PLoS ONE: Oprensning og karakterisering af en roman og robust L-asparaginase have Low-glutaminaseaktivitet fra Bacillus licheniformis: In vitro Evaluering af Anti-kræft Ejendomme

Abstrakte

L-asparaginase med lav glutaminase har været en vigtig terapeutisk middel i behandlingen af ​​akut lymphpoblastic leukæmi (A.L.L). I den foreliggende undersøgelse, en ekstracellulær L-asparaginase med lav glutaminaseaktivitet, produceret af

Bacillus licheniformis

blev oprenset til homogenitet. Protein blev fundet at være en homotetramer af 134,8 KDa med monomere størrelse på 33,7 kDa og meget specifik for sin naturlige substrat

dvs..

L-asparagin. Aktiviteten af ​​oprenset L-asparaginase forøget i nærvær af kationer, herunder Na

+ og K

+, hvorimod det moderat inhiberet i nærvær af divalente kationer og thiolgruppe blokerende reagenser. Det oprensede enzym var maksimalt aktiv over området af pH 6,0 til 10.0 og temperatur på 40 ° C og enzymet var stabilt maksimum ved pH 9,0 og 20 ° C. CD-spektre af L-asparaginase forudsagde enzymet at bestå af 63,05% α- helix og 3,29% p-sheets i sin native form med T

222 på 58 ° C. Fluorescent spektroskopi viste protein at være stabil, selv i tilstedeværelse af mere end tre M GdHCl. Kinetiske parametre K

m, V

max og k

kat renset enzym blev fundet som 1,4 × 10

-5 M, 4,03 IU og 2,68 × 10

3 s

– 1 hhv. Det oprensede L-asparaginase havde cytotoksisk aktivitet mod forskellige ondartede cellelinjer

nemlig.

Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562 med IC henholdsvis

50 0,22 IE, 0,78 IE og 0,153 IU . Men enzymet ikke havde nogen toksisk virkning på humane erytrocytter og CHO cellelinier derfor bør overvejes potentiel kandidat til yderligere farmaceutisk anvendelse som en anticancer narkotika

Henvisning:. Mahajan RV, Kumar V, Rajendran V, Saran S, Ghosh PC, Saxena RK (2014) Oprensning og karakterisering af en roman og robust L-asparaginase have Low-glutaminaseaktivitet fra

Bacillus licheniformis: In vitro

Evaluering af anti-kræft egenskaber. PLoS ONE 9 (6): e99037. doi: 10,1371 /journal.pone.0099037

Redaktør: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, USA

Modtaget: 24. februar, 2014 Accepteret: 9 maj 2014; Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Mahajan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatteren Richi V. Mahajan takker Rådet for videnskabelig og industriel forskning (CSIR), New Delhi, for fællesskab støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, udgifter til eksperimenter udstyr og kemikalier, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

den manglende evne af leukæmiceller at syntetisere deres egen L-asparagin har gjort enzymet L-asparaginase en nøglekomponent i kemoterapi i behandlingen af ​​akut lymfoblastær leukæmi (ALL) [1] , [2]. Dette enzym hydrolyserer L-asparagin i L-asparaginsyre og ammoniak i blod vaskulære system, hvilket gør leukæmiceller blottet for væsentlige exogent L-asparagin, hvilket fører til inhibering af proteinsyntese og apoptose [3] – [5], og derfor gør dette enzym en potent anti-kræft middel.

Den nuværende kommercielle udbud af L-asparaginase er hovedsageligt stammer fra

E. coli

og

Erwinia chrysanthemi

men stoffet fra disse kilder er stærkt immunogene dermed neutralisere de terapeutiske virkninger og forårsager symptomer i mere end 50% af kræfttilfælde [6]. Desuden har mange undersøgelser observeret en stigning i antallet af patienter med klinisk resistens over for det nuværende marked narkotika [6] – [8]. Den kommercielle L-asparaginase blev fundet at have

in vitro

modstand mod cellerne fra patienter med recidiverende A.L.L [9]. Et andet problem i forbindelse med de kommercielle L-asparaginaser er dens lave substratspecificitet og høj glutaminaseaktivitet, som kan forårsage leverdysfunktion, pancreatitis, leukopeni, neurologiske anfald, og koagulationsabnormiteter fører til intrakraniel trombose eller blødning [10]. Derfor er der behov for nye og robuste L-asparaginaser fra GRAS (

generelt anses for sikre

) mikroorganismer, som har forbedret stabilitet, lavere glutaminaseaktivitet med høj substrat affinitet, lav K

m værdi og tilstrækkelig halvdel -Life under fysiologiske betingelser, således at den kan overvinde de ovennævnte udfordringer i den nuværende situation.

Derfor er den foreliggende undersøgelse målrettet at oprense L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 (jord Isoler), som er blevet bekræftet til at være en ny L-asparaginase og er blevet evalueret for sine biofysiske og biokemiske karakteristika og dens potentiale som et anticancer middel mod forskellige menneskelige kræftceller.

Materialer og metoder

Etik erklæring:

blodprøverne i det nuværende arbejde blev opnået fra Rotary Blood Blank, New Delhi som en gave, og disse blodprøver er kommercielt tilgængelige i Rotary Blood Bank til forskningsformål. Etisk godkendelse udvalg er ikke nødvendig for at opnå humant blod til forskningsformål. Vi har brugt humant blod til forskningsformål opnået fra Rotary Blood Bank og offentliggjort samme tidligere [11].

2.1 Kemikalier

Kemikalier til enzym rensning (kromatografiske matricer) og karakterisering blev købt fra Sigma-Aldrich. Nesslers reagens blev købt fra Fluka (Buchs, Schweiz). L-asparagin blev indkøbt fra Spectrochem (Indien). Alle kemikalier, der anvendes til fremstilling var af analytisk kvalitet og blev erhvervet fra Hi-Media (Indien). Kemikalier og markører, der anvendes i native og SDS PAGE blev opnået fra BioRad.

2.2 L-asparaginase Produktion

L-asparaginase produktion af

Bacillus licheniformis

RAM-8 (jord isolat ; identificeret på grundlag af 16 s RNA og 500 bp analyse Midi-labs, USA) blev udført i optimeret modificeret Czapek Dox medium [12]: Na

2HPO

4, 6 g /l; KH

2PO

4, 2 g /l; NaCl, 0,5 g /l; L-asparagin, 20 g /l; glycerol, 2 g /l; MgSO

4.7H

20, 0,2 g /l; CaCl

2,2H

2O, 0,005 g /l. Kolber indeholdende produktionsmedium (50 ml i 250 ml kolbe) blev inokuleret med 2% inoculum (v /v) (O.D. 2,0). Inkubation blev udført ved 37 ° C ved 200 rpm i 24 timer. Enzymproduktionen var ekstracellulær og enzymaktiviteten blev bestemt under anvendelse dyrkningsfiltratet. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og middelværdierne med standardafvigelser (SD) blev beregnet.

2.3 Enzyme Assay

Analyse af enzym blev udført som pr nesslerization procedure givet af Shirfrin

et al

. [13], under anvendelse af 189 mM L-asparagin som substrat eller andet er nævnt, i 50 mM Tris-HCI-buffer (pH 8,6) og aflæsning af absorbansen ved 436 nm. Ammoniumsulfatopløsning blev anvendt til fremstilling af standardkurve. En international enhed (IU) af asparaginase aktivitet er defineret som den mængde enzym, der kræves for at frigøre en pmol af ammoniak pr ml per minut ved pH 8,6 ved 37 ° C.

2.4 Enzyme Oprensning

2.4.1 Ultrafiltrering.

cellefrit fermenteringsmedium blev underkastet ultrafiltrering med membran patron på 30 kDa for at fjerne de lavere proteiner og til at koncentrere det ønskede protein. Retentat og permeat opsamlet efter ultrafiltrering blev analyseret for L-asparaginase aktivitet og protein koncentration på Bradford-metoden [14].

2.4.2 Acetone udfældning.

afkølet acetone (-20 ° C) blev sættes til den koncentrerede bouillon med konstant omrøring ved 4 ° C i gradient koncentration på 20 til 80% af, for proteiner til at udfælde. Fraktionerne udviser maksimal aktivitet blev centrifugeret lufttørret og opløst i minimal mængde af 50 mM Tris-HCI (pH 8,6) og dialyseret mod den samme buffer til opnåelse af koncentrerede protein.

2.4.3 DEAE-cellulose-kromatografi.

Den koncentrerede enzym blev påført diethylaminoethyl cellulose søjle (DEAE-cellulose) (4 × 60 cm) ækvilibreret med 50 mM Tris-HCI (pH-8,6). Søjlen blev vasket med 2 volumener udgangspuffer, og proteinet blev elueret med lineær gradient af NaCl (0-0,5 M) fremstillet i phosphatbuffer pH-7,4 med en hastighed på 60 ml i timen. Fraktioner, der viser L-asparaginase aktivitet blev samlet sammen dialyseret mod 50 mM Tris-HCI (pH-8,6) og koncentreret med bænk top protein koncentrator ved 4 ° C.

2.4.4 Gelfiltrering.

den koncentrerede enzymopløsning blev tilsat på toppen af ​​Sephadex G-100-søjle (4 x 60) cm-ækvilibreret med 50 mM Tris-HCl (pH-8,6) og elueret med den samme puffer ved strømningshastigheden af ​​0,5 ml per minut. Fraktioner, der viser L-asparaginase aktivitet blev samlet og dialyseret mod den samme buffer og lyofiliseret med bænk top frysetørrer. Homogenitet proteinet blev kontrolleret med SDS og indfødte SIDE.

2.5 Karakterisering af renset L-asparaginase

2.5.1 Bestemmelse af molekylvægt.

Det rensede L- asparaginase blev påført på Sephacryl ™ S-200 høj opløsning søjle (Pharmacia, 16/60) ækvilibreret med 50 mM Tris-HCI (pH-8,6) og elueret ved strømningshastighed på 0,5 ml per minut [15]. Faste molekylære markørproteiner blev påført til søjlen, og elueringsvolumenet (V

e) for hver markør-protein og tomme volumen (V

o) af kolonnen blev registreret. Den molekylære masse af proteinet blev bestemt på en semi-log graf ved at plotte V

e /V

o på X-aksen og logaritmen til molekylvægten på Y-aksen.

2.5.2 virkning af pH og temperatur på aktiviteten og stabiliteten af ​​enzymet.

aktiviteten af ​​L-asparaginase blev evalueret ved forskellige pH værdier og temperaturer. Optimal pH for L-asparaginase blev bestemt over et pH-område fra 4 til 10. Til pH stabilitetsundersøgelser blev enzympræparater inkuberet ved pH på 4-10 i 24 timer ved 4 ° C og resterende aktivitet blev bestemt under assaybetingelser ( pH 8,6, 50 mM). Den optimale temperaturområde for enzymaktivitet blev bestemt ved at udføre enzymassay ved forskellige temperaturer fra 25 til 65 ° C. Også varmestabiliteten af ​​enzym blev bestemt ved at inkubere det lyofiliserede enzymet ved forskellige temperaturer

nemlig

-20 ° C, 4 ° C, 10 ° C, 30 ° C og 60 ° C i 30 dage.

2.5.3 Substratspecificitet.

Enzymaktiviteter blev evalueret med forskellige amider som substrater,

nemlig.

L-asparagin, D-asparagin, L-glutamin, D-glutamin, L -asparaginsyre, D-asparaginsyre, L-glutaminsyre, L-ornithin og urinstof i koncentrationer på 10 mM. Resultaterne blev præsenteret i form af procent relativ aktivitet.

2.5.4 Effekt af forskellige metalioner, serum komponenter og inhibitorer på enzymaktivitet.

Effekt af forskellige uorganiske ioner på enzymaktivitet blev bestemt ved præ-inkubering enzymet med forskellige salte i en koncentration på 100 mM i 6 timer ved 4 ° C. Også effekten af ​​serum, serumkomponenter og inhibitorer (sulfhydryl- og serin) blev bestemt ved inkubation af enzymet ved effektor koncentration på 10 mM i 6 timer ved 4 ° C. Resultaterne blev præsenteret i form af procent relativ aktivitet.

2.5.5 kinetiske parametre.

V

max,

K

m

,

k

kat, og

k

cat /

K

m

blev bestemt ved 25 ° C ved hjælp af L-asparagin som substrat ved koncentrationer i området fra 2 til 20 mM med den konstante enzymkoncentration på 1 mg /ml. Den indledende omsætningshastighed ved ti forskellige koncentrationer af substrat blev beregnet, og typen af ​​inhibering og Michaelis-Menten parametre blev bestemt fra Lineaweaver-Burk plots ved brug af ligningen udledt fra den lineære regressionsanalyse af kurven.

k

cat værdi blev beregnet ved at anvende ligningen

k

cat =

V

max /[E], hvor [E ] er koncentrationen af ​​enzymet i assayet. k

kat og specificitet konstanter (k

cat /K

m) blev beregnet på basis af et aktivt sted pr 33.7 kD subunit som beskrevet af Kumar

et al

. [16].

2.5.6 Cirkulær dikroisme.

CD-spektre blev registreret på et JASCO J-815 spektropolarimeter (JASCO Corporation, Hachioji-shi, Tokyo, Japan) under anvendelse af en cylindrisk kvarts-celle af vejlængde 1 mm og 1 cm, henholdsvis for langt og nær- UV-området. Ændringer i den sekundære og tertiære struktur af proteinet blev overvåget i nær og -UV regionen mellem 190-260 nm og 260-320 nm. Tre på hinanden følgende spektrale scanninger blev midlet og korrigeret ved at fratrække tilsvarende emner og udsat for støjreduktion. Udfoldningsovergangen mønster af oprenset L-asparaginase blev overvåget ved langt UV CD spektroskopi, hvor ændringer i signalintensitet ved 222 nm blev afbildet mod funktion af temperaturen.

2.5.7 Fluorescens-spektroskopi.

Fluorescensmålinger blev udført under anvendelse Eclipse Cary Varian UV-Vis spektrofluorometer (Varian, Inc. Hansen Way, Palo Alto, CA, USA) fastgjort til en Peltier temperaturregulator. En excitationsbølgelængde på 280 nm med en excitation slids 5 nm og en emissionsbølgelængde slids 5 nm blev anvendt, og fluorescensen blev registreret fra 300 nm til 400 nm. Udfoldning mønster og stabilitet af protein blev bestemt ved anvendelse 0-6 M guanidin HCI (GdHCl) som beskrevet af Bansal

et al.

, [17]. Fluorescensintensiteten blev plottet som funktion af bølgelængde ved hjælp af F

400 nm som grundlinjen.

2.5.8 N-terminal sekventering af L-asparaginase.

For at bekræfte identitet af proteinet, blev protein-prøve svarende til en molekylmasse på 33,7 kDa på SDS-PAGE blottet på en polyvinyldifluorid (PVDF) membran (Sigma-Aldrich, USA) og underkastet N-terminal aminosyre-sekvensbestemmelse ved anvendelse af en automatiseret protein sequencer PPSQ31A (Shimadzu, Japan).

2.6 Anti-tumor Anvendelse af L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

2.6.1 Celler og celle dyrkningsbetingelser.

De anticancer egenskaber renset L-asparaginase blev evalueret på forskellige humane tumorcellelinier

nemlig.

Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562 (indkøbt fra NCC’erne, Pune). Jurkat celler og K-562 blev dyrket som suspension i RPMI-1640 medium og MCF-7 blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS (Sigma), penicillin (100 ug /ml) og streptomycin (100 ug /ml ). Celler blev holdt under en fuldt befugtet atmosfære af 95% rumluft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

2.6.2 Cellelevedygtighed måling.

antiproliferativ virkning af L-asparaginase blev målt ved kolorimetrisk assay, som måler reduktionen af ​​gule 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) ved mitokondrie succinatdehydrogenase til en uopløselig, farvet ( mørk lilla) formazanprodukt som solubiliseres i organisk opløsningsmiddel og måles spektrofotometrisk. Kort beskrevet blev celler udpladet ved en celledensitet på 1 x 10

4 celler /brønd på fladbundede 96-brønds standard mikroplader. Det oprensede L-asparginase (100 IU /mg) blev seriefortyndet i ufuldstændig medium og tilsat til cellekulturer i en endelig koncentration fra 0.75-25 ug /ml. Efter inkubation i 24 timer, 20 pi MTT i en koncentration på 5 mg /ml i phosphat-puffer saltvand (PBS, pH 7,4) blev tilsat til hver brønd. Efter 4 timers inkubation blev pladerne centrifugeret ved 2000 rpm i 10 minutter, hvorefter plader blev hurtigt vendt med en fast flick at fjerne dyrkningsmediet. At solubilisere formazan bundfald ved tilsætning af 150 pi 1:01 blanding af ethanol og DMSO blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev yderligere inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Absorbansen blev derefter bestemt ved spektrofotometrisk mikropladelæser Tecan uendelig 200 pro, ved en test bølgelængde på 550 nm og en referencebølgelængde på 620 nm.

2.6.3

In vitro

hæmolyse test.

det oprensede L-asparaginase blev testet for in vitro hæmolyse ved inkubering af stigende koncentrationer af enzymet (6,25 ug til 100 ug) med hepariniseret humant fuldblod (opnået fra Rotary Blood Bank, New Delhi) i phosphatpuffer ( pH 7,2) i 24 timer som beskrevet af Lubran [18]. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 2,5% glutaraldehyd efter 24 timers inkubation og derefter centrifugeret. Supernatanten blev aflæst ved 540 nm mod negativ kontrol, dvs. prøve uden enzym. Udarbejdelsen af ​​humant blod i dobbelt destilleret vand blev behandlet som positiv kontrol.

Resultater

3.1 Rensning af L-asparaginase og Molekylær Mass Bestemmelse

Den trinvise rensning af L- asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 er aflagt i tabel 1 og figur 1a. Rækken af ​​kromatografitrin var meget effektiv og gav samlet oprensning af 33-fold. Det endelige proteinindholdet i den oprensede L-asparaginase var 15.25 mg, med udbyttet af 32.95%. Den specifikke aktivitet af oprenset enzym var 697,09 IU /mg protein. Protein blev fundet at have molekylstørrelse på 134,8 kDa (figur 1b) som bestemt ved gelfiltreringskromatografi og monomere størrelse på 33,7 kDa bekræftes ved SDS-PAGE. Den teoretiske IEF enzym blev beregnet til 5,48.

3.2 Effekt af pH og temperatur på aktivitet og stabilitet af L-asparaginase

Renset L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 var aktiv over et bredt pH-interval på 6-11 med maksimal aktivitet ved pH 9 (figur 2a). Det fremgår af figur 2c, at det oprensede enzym var aktivt ved temperaturområdet fra 30-50 ° C og viste en stejl anstændigt i aktivitet over 60 ° C. enzymet var også maksimalt stabil ved pH-intervallet mellem 7,0 og 9,0 i løbet af periode på 24 timer (figur 2b). Den bedste temperatur for enzym opbevaring viste sig at være -20 ° C hvor den var endda stabil efter 30 dages holde (figur 2d).

100% aktivitet svarer til 140 U enzym. Fejl søjler repræsenterer SD af tre eksperimenter.

3.3 Effekt af metalioner, Serum Komponenter og inhibitorer på L-asparaginase aktivitet

Det fremgår af figur 3a, der enzymaktivitet forbedret betydeligt i nærvær af de fleste af de monovalente kationer og var maksimal i nærvær af Na

+, K

+ og Mg

++. Men de andre divalente kationer havde ødelæggende virkning på enzymaktiviteten. Enzymet opbevares mere end 80% aktivitet i nærvær af serinproteaseinhibitorer viz. PMSF PBA dermed indikerer, at det ikke er en serinhydrolase. Der var nedgang på 60% i aktiviteten af ​​L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 i nærvær af sulfhydryl- inhibitorer. Også dissocieringsmidler urinstof og EDTA inhiberede aktivitet med 70% (figur 3b).

100% aktivitet svarer til 140 U enzym. Fejl- søjler repræsenterer SD af tre eksperimenter.

Men oprenset L-asparaginase aktivitet var robust ved fysiologisk pH og temperatur, men enzymaktiviteten faldt med ca. 40%, når det oprensede L-asparaginase blev inkuberet med humant serum og dets komponenter henholdsvis under

in vitro

betingelser for 48 timer, hvor på detaljeret evaluering blev det opnået, at laktat, oxylate og pyruvat udstillet mere end 70% hæmning (figur 3c).

3.4 Underlag specificitet

Den rensede L-asparaginase viste en høj specificitet mod dets naturlige substrat dvs. L-asparagin. Men mindre end 10% og 1% aktivitet mod D-asparagin og L-glutamin, henholdsvis blev observeret (figur 3d). Ingen anden substrat viste sig at interagere med enzymet i sin rene form.

3.5 kinetiske parametre

Lineweaver Burk plot i figur 4 har udledt, at K

m og V

max af renset L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM 8 ved hjælp af L-asparagin som substrat var 1,4 × 10

-5 M og 4,03 IU henholdsvis og omsætning nummer (K ​​

cat) enzym var bestemt til at være 2,68 × 10

3 s

-1. (K

cat /K

m) af enzymet blev fundet at være 1,503 × 10

6 M

-1S

-1.

K

m = 1,4 × 10

-5 MV

max = 4,03 IU /ug.

3.6 cirkulær dikroisme

CD spektrum af renset L-asparaginase gav negative elipticities på 208 og 222 nm (figur 5a). Den k2D analyse af langt UV CD spektrum fra 240 til 200 nm forudsagt APHA helix at være 63,05% og beta-sheets til at være 3,29% og T

m protein blev fundet at være 58 ° C, som anfører sin begrundelse for stejle anstændigt i aktivitet, når enzymet blev testet over 60 ° C (figur 5b). Den nær-UV CD spektre af proteinet gav negative elipticities i området på 260 til 290 som beskrevet i figur 5c.

c). Nær-UV CD spektre af oprenset L-asparaginase 1,0 mg /ml i 0,1 M Tris-HCI (pH-8,4).

3.7 fluorescensspektroskopi

Det oprensede L-asparaginase protein udviste maksimal fluorescens ved 323 nm i sin native form i fravær af GdHCl imidlertid iagttoges et skift til 352 nm, når 6 M GdnCl blev tilsat således angivelse sin fuldstændige udfoldning som beskrevet i figur 6. der blev observeret en højere fluorescens i proteinet i sin udfoldede kold tilstand

nm (excitationsbølgelængde: 292 nm).. og udfoldning overgange af L-asparaginase ved 0 M, 3 M og 6 M guanidin HCI

3.8 N-terminal sekventering af L-asparaginase

Proteinprøverne svarende til molekylmasse på 33,7 kDa på SDS-PAGE blev blottet på en polyvinyldifluorid (PVDF) membran (Sigma-Aldrich, USA) og blev underkastet N-terminal aminosyre syre sekvensbestemmelse anvendelse af en automatiseret proteinsekventeringsapparat PPSQ21A (Shimadzu, Japan). Sekvensen af ​​de første 15 N-terminale aminosyrerester viste sig at være DNKKVEAATGGTQAG som viste en bred variation med det kendte og rapporterede proteinsekvens af L-asparaginase.

3.8 antiproliferativ virkning af L-asparaginase

Den anti-proliferative aktivitet af L-asparaginase blev overvåget mod tre forskellige humane tumorcellelinier nemlig. Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562. IC

50 af oprenset L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 viste sig at meget effektiv mod de leukæmiske cellelinier nemlig. Jurkat klon E6-1 cellelinjer og K-562 cellelinier med IC

50 på 0,22 IU og 0,15 IU henholdsvis (figur 7). Den brystkræft MCF-7 viste også en retarderet vækst mod de stigende koncentrationer og viste en IC

50 på 0,78 IE.

3.9

In vitro

Hæmolyse Test for Test af lægemiddeltoksicitet

L-asparaginase inkuberet med det hepariniseret blod viste ingen virkning, selv ved en koncentration på 100 pg /ml (figur 8). Også stoffet ikke havde den hæmmende virkning på test cellelinje kinesisk hamster ovarie (CHO) celler dermed stoffet kan betragtes sikkert for de yderligere

in vivo

evalueringer

A:. Negativ kontrol (uden L-asparaginase); B: positiv kontrol (med dobbelt destilleret vand); C: 100 ug /ml; D: 50 ug /ml; E: 25 ug /ml; F: 12,5 ug /ml; G:. 6,25 mg /ml L-asparaginase

Diskussion

Rensning af L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 blev opnået ved hjælp af ultra filtrering, 80% acetone præcipitation, DEAE-cellulose-chromatografi og sephadex G-100 gelfiltrering, hhv. L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 blev oprenset til tilsyneladende homogenitet med oprensningen fold 30.17 og et udbytte på 32.95%, når den specifikke aktivitet af enzym steg fra 23,10 IU /mg til 697,09 IU /mg. Protein havde en molekylvægt på 134,8 kDa men monomere størrelse på 33,7 kDa dermed kunne være en mulig homotetramer. Disse resultater er i overensstemmelse med de tidligere rapporter om, at bakteriel L-asparaginase er en homotetramer [19] – [21]. Den teoretiske IEF enzym blev beregnet til at være 5,48, tæt på den for L-asparaginase af

E. coli

(IEF 5), men forskellig fra

Erwinia

(IEF 8.7) [16], [22]. Oprenset L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 var funktionelt stabile og aktive over et bredt interval af pH og temperatur, og viste optimal aktivitet under fysiologiske betingelser. Derfor har dette L-asparaginase var mere robust sammenlignet med L-asparaginase fra

E. coli

og

Erwinia

[16], [22] – [23]. De fleste monovalente kationer, Mg

++ og serum sukkere forbedret enzymaktiviteten, mens enzymaktiviteten faldt i nærvær af andre divalente kationer og serum organiske syrer. I denne henseende enzymet svarede til

Erwinia

L-asparaginase [24]. Den inhiberende virkning af divalente kationer, såsom Ca

++ og serum organiske syrer kan overvindes ved indfangning af enzymet i liposomer, som kan maskere den hæmmende virkning. Enzymet klemning kan yderligere forlænge plasma halveringstid og også reducere immunogenicitet, yderligere styrkelse af den terapeutiske effektivitet i forhold til fri enzym [25]. Aktivitet af L-asparaginase faldt signifikant med 60% i nærvær af sulfhydryl-inhibitorer, som kan være på grund af tilstedeværelsen af ​​frie -SH-grupper på de aktive steder af enzym [26]. Enzymet viste sig at være meget specifik for sin naturlige substrat L-asparagin, med mindre end 1% glutaminaseaktivitet. Men den

E. coli

L-asparaginase er forbundet med signifikant glutaminaseaktivitet [2]. Det forlyder, at skadelige virkninger stødt når glutamin er opbrugt under kritiske niveauer, reducerer syntesen af ​​flere vigtige proteiner

dvs.

. albumin, insulin, fibrinogen og protein-C [10], [25]. Lavere glutaminaseaktivitet øger også L-asparagin depletion [25]. Det oprensede enzym har K

Km-værdi på 1,4 × 10

-5 M, som er lavere end L-asparaginase af

Erwinia

(3,0 × 10

-3 M) [27] og

E. coli Hotel (3,5 × 10

-3 M) [28] og dermed en bedre substrat affinitet, selvom lavere K

m værdi på 7,4 × 10

-6 M blev opnået i tilfælde af L- asparaginase fra

Vibrio succinogenes

[28]. CD-spektret af det oprensede L-asparaginase, udviste en negativ elipticities ved 208 og 222 nm, som er karakteristiske for spektre opnået for blandede alpha /beta typer proteiner [29]. Den nær-UV CD spektre af proteinet gav negative elipticities i området på 260 til 290, som kan tilskrives tilstedeværelsen af ​​de aromatiske aminosyresidekæder af phenylalanin, tyrosin og tryptophan og giver CD-spektre, som er karakteristisk for native kompakt foldet protein struktur [29]. Der var en gradvis overgang fra 323 nm til 352 nm λ

em om at øge koncentrationen af ​​GdHCl fra 1 til 6 M, men skift var fremtrædende, når koncentrationen af ​​GdHCl blev forøget mere end 3 M. Lignende er blevet rapporteret i tilfælde af hypertermofile asparaginase fremstillet af det muterede

Pyroccocus furiosus

af Bansal,

et al

i 2011 [17]. Sekvensen af ​​de første 15 N-terminale aminosyrer viste en bred variation med kendte og rapporterede proteinsekvens af L-asparaginase, men den bevarede sekvens af ATGGT blev registreret [16] således derfor denne L-asparaginase protein er ny, som måske tilskriver sine robuste egenskaber og lav glutaminaseaktivitet. Oprenset L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 viste sig at være yderst effektiv mod cancercellelinjer, Jurkat klon E6-1, MCF-7 og K-562, hvor IC

50 blev registreret i området på mindre end 1 IU /ml. Men den kommercielle L-asparaginase fra

Erwinia

er blevet rapporteret at have IC

50 på 7,5 til 10,0 IU /ml og af

E. coli

har IC

50 på 1,0 IE /ml på de tilsvarende cellelinjer [30]. I dette angår dette, kan L-asparaginase betragtes som mere potent og effektivt våben i kemoterapi af tumorer i forhold til de nuværende kommercielle præparater. denne L-asparaginase var også ikke-toksisk over for normale CHO-cellelinie og humane erythrocytter. Ca. 15-20% af patienterne behandlet med

E. coli

-afledt asparaginase udvikle overfølsomhed og toksicitet for lægemidlet [31] derfor denne L-asparaginase potentielt kunne være en bedre kandidat under fysiologiske betingelser.

Konklusioner

L-asparaginase fra

Bacillus licheniformis

RAM-8 var oprenset til tilsyneladende homogenitet og viste sig at være en homotetramer med molekylstørrelse på 134,8 kDa. Denne L-asparaginase er aktiv og stabil over bred vifte af temperatur og pH og specifik for det dets naturlige substrat

dvs..

L-asparagin. Biofysisk karakterisering konkluderede, at det er robust struktur α /β blandet protein. Den N-terminale sekvens af dette protein svarede ikke med det kendte og rapporterede L-asparaginase sekvens dermed protein er en ny. Denne L-asparaginase viste anticancerous effekt mod Jurkat klon E6-1, K-562 og MCF-7 cellelinjer og ikke-toksisk virkning mod hepariniseret blod eller CHO test cellelinje.

Tak

Forfattere takker Dr. TP Singh Institut for Biofysik, AIIMS for infrastrukturel støtte i N-terminal sekventering. Forfattere takke Rotary Blood Bank, New Delhi for at levere menneskeblod til forskning formål som gave.