associeret med lymfatisk metastase, dybde af cancer invasion og TNM fase (tabel 1,

P

0,05). Imidlertid blev VEZT ekspressionsniveauer ikke forbundet med køn, alder, tumorstørrelse, celledifferentiering, brutto udseende, stedet for tumoren og fjernmetastase #:. TNM, tumor-knude-metastaser; *

s

0,05. CSV Hent CSV

Methyleringsanalyse af normale gastrisk væv, primære mavekræft væv og perifert blod fra gastrisk karcinom patienter og raske kontrolpersoner

Baseret på en tidligere undersøgelse fra vores laboratorium, vi postulerede, at methylering af VEZT promotor var forskellige i gastrisk carcinom patienter og raske kontroller; vi bruges online bioinformatik software til at analysere status promotorregionen og methylering af VEZT genet (figur 1A). Vi undersøgte methylering af den VEZT promotoren i 30 vævsprøver DNA fra patienter med primær gastrisk cancer væv, svarende plasma DNA og styring med BSP metoder, der omfatter regionerne i -171bp at -428bp (figur 1A). De gennemsnitlige methyleret niveauer af VEZT i 30 primære gastriske cancer væv og 30 normale gastriske væv var 67,78 ± 25,90% og 42,42 ± 30,30%, henholdsvis (figur 1B). Primære gastrisk cancer væv viste højere methylering niveauer i VEZT promotorregionen sammenlignet med normale gastriske væv (figur S1a, figur 1B, P 0,05). Det gennemsnitlige methylerede niveau af plasma-DNA i primære mavecancerpatienter og sager raske kontrolpersoner var 69,00 ± 23,90% og 46,71 ± 26,31%, henholdsvis (figur 1C). Den methylerede niveau af plasma-DNA i primære mavecancerpatienter viste højere methylering niveauer i VEZT promotorregionen sammenlignet med en sund kontrol tilfælde (fig S1B, figur 1C, P 0,05). Således blev signifikant methylering observeret i mavekræft sammenlignet med raske kontrolpersoner. Niveauet af methyleret VEZT i væv og plasma kunne tjene som en molekylær markør for mavekræft.

(A) Online bioinformatik-software blev anvendt til at analysere promotorregionen og status for methylering af VEZT genet. (B) Methylering status 34 CpG-stederne i VEZT promotoren fra 30 normale gastriske væv og 30 primære mavekræft væv. Primære tumorvæv viste højere methylering niveauer i VEZT promotorregionen sammenlignet med normale gastriske væv. (C) Methylering status 34 CpG-stederne i VEZT promotoren fra perifert blod plasma DNA fra 30 gastriske carcinoma patienter og 30 raske kontroller. Perifert blod fra gastrisk karcinom patienter viste højere methylering niveauer i VEZT promoter region sammenlignet med raske kontrolpersoner. Hver række af cirkler repræsenterer en integreret methylering forhold fra tre kloner, og hver cirkel repræsenterer en enkelt CpG site. Åbn cirkel repræsenterer umethyleret cytosin, mens udfyldte cirkler eller delvist fyldte cirkler repræsenterer methylerede forholdet CpG sites.

H. pylori

infektion inducerer methylering og lyddæmpning af VEZT

Et betydeligt antal undersøgelser er blevet offentliggjort demonstrerer, at

H. pylori

infektion er en uafhængig risikofaktor for methylering [20,21,22]. Derfor antager vi, at

H. pylori

forårsager VEZT methylering og efterfølgende carcinogenese. Først undersøgte vi methylering af den VEZT promotor i DNA fra 23 vævsprøver fra patienter med

H. pylori

-positiv kronisk gastritis og kontrol ved hjælp af BSP og MSP metoder, som dækkede regionerne -171bp at -428bp og -342 bp til -513 bp (figur 1A). De gennemsnitlige methylering niveauer af VEZT promotoren i

H. pylori

-positive og kontrollen var 75,74 ± 28,16% og 31,20 ± 25,67%, hhv. Således blev en signifikant forskel i methylering observeret i

H. pylori

-positiv kronisk gastritis gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,01, figur 2A). Promotorregionen VEZT blev generelt methyleret i patienter med kronisk gastritis ifølge MSP analyse (Tabel S2); dog fandt vi fire tilfælde af

H. pylori

-positiv kronisk gastritis, der var relativt umethyleret. Vi observerede 19 tilfælde af

H. pylori

-positiv kronisk gastritis, der vises hypermethylering (tabel S2). For at afgøre om

H. pylori

infektion inducerer promotor methylering af VEZT genet

in vitro

, vi har registreret,

H. pylori

infektion var forbundet med ekspressionen af ​​IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 og IRX5 protein efter

H. pylori

infektion og inkuberet i 24 timer i GES-1-celler under anvendelse af Western blotting. Vores resultater viste

H. pylori

infektion fremmes ekspressionen af ​​IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 og IRX5 protein og

H. pylori

infektion var en succes i GES-1 celler (figur 2B, 2C). For yderligere at bekræfte, at der

H. pylori

infektion er faktisk ansvarlig for methylering eller dæmpning af VEZT, vi analyserede status promotor methylering af VEZT i GES-1 celler ved MSP og BSP. Som vist i figur 2D og 2E, promotoren for VEZT var hypermethylering i

H. pylori

inficerede GES-1-celler, men unmethylation blev observeret i celler inficerede med

H. pylori

(figur 2D, og ​​E). Proteinet Ekspressionsniveauet af VEZT var også lavere i

H. pylori

-inficerede celler end i celler inficerede med

H. pylori

(Figur 2C).

(A)

H. pylori

-positive gastritis patienter viste højere methylering niveauer i VEZT promotor-regionen sammenlignet med

H. pylori

-negative gastritis patienter. Hver række af cirkler repræsenterer en integreret methylering forhold fra tre kloner, og hver cirkel repræsenterer en enkelt CpG site. Åbn cirkel repræsenterer umethyleret cytosin, hvorimod fyldte cirkler eller delvist fyldte cirkler repræsenterer methylerede forholdet CpG sites. (B) Efter 24 h infektion med

H. pylori

, fastgørelse af

H. pylori

blev observeret ved transmissionselektronmikroskopi på overfladen af ​​GES-1 celler i de eksperimentelle celler i forhold til kontrolcellerne. (C) VEZT ekspressionsniveau i GES-1-celler blev reduceret efter en 24-h

H. pylori

infektion i forhold til negative kontrol celler; dog

H. pylori

infektion induceret IL-6, AKT, TNF-α, IL-8, ATF3 og IRX5 ekspression ved Western blot-analyse. (D) Den methylering af VEZT promotoren blev detekteret ved MSP efter en 24-h

H. pylori

infektion i GES-1-celler (markeret som M), hvorimod methylering af VEZT promotoren i GES-1-celler, som ikke blev inficeret med

H. pylori

blev ikke observeret (markeret som U). (E) Skematisk oversigt over 34 CpG sites i promotorregionen af ​​VEZT genet fra -171 til -428 af BSP analyse. GES-1-celler viste en højere grad af methylering efter

H. pylori

infektion i forhold til kontrolprøverne. Baren repræsenterer 5000 nm.

Funktionel analyse efter gendannelse VEZT udtryk in vitro

Den hyppige dæmpning eller nedregulering af VEZT i gastrisk cancer cellelinjer tyder på, at det er sandsynligt, en tumor-suppressor gen i vores tidligere undersøgelse. For at teste dette punkt, screenet vi VEZT ekspression i flere gastriske cancer cellelinjer ved real-time PCR og western blot. Forskellige VEZT ekspressionsniveauer blev fundet i de seks analyserede cellelinier (figur 3A). Vi konstruerede en pEGFP-N1-VEZT ekspressionsvektor og transficeret pEGFP-N1 vektor i den gastriske cancercellelinie MKN-45 og NCI-N87, som ingen eller lavt niveau af VEZT ekspression viste. Efter transfektion undersøgte vi ekspressionen af ​​VEZT i disse cellelinjer ved real-time PCR, som viste, at transkriptet ekspressionsniveauet af VEZT var opreguleret 41.99-fold (figur 3B, P 0,01) i disse cellelinjer sammenlignet med med kontrol-transficerede celler. Vi undersøgte også kapaciteten af ​​gastriske kræftceller overekspression VEZT at invadere og migrere ved transwell invasion og migration assays (figur 3C). Den invasive evne MKN-45 celler i VEZT /N1 gruppe var signifikant reduceret sammenlignet med kontrol–transfekterede celler (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2,45,

P

0,001). Antallet af MKN-45 celler i VEZT-transficerede prøve, vandrede gennem transwell insert blev også signifikant reduceret sammenlignet med kontrol–transfekterede celler (48,28 ± 2.16 vs. 142,13 ± 7,42,

P

0,001).

(A) De forskellige ekspressionsniveauer af VEZT i fem gastriske cancercellelinier og en immortaliseret maveslimhinden cellelinie. (B) Ekspression af VEZT blev opreguleret i MKN-45 og NCI-N87 celler efter VEZT vektor transfektion i forhold til N1-kontroller. (C) Invasive, vandrende og rørformede dannelse kapacitet VEZT-transficerede MKN-45 og NCI-N87-celler blev undertrykt som bestemt ved transwell og rørformede formation assays. (D) Overekspression af VEZT fører til celle vækststandsning som bestemt ved CCK-8 assay. (E) kolonidannelse satser var signifikant forskellig mellem VEZT-transfekterede celler og N1-kontroller i MKN-45 og NCI-N87 celler. (F) overekspression af VEZT i MKN-45 og NCI-N87-celler inhiberede tumorigenese i nøgne mus. Tumor knuder reseceret fra VEZT-transficerede gruppe var mindre end dem fra N1-kontroller. (G) Tumor vækstkurver for VEZT /N1 gruppe og N1-kontroller viser hurtig vækst tumor i MKN-45 eller NCI-N87 /N1control grupper. *

P

0,05. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg.

HUVEC’er blev suspenderet i supernatanter opsamlet fra kontrol- og VEZT /N1. Efter 18-timers inkubation blev supernatanten høstet fra VEZT /N1-celler viste en kraftig inhiberende virkning på dannelsen af ​​rørformede strukturer ved HUVEC’er med hensyn til antal, længde og krydsende knuder i sammenligning med kontrolgruppen (figur 3C). pylori

infektion. *

P

0,05. pylori

infektion.

H.