PLoS ONE: Epigenetisk forordning af pluripotente Gener medierer Stem Cell funktioner i human hepatocellulært carcinom og Kræft Cell Lines

Abstrakt

Aktivering af stamceller transkriptionel kredsløb er en vigtig begivenhed i udviklingen af ​​kræft. Selv om cancerceller demonstrere en stamcelle-lignende genekspression signatur, forbliver den epigenetiske regulering af pluripotens-associerede gener i cancere dårligt forstået. I denne undersøgelse, vi karakteriserede epigenetisk regulering af pluripotens-associerede gener

NANOG

,

OCT4

,

c-myc

,

KLF4

, og

SOX2

i en række cancer cellelinjer og i primære tumor prøver, og undersøgte re-aktivering af pluripotens regulatoriske kredsløb i kræft progression. Differentielle mønstre af DNA-methylering, histon modifikationer, og genekspression af pluripotente gener blev påvist i forskellige kræfttyper, som kan afspejler deres væv oprindelse.

NANOG

promotor hypometylering og gen opregulering blev fundet i metastatisk human lever cancerceller og den menneskelige hepatocellulært carcinom (HCC) primære tumorvæv. Den opregulering af

NANOG

sammen med p53 udtynding, var signifikant associeret med klinisk sent tidspunkt i HCC. En pro-metastatisk rolle NANOG i kolon kræftceller blev også demonstreret, at bruge en

NANOG

-overexpressing ortotopisk tumor implantation musemodel. Demethylering af

NANOG

promotor blev observeret i CD133 +

høj kræftceller. I overensstemmelse, overekspression af

NANOG

resulterede i en stigning i populationen af ​​CD133 +

høje celler. Desuden viste vi et cross-regulering mellem

OCT4

NANOG

i kræftceller via omprogrammering af promotor methylering. Tilsammen epigenetisk omprogrammering af

NANOG

kan føre til erhvervelse af stamceller celle-lignende egenskaber. Understreger disse resultater genoprettelse af pluripotens kredsløb i cancerceller som en potentiel mekanisme til cancer progression

Henvisning:. Wang XQ, Ng RK, Ming X, Zhang W, Chen L, Chu ACY et al. (2013) Epigenetisk forordning af pluripotente Gener medierer Stem Cell funktioner i human hepatocellulært carcinom og cancercellelinjer. PLoS ONE 8 (9): e72435. doi: 10,1371 /journal.pone.0072435

Redaktør: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Indien

Modtaget: Maj 2, 2013; Accepteret: 10. juli 2013; Udgivet: 4. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Seed Finansiering Program for Basic Research ved University of Hong Kong (11159149) og General Fund af Hong Kong Research Grant Rådet (HKU778809M) Forskning til Wang XQ. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk ændringer betragtes som potente surrogater for mutationer i deregulering af vækstfremmende gener og tumorsuppressorgener [1], [2]. Det er blevet foreslået, at processen med carcinogenese involverer epigenetiske ændringer i stamceller /progenitorceller før gatekeeper genmutationer forekommer [1], [3], [4]. Denne proces kan formentlig påvirke både genetiske og epigenetiske plasticitet af en celle og tillade erhvervelse af “stemness” funktioner, såsom invasion, metastase og medikamentresistens, under cancer progression [1], [2]. Desuden blev genomisk ustabilitet forårsaget af den globale DNA hypometylering sig at være en af ​​de tidligste forandringer i udvikling af menneskelige kræftformer [2], [5].

Mens overekspression af

OCT4

,

SOX2

,

KLF4

c-myc

gener fremkalde pluripotens i somatiske celler, der fører til dannelsen af ​​embryonale stamceller (ESC) -lignende inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) [6] – [8], er det interessant at bemærke, at ESC-lignende transkriptionel program ofte aktiveres i forskellige humane epiteliale cancere [9], [10]. Sådan en ESC-lignende gen-modul var også associeret med sygdomsprogression, f.eks metastase og tidlig mortalitet af brystkræft [9] og blærecancer [11]. Det er derfor, foreslår en fælles molekylær pathway involveret i både iPSC afledning og kræft stamceller (CSC) indledning [12]. Desuden har nyere undersøgelser vist, at iPSCs bevarer epigenetiske hukommelse, såsom DNA methylering signatur, fra deres væv oprindelse [13], [14], hvilket indikerer vigtigheden af ​​epigenetisk regulering i celle skæbne omprogrammering og tumorigenese [15], [16].

Selvom stamcelle-lignende gen-netværk er blevet demonstreret i kræft [11], forbliver sammenslutningen af ​​epigenetisk omprogrammering og CSC egenskaber dårligt forstået. Her undersøgte vi epigenetisk regulering af pluripotens-associerede gener

NANOG

,

OCT4

,

c-myc

,

KLF4

, og

SOX2

, og deres korrelation med genekspression i cancer-cellelinjer og primære tumor prøver. Vi undersøgte yderligere deres potentielle roller i processen med metastaser og i indledningen af ​​CSCS under tumor progression.

Materialer og metoder

Prøver

Parret ikke-tumor og tumorvæv eksemplarer af hepatocellulært carcinom (HCC) blev indsamlet fra femten HCC patienter diagnosticeret med stadium i-IV patologisk tumor-node-metastaser (TNM) sygdom [17]. Normale lever prøver blev indhentet fra kadaver lever donorer. Alle prøver blev leveret af Tissue Bank of hovedgrupper i Lever og pancreas kirurgi og Liver Transplantation ved Institut for Kirurgi, Queen Mary Hospital. Indsamling og opbevaring af kliniske prøver for Tissue Bank er blevet godkendt af Institutional Review Board af University of Hong Kong /Hospital Authority of Hong Kong. Normal hepatocyt og HCC cellelinjer inkluderet Miha og L02 (normale hepatocytter); PLC (primær HCC); og MHCC97L (97L) og MHCC97H (97h), blev afledt af metastatisk HCC [18]. Andre ikke-HCC kræft cellelinjer inkluderet HeLa (livmoderhalsen adenocarcinom); MCF7 (bryst-adenocarcinom); AGS (gastrisk adenocarcinom); HCT116 (kolorektal carcinom); og K-562 (kronisk myelogen leukæmi). PLC’en, HeLa, MCF7, AGS, og HCT116 linjer blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). L02 blev opnået fra Kina Center for Type Culture Collection.

Genomisk DNA isolation

Totalt genomisk DNA blev isoleret fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), cellelinjer og ikke-tumor og tumor liver prøver fra HCC patienter under anvendelse af QIAamp DNA mini kit (Qiagen).

bisulfit sekventeringsanalyse

Genomisk DNA blev forarbejdet til omdannelse med bisulfit af ikke-methylerede cytosiner vha EpiTect Bisulfite (Qiagen). Det bisulfit-modificerede DNA blev anvendt til PCR, med primere, der genkender de konverterede DNA-sekvenser (figur 1A, figur S1 i File S1, tabel S1). PCR-produkter blev klonet i pGEM T-Easy vektor (Promega Bioscience). Ti kloner blev tilfældigt udvalgt og sekventeret. DNA-sekvenser blev analyseret med BIO Analyzer software (https://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de) for CpG læsning. Andel af methylering refererer til antallet af denatureret CpG’er over samlede antal CpG’er i det analyserede område.

(A) Skematisk diagram af gen regulatoriske regioner af

NANOG

,

OCT4

og

c-myc Hoteller, som blev gennemgået af bisulfit sekventering (BIS) (røde søjler) og chip (grønne søjler) eksperimenter. (I)

NANOG

proksimale promotor-regionen dækker 10 CpG sites fra -1449 til -952. (Ii)

OCT4

promoter region er dækket af 8 primerpar til 50 CpG steder fra -2973 til 320. (Iii)

c-myc

gen region er dækket af BIS primere til CpG øer før TSS1 og TSS2, og CpG steder i exon 2 og 3; og chip primer for Exon 3. (B) Bisulfite sekventering analyse af

NANOG

promotor i kræftceller. frekvens DNA methylering præsenteres som procentdele i: normal lever (L02) og cancer lever (PLC, 97L, og 97h) celler (blå); normal PBMC og leukæmiske K-562 celler (orange); og i HeLa, MCF7, HCT116, og AGS cancerceller (grønne). (C) Klonal

NANOG

promoter methylering mønstre i 97L, HeLa og K-562 celler. Åbne cirkler repræsenterer umethylerede CpG’er; lukkede cirkler repræsenterer methylerede CpG’er. (D) Methylering hyppigheden af ​​

OCT4

proksimale promotor (-530 til +7) i: normale og cancer leverceller (blå); og i HeLa og HCT116-celler (grøn). (E) DNA methylering hyppigheden af ​​opstrøms og nedstrøms regioner af

OCT4

i normale og cancer leverceller. “Samlet” dækker 50 CpG sites fra -2973 til 320; “5” TSS “dækker 10 CpG steder fra -530 til 7; og “3” TSS “dækker 12 CpG sites fra 61 til 320. (F) Methylering hyppigheden af ​​exon 3 af

c-myc Hotel (10 CpG sites) i: normale og cancer leverceller (blå); PBMC og leukæmiske K-562 celler (orange); og i HeLa, MCF7, HCT116, og AGS kræftceller (grøn).

chromatin immunoprecipitation (chip)

Proceduren Chippen blev beskrevet i Current Protocols [19]. Kort fortalt ti til tyve million (1-2 x 10

7) L02, blev HCT116 og 97L cellerne opsamlet og fikseret med 37% formaldehyd. De sonikerede cellelysater blev underkastet immunpræcipitation med 5 ug H3K4me3 eller H3K27me3 antistoffer (ABCAM), og normal IgG (indgange som kontrol), henholdsvis i nærvær af protein G-Sepharose-perler (GE Healthcare) ved 4 ° C natten over. Kugler blev vasket sekventielt med FA lysepuffer, ChIP vaskebuffer, og TE-buffer. Bundne materialer blev elueret ved chip elueringspuffer. Berigelse af histon modifikation blev kvantificeret ved real time PCR, ved hjælp af SYBR Green (Applied Biosystems), med relevante CHIP primere (figur 1A, figur S1 i File S1, Table S1). Data er præsenteret som fold berigelse ved hjælp af en chip-qPCR-analyse beregningsformel (www.sabiosciences.com); indgange og mock IP blev anvendt til normalisering.

Revers transkription og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy Mini kit (Qiagen) og behandlet med DNase I efterfulgt af revers transkription med Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). QRT-PCR-analyse blev udført ved hjælp af de pre-designede TaqMan sonder til

NANOG

(Hs02387400_g1),

POU5F1

(Hs00999634_gH),

MYC

(Hs00153408_m1), og

18S

rRNA (4.333.760 til 0.807.027), der blev udvalgt fra TaqMan Gene Expression Analyser (Applied Biosystems). SYBR Green reagenser (Applied Biosystems eller TaKaRa Bioteknologi) blev anvendt til påvisning af

OCT4

,

MYC

,

KLF4, p53

og

β-actin

genekspression (primer information i tabel S2). Genekspression blev beregnet som CT og normaliseret til niveauet af

18S

eller

β-actin

.

lentivirus transduktion

Menneskelig

NANOG

(NM_024865) og

OCT4

(NM_002701) gener fra humane embryonale stamceller linje blev klonet ind pWPI vektor og blev transficeret med pCMV-dR8.91 og pMD2.G plasmider ind i 293T pakning cellelinje. Virale supernatanter blev høstet 48 timer efter transfektion og præcipiteret under anvendelse af PEG-det Virus Precipitation Solution (System Biosciences). HCT116 p53 – /- celler blev inficeret med lentivirus udtrykker enten

OCT4

eller

NANOG

i tilstedeværelsen af ​​8 ug /m protaminsulfat. Cellesortering blev udført under anvendelse FACSAria (BD Biosciences) isolation af transducerede HCT116 p53 – /-. Celler

In vivo metastase assayet ved ortotopisk kolon tumorimplantation

Fire til seks uger gamle BALB /Cann-now (Nude) mus blev opnået og fastholdt på Laboratory Animal Unit ved University of Hong Kong. Alle mus eksperimenter blev godkendt af Udvalget om brug af levende dyr af University of Hong Kong. Lentivirus inficeret HCT116 p53 – /- celler blev injiceret subkutant i nøgne mus til at generere primære tumorer. De primære tumorer blev dissekeret i 1-2 mm

3 terninger og derefter implanteres i coecum af andre nøgne mus [20]. Colon til lunge tumor metastase blev undersøgt efter 4 ugers coecum implantation. De hele lunger fra nøgne mus blev snittet og farvet med H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Differential DNA methylering af pluripotens-associerede gener i cancerceller

Tidligere undersøgelser har vist. aktivering af downstream mål for

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

MYC

gener i aggressivt voksende menneskelige kræftformer [11]. Vi undersøgte derfor CpG methylering mønster af

NANOG

(også kendt som

NANOG1

),

OCT4

,

SOX2

,

KLF4

og

c-myc

i menneskelige kræftceller ved bisulfit sekventering tilgang (figur 1A, figur S1 i File S1). Sammenlignet med normale leverceller L02, som viste et beskedent methylering niveau (39%), DNA hypometylering af

NANOG

(figur 1A-i) blev observeret i tre leverkræft cellelinjer, nemlig PLC, 97L og 97h ( 18%, 8% og 14%, henholdsvis), blandt hvilke den metastatiske levercellelinien 97L viste næsten fravær af DNA-methylering (figur 1B og 1C). Mens i leukæmiske K-562 celler,

NANOG

methylering (39%) viste en 2 gange formindskelse i forhold til normale mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) (81%, figur 1B og 1C). Kræftceller fra andre væv oprindelser viste forskellen

NANOG

promotor methylering; for eksempel blev hypometylering observeret i HeLa (25%), hvorimod hypermethylering blev vist i MCF7, HCT116 og AGS (71%, 92% og 91%, henholdsvis) (figur 1B og 1C).

Vi næste undersøgte

OCT4

promotor methylering mønster i kræftceller. Den proximale promotorregion (-503 til +7, figur 1A-ii),

OCT4

blev fundet hypermethyleret i L02 (92%), Miha (90%), HeLa (90%) og HCT116 (87% celler), hvilket er i modsætning til de reducerede niveauet i PLC og 97L celler (70% og 41%, henholdsvis; Figur 1D). Vi udvidede methyleringsanalyse til i alt 50 CpG’er, der dækker både den distale promotor og nedstrøms region af transkriptionsstartsitet (TSS, -2973 til +320; Figur 1A-ii). Det reducerede methylering mønster blev bevaret på den analyserede

OCT4

genregion i PLC og 97L celler (figur 1E). På

c-MYC

gen, selvom CpG’er placeret opstrøms for TSS1 og TSS2 og inden exon 2 forblev umethyleret i både normale celler og cancerceller (figur 1A-III, figur S2 i File S1), methylering niveau af exon 3 blev dramatisk reduceret og blev hypomethylated i to leverkræft cellelinier, PLC (34%) og 97L (6%), sammenlignet med den moderat til højt methylering (51% til 82%) i normale leverceller ( Figur 1F). I modsætning hertil cancerceller fra andre væv oprindelse, med undtagelse af HeLa, vises hypermethylering status

c-MYC

exon 3 (fra 72% til 99%, figur 1F). På den anden side, CpG-øer ved de promotorområder

KLF4

SOX2

gener forblev umethyleret i alle de undersøgte cellelinjer (fig S1, S3, S4 i File S1). Tilsammen differential methylering mønster af pluripotens-associerede gener blev observeret i humane cancer cellelinjer fra forskellige væv oprindelse.

Epigenetisk forskrifter pluripotente genekspression

Vi fokuserede næste på pluripotente genekspression i to cancercellelinjer 97L og HCT116, som viste modstående mønstre af DNA-methylering. QRT-PCR-analyse viste højere udtryk for

NANOG

,

OCT4

c-myc

gener i 97L celler, men ikke i HCT116 celler, når der sammenlignes med styre L02 og PLC celler (figur 2A-C, figur S5A-C i File S1), hvilket tyder ekspressionen af ​​disse gener er negativt reguleret af DNA-methylering. For

KLF4

, øget genekspression blev observeret i både 97L og HCT116 celler (figur 2D, figur S5D i File S1) på trods af, at CpG ø methyleringsmønster den var umulig at skelne mellem normal og kræftceller (figur S3 i Fil S1)

Expression niveauer af (A)

NANOG

, (B)

OCT4

, (C)

c

-.

MYC

, og (D)

KLF4

gener blev bestemt i L02, PLC, 97L, og HCT116 celler ved QRT-PCR-analyse, normaliserede med henvisning genet

18S

. Genekspressionen blev normaliseret til L02 prøve, der blev defineret som 1. Data er gennemsnit ± SD opnået fra 2 til 3 eksperimenter med dubletter. Berigelse af histon modifikation H3K4me3 og H3K27me3 på promotorområder af pluripotens-associerede gener (E)

NANOG

, (F)

OCT4

, (G)

c

–

MYC

, og (H)

KLF4

blev målt i L02, 97L, og HCT116 af chip analyse. Data er repræsenteret som fold berigelse og normaliseret med input og mock IgG kontrol. Den fold berigelse var i forhold til L02 prøve, der blev defineret som 1. Data er repræsenteret med gennemsnittet af to CHIP eksperimenter med fejllinjer af standard afledning.

Epigenetisk modifikationer på histonproteiner viste også stærk association med genekspression. Vi har derfor bestemmes tilstedeværelsen af ​​to typer af histon modifikationer, det aktive /eftergivende tri-methyl-H3K4 (H3K4me3) og den repressive tri-methyl-H3K27 (H3K27me3), i 97L og HCT116 cancerceller. Chip-analyse viste en signifikant berigelse af aktiv H3K4me3 mark ved promotorområder af

NANOG

OCT4

og exon 3-regionen i

c-myc

i 97L celler, når sammenlignet med L02 og HCT116-celler (figur 2E-G, venstre paneler). Dette er i modsætning til det lave niveau af undertrykkende H3K27me3 varemærke observeret i disse celler (figur 2E-G, højre paneler). Disse resultater antyder, at både histon modifikationer og DNA-methylering funktion synergistisk i reguleringen

NANOG

,

OCT4

c-MYC

genekspression. På den anden side blev H3K4me3 fundet stærkt beriget på

KLF4

promotor af 97L-celler, hvorimod HCT116 celler demonstrerede en moderat grad af H3K4me3 men med relativt lavere undertrykkende H3K27me3 (Figur 2H, højre panel). Dette kan forklare det høje

KLF4

genekspression i begge cellelinier (figur 2D), som er uafhængig af DNA methylering.

NANOG promotor hypometylering i humant HCC tumorvæv

i betragtning af at forskellen

NANOG

methylering mønster i kræftceller kan være en konsekvens af

in vitro

dyrkning i stedet sammen med deres tumorigenicitet

per se

, vi derfor undersøgte

NANOG

promotor methylering i primære HCC tumorer parret med tilstødende ikke-tumorvæv (n = 15), sammenlignet med normale leverprøver (figur 3A). Slående, 73% af ikke-tumor tilfælde (11 ud af 15) var mere end 50% denatureret, mens 53% af tumor sager (8 ud af 15) var mindre end 30% methylerede på

NANOG

promotor (figur 3B og 3C).

NANOG

promotor methylering niveauer blev væsentligt reduceret i de parrede HCC tumorer sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv (

s

= 0,000), hvorimod der ikke blev påvist nogen væsentlige ændringer mellem normal og ikke-tumor lever væv (

s

= 0,301, figur 3D). I overensstemmelse med den reducerede promotor methylering,

NANOG

ekspression blev fundet signifikant højere i tumorvæv end i ikke-tumorvæv (

s

= 0,021, figur 3E). Det er værd at bemærke, at HCC prøver ved TNM stadie III og IV, som normalt er til stede med vaskulær invasion, lymfeknude og fjernmetastaser [17], var signifikant forbundet med høj

NANOG

(

p

= 0,011) og lav

p53

(

s

= 0,047) udtryk (tabel 1, tabel S3). Det lave niveau for

p53

var også forbundet med vaskulær infiltration (

s

= 0,019; tabel 1). Disse resultater tyder på, at tumor metastase kræver både opregulering af

NANOG

via promotor hypometylering og undertrykkelsen af ​​

p53

i HCC

(A) H . E farvning af menneskelig normal lever (venstre), og HCC non-tumor (midten) og tumorvæv (højre). (B) Methylering status

NANOG

promotor (-1449 til -952) i femten parrede HCC ikke-tumor og tumorvæv. DNA methylering frekvens blev klassificeret i 50-69% (sort), 30-49% (grå), og 19-29% (hvidt) i HCC tumor og tilstødende ikke-tumorvæv. (C)

NANOG

promotor methylering mønster er repræsenteret med HCC sag 297 tumor og tilstødende ikke-tumorvæv. (D) Statistisk sammenligning af

NANOG

promotor-methylering i normal lever (n = 3), HCC tilstødende ikke-tumor (n = 15) og tumor (n = 15) væv; data er middelværdien ± SD. (E) Statistisk sammenligning af

NANOG

genekspression i parret HCC ikke-tumor og tumorvæv (n = 15). Hver tumorvæv blev normaliseret med sin tilsvarende ikke-tumorvæv.

NANOG udtryk fremmer tumor metastase

Efter identifikation af

NANOG

opregulering i metastatisk HCC celler og tumor prøver, fremmes vi vores undersøgelse at undersøge

in vivo

funktion af

NANOG

i kræft progression. Men den stærke udtryk for

NANOG

i HCC celler gør det vanskeligt at blive slået ned effektivt for

in vivo

funktionelle undersøgelser (data ikke vist). Vi har derfor valgt den HCT116 cellelinien, som har lav endogen niveau af NANOG, for overekspression undersøgelse. En stabil

NANOG

udtrykke HCT116 p53 – /- celler (Figur S6A i File S1) blev injiceret i nøgne mus til tumordannelse. Overraskende mindst 1 × 10

4 celler af enten HCT116 p53 – /- eller

NANOG

udtrykke HCT116 p53 – /- (NANOG-HCT116 p53 – /-) celler var tilstrækkeligt til at danne subkutane tumorer (tabel S4), hvilket indikerer, at en højere grad af

NANOG

udtryk kunne ikke yderligere at styrke dannelsen af ​​primære tumorer. Men ved hjælp af en orthotopisk tumorimplantation musemodel, observerede vi en signifikant højere kolon til lunge metastase ved at implantere xenotransplantattumorer af NANOG-HCT116 p53 – /- celler sammenlignet med den parentale HCT116 p53 – /- celler (figur 4A-C). Dette giver en stærk

in vivo

beviser til støtte funktionen af ​​

NANOG

at fremme kræft celle metastase

(A) HCT116 p53 -. /- Eller NANOG udtrykkende HCT116 p53 – /- celler (1 x 10

6) blev injiceret i nøgne mus subkutant. Xenograft tumorvæv der dannedes, blev udskåret og dissekeret i 1-2 mm

3 kuber, blev derefter implanteret i cecums andre nøgne mus. Tumordannelse i coecum blev observeret efter implantation. Pile peger på coecum og den nydannede tumor i coecum. (B) Colon til lunge tumormetastase blev undersøgt efter fire ugers implantation af H henviser blev fundet store og multiple colon tumor læsioner i NANOG-HCT116 p53 – /- implantation gruppe (højre). (C) Statistisk sammenligning af lunge metastase frekvens i ortotopisk coecum implantation model afledt fra HCT116 p53 – /- (n = 8) og NANOG-HCT116 p53 – /- (n = 11). (D) Flowcytometrianalyse af CD133 ekspression i HCT116 celler demonstrerede tre populationer af celler; nemlig CD133-, CD133 +

lav, og CD133 +

høj. Mindre end 1% af cellerne blev betragtet som CD133 +

høj. (E)

NANOG

promoter methylering mønstre i CD133-, CD133 +

lav, og CD133 +

høj HCT116 celler. CD133 +

høje celler viste en signifikant reduktion af

NANOG

promotor methylering. (F)

NANOG

udtryk i CD133-, CD133 +

lav, og CD133 +

høj HCT116 celler. CD133 +

høje celler viste en signifikant øget

NANOG

udtryk.

NANOG

udtryk i CD133- blev defineret som en, og fold stigning i CD133 +

lav og CD133 +

høj (versus til CD133-) blev beregnet som ΔΔCT. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre forsøg med dubletter. (G) HCT116 celler blev inficeret med

NANOG

GFP lentivirus og analyseret for CD133 befolkninger ved flowcytometri. Procenterne af CD133 populationer blev sammenlignet mellem HCT116 celler med enten endogene niveau eller overekspression niveau NANOG. Den CD133 +

stor befolkning (R5) blev øget i celler med overekspression af

NANOG

.

demethylering af NANOG i CD133 +

høj population af HCT116 celler

høj udtryk for CD133 er en af ​​de tegn på CSC befolkning i forskellige typer af kræft, herunder tyktarmskræft [21], [22]. Da de tre pluripotente gener

NANOG

,

OCT4

, og

c

–

MYC

blev hypermethyleret i kolorektal carcinom HCT116 celler, vi spurgte om det samme mønster af methylering vil blive observeret i sjældne formodede CSC befolkning HCT116 celler. Vi observerede over 80% af HCT116 celler var CD133 +, men kun 1% af cellerne blev betragtet som CD133 +

høj (figur 4D). Vigtigere er det,

NANOG

promotor methylering blev fastholdt på et højt niveau i både CD133- og CD133 +

lave HCT116 celler (89% og 78%, henholdsvis), mens det dramatisk blev reduceret til 42% i CD133 +

høje celler (Figur 4E). Den reducerede methylering blev også fundet i overensstemmelse med en betydelig opregulering af

NANOG

udtryk i CD133 +

høje celler (Figur 4F). Desuden overekspression af eksogene

NANOG

i HCT116 celler resulterede i en stigning i CD133 +

stor befolkning (figur 4G), tyder på, at demethylering af

NANOG

promotor bidrager til initiering af CSCS i tumor udvikling.

pluripotens regulatoriske kredsløb i kræftceller

OCT4

,

SOX2

, og

NANOG

har vist sig at danner en transkriptionel regulatorisk løkke i sektorrådene til opretholdelse af pluripotens [23] – [25]. Vi spurgte, om denne cross-regulering er bevaret i kræftceller med afvigende epigenetiske mønstre. HCT116 celler med forskellig p53 genetiske baggrunde blev brugt, fordi p53 blev rapporteret som en barriere for genetablering af pluripotens [26]. Interessant overekspression af exogent

OCT4

signifikant forøget

NANOG

mRNA-niveauer i HCT116 p53 – /- celler, men ikke i HCT116 p53 + /+ -celler (figur 5A; Figur S6B i File S1). Induktionen af ​​

NANOG

ekspression var forbundet med en nedsat promotor-methylering i OCT4-HCT116 p53 – /- celler (fra 95% til 66%, figur 5B). Desuden overekspression af eksogene

NANOG

væsentligt forbedret

Oct4

mRNA-niveauer i HCT116 celler uanset deres p53 status (figur 5C). Dette antyder, at pluripotens regulerende kredsløb er konserveret i cancerceller, og det er delvist gendannet i cancerceller via den epigenetiske mekanisme, omprogrammerer

NANOG

promotor methylering.

(A) HCT116 p53 + /+ og p53 – /- celler blev inficeret med

OCT4

GFP-lentivirus. Stærk induktion af endogen

NANOG

udtryk blev fundet i OCT4 udtrykker HCT116 p53 – /- celler. Genekspressionen i HCT116 celler uden infektion blev defineret som 1, og fold stigning i HCT116-celler med infektion blev beregnet ved ACt. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre forsøg med dubletter. Parret Student

t

test blev anvendt til statistisk analyse. (B)

NANOG

promoter methylering mønstre i HCT116 p53 – /- celler med eller uden

OCT4

overekspression. (C) HCT116 celler blev inficeret med

NANOG

GFP-lentivirus. Signifikant induktion af endogen

OCT4

ekspression blev fundet i både NANOG-udtrykkende HCT116 p53 + /+ og p53 – /- celler. Beregningen genekspressionen var den samme som beskrevet i (A). Parret Student

t

test blev anvendt til statistisk analyse.

Diskussion

Aktivering af de molekylære mål for pluripotens-associerede gener (

NANOG

,

OCT4

,

SOX2

, og

c

–

MYC

) ofte observeres i dårligt differentierede kræftformer [11], [27].

OCT4

NANOG

udtryk er også blevet fundet i forbindelse med CSC egenskaber i human cancer [28] – [33]. I denne undersøgelse har vi påvist en stamcelle epigenetisk underskrift af pluripotens-associerede gener i cancercellelinier; især en forøget ekspression af

NANOG

i metastatiske HCC-celler og i dårligt prognostiske humane HCC tumorer (Figur 1B, 1C, 2A, 3, tabel 1), hvilket formodentlig er forbundet med dets promotor hypomethylated status og undertrykkelsen af

p53

. Vi bemærkede også, at

NANOGP8

, koder for et protein med over 99,5% lighed til den autentiske NANOG1 protein, udtrykkes i en række af kræftceller, herunder HCT116 celler [34], [35]. Det er muligt, at

NANOGP8

niveau kan interferere med påvisningen af ​​

NANOG

udtryk i vores undersøgelse, da TaqMan sonde anvendte kan ikke skelne mellem de to gensekvenser. Vigtigt er det, angivet vores data, at den stærke

NANOG

udtryk var forbundet med iværksættelsen af ​​en formodet CSC population (Figur 4D-G) og fremmes

in vivo

tumormetastaser (figur 4A-C) . Derfor er vi hypotesen, at demethylering af

NANOG

forekommer under tumor udvikling og den tilsvarende udtryk for

NANOG

giver tumorceller med metastatisk CSC egenskaber.

Kræftceller er blevet foreslået til tilpasse sig et epigenetisk underskrift “stemness”. Forskellige kræftceller vise deres unikke mønstre af DNA methylering, histon ændringer, og pluripotente genekspression, som kan afspejle de forskellige væv oprindelse. Interessant, iPSCs havnen resterende DNA methylering underskrifter fra deres somatiske væv oprindelse [13] – [16]. Selv om det er endnu ikke fastlagt, om fænomenet epigenetiske hukommelse associerede virksomheder med udvikling af kræft, vores data tyder muligheden for, at forskellige væv oprindelsen af ​​kræft kan holde forskellige kræftfremkaldende potentiale, når de udsættes for epigenetiske ændringer, hvoraf nogle er mere tilbøjelige til at re -Aktivere pluripotente gener ved at erhverve en stamcelle epigenetiske signatur.

OCT4 og NANOG er de centrale komponenter af protein komplekser til opretholdelse pluripotens og aktivering transskriptionsregulatorisk kredsløb. Vores observation af

OCT4

/

NANOG

cross-induktion i HCT116 celler demonstrerer en bevarelse af cross-regulerende funktion mellem pluripotente faktorer i kræftceller yderligere (figur 5).