PLoS ONE: et lille molekyle (Pluripotin) som et værktøj til at studere Cancer Stem Cell Biology: Bevis for Concept

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSC) menes at være ansvarlig for tumor vedligeholdelse og heterogenitet. Bona fide CSC oprenset fra tumor biopsier er begrænset i udbud, og det hæmmer studie af CSC biologi. Endvidere oprensede stamceller-lignende CSC subpopulationer fra eksisterende tumorlinier er ustabile i kultur. At finde et middel til at overvinde disse tekniske udfordringer vil være et nyttigt mål. I en første indsats for dette, vi undersøgt, om en kemisk sonde, der fremmer overlevelse af murine embryonale stamceller uden tilsatte eksogene faktorer kan ændre funktionelle egenskaber i bevarede tumor linier på en måde i overensstemmelse med en CSC fænotype.

Metode /vigtigste resultater

de syv tumor linjer i NCI60 colon undertavle blev udsat for SC-1 (pluripotin), en dobbelt-kinase og GTPase inhibitor, der fremmer selvfornyelse, og derefter undersøgt for tumorigenicitet under betingelser med begrænsende fortynding og klonogene aktivitet i blød agar. En statistisk signifikant stigning i tumordannelse efter SC-1 behandling blev observeret (p 0,04). Kloning effektivitet og udtryk af formodede CSC overfladeantigener (CD133 og CD44) blev også forøget. SC-1-behandling førte til sfære dannelse i nogle colon tumorlinjer. Endelig SC-1 hæmmes in vitro kinase aktivitet RSK2, og en anden RSK2 hæmmer øget kolonidannelse implicerer en rolle for denne kinase fremkalde en CSC fænotype.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater validerer en proof of concept studie eksponering af bevarede tumor linier til et lille molekyle kan give en medgørlige in vitro model for forståelse CSC biologi

Henvisning:. Mertins SD, Scudiero DA, Hollingshead MG, Divelbiss RD Jr, Alley MC, Monks A, et al. (2013) et lille molekyle (Pluripotin) som et værktøj til at studere Cancer Stem Cell Biology: Proof of Concept. PLoS ONE 8 (2): e57099. doi: 10,1371 /journal.pone.0057099

Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kina

Modtaget: Januar 30, 2012; Accepteret 22. januar 2013; Udgivet: 21 februar, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af afdelingen for Cancer Diagnose og behandling og Center for Cancer Research på National Cancer Institute og delvist finansieret af NCI Contract HHSN261200800001E. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dominic A. Scudiero, Anne Munke, og Karen M. Hite er tilknyttet SAIC -Frederick, en NCI-Frederick regering entreprenør. Der er ingen patenter, produkter i udvikling, eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Kræft stamceller (CSC) er en område af stor interesse for kræft biologer og menes at være ansvarlig for den langsigtede vedligeholdelse og udbygning af både faste og hæmatologiske tumorer [1], [2]. Under cancer stamceller hypotese, kan CSC forklare den observerede tumor heterogenitet, der minder om normal organudvikling og modstanden af ​​kræft til standardbehandling [3]. Signalveje såsom dem moduleret af Wnt, Hedgehog, og Notch er impliceret i den biokemiske karakterisering af CSC men er ikke konsekvent fundet i alle tumortyper. Desuden roller tumorens mikromiljø i reguleringen CSC fortsat være et område med intens undersøgelse [4].

Flere funktionelle assays forstås at repræsentere selv-fornyelse, proliferation og differentiering kapacitet forventes af CSC. Først begrænsende fortynding tumorigenisitetsforsøg analyser repræsenterer en standard metode til at identificere CSC. Denne in vivo-model benytter immundefekte mus inokuleret med tumor cellesubpopulationer, der er blevet udvalgt til ekspression af normalt væv stamceller celleoverfladeantigener [5] – [7]. Ved hjælp af samme model, kan sekundære xenografter etableres og op til fornyet overvejelse for transmission af den oprindelige tumor heterogenitet, hvilket yderligere bekræfter tilstedeværelsen af ​​CSC. En anden assay bruger sfære formation for at selektere for CSC udtrykkende stamcellemarkører og tumorigenicitet [8]. For det tredje har klonogene aktivitet i blød agar blevet anvendt til at definere CSC [9]. Andre analyser til rådighed til karakterisering CSC fænotyper fokusere på foranstaltninger af resistens, ubevægelighed, og modstand mod apoptose [10].

I nogle tumortyper, er CSC forventes at være en sjælden delpopulation og midlerne til at opretholde disse i kultur findes ikke på nuværende tidspunkt. En komplicerende faktor beskrevet af Gupta et al. viser, at efter berigende for og dyrkning af en CSC-lignende delpopulation i et bryst tumor linje, en fænotypisk ligevægt indeholder blandede subpopulationer afkast [11]. Udtrykte genotyper kan imidlertid anvendes til at forudsige de operationelle signaltransduktionsveje, der etablerer en CSC fænotype. Modulation af disse relevante veje ved kemiske sonder giver et middel til bedre at forstå CSC biologi. Baseret på dette rationale, undersøgte vi, om et lille molekyle, SC-1 (pluripotin), kunne modificere og /eller inducere karakteristika i overensstemmelse med CSC fænotype i de syv colon tumor linjer i NCI60 tumorlinien Panel.

SC-1 blev opdaget i en celle-baserede high throughput skærm, der vurderes, om et lille molekyle kunne opretholde selv-fornyelse af normale murine embryonale stamceller i fravær af exogent tilsat faktorer såsom leukæmi hæmmende faktor eller feeder-celler [12]. Den kemiske struktur er baseret på en 3,4-dihydropyrimido (4,5-d) pyrimidin stillads og blev optimeret gennem struktur /aktivitet undersøgelser. Affinitetskromatografi fastslået, at molekylære mål for SC-1 omfatter RasGAP og ERK1 /2, og deres hæmning menes at fremme selvfornyelse og hæmme differentiering.

I denne rapport, tilbyder vi en proof of concept studie til at bestemme hvorvidt SC-1 behandlede bulk-cellepopulationer af NCI60 colon tumorlinjer har egenskaber i overensstemmelse med en CSC fænotype. Vores resultater giver grundlag for at forfølge yderligere undersøgelser, der kunne bekræfte tilstedeværelsen af ​​CSC i en medgørlige in vitro model, fremmer forståelsen af ​​de biokemiske veje, der ligger til grund for CSC fænotyper, og afgøre, om SC-1 er et nyttigt redskab til at bevare tumor biopsi-afledte CSC i kultur.

Resultater

SC-1 Øget tumordannelse

Vi forbehandlet bulk-populationer af de syv colon tumor linjer i NCI60 panel med 0,1 uM SC-1 ( til kemisk struktur se fig S1), et lille molekyle, der tidligere vist sig at fremme selvfornyelse i murine embryonale stamceller [12]. Efter fem dages behandling blev med begrænsende fortynding tumorgenicitetsstudier udført under anvendelse subkutane injektioner uden protein støtte (tabel 1). Evaluering alle tumor linjer fra en enkelt undertavle af NCI60 vil hjælpe med at bestemme, om nogen virkning på grund af SC-1 er universel eller tumor line-afhængig. Fem af syv colon tumorlinjer udviste en højere tumor tage sats for SC-1 behandlede linjer sammenlignet med kontrol på 10.000 celle inokulum, med COLO 205 tumorlinie demonstrerer den største forskel i take rate (kontrol: 1 af 5 vs. SC-1 behandlet: 4 af 5) efterfulgt af HCT-116 og HT29 tumorlinjer. Det er også vigtigt at bemærke, at med så få som 100 celler, tumorer dannet i 2 af 5 mus injiceret med SC-1-behandlede HT29-celler sammenlignet med 0 af 5 for kontrol- behandlede celler. Der var en statistisk signifikant stigning i tumordannelse ved 1000 celle inokulum til HT29 behandlede celler samt (tabel 1). I modsætning hertil ingen tumorer udviklet med HCT-15 tumor linje til enhver fortynding (tabel 1), skønt tumorer dannet i 16 dage ved en rutinemæssig podning størrelse (1,5 × 10

6 celler pr inoculum).

Fordi kombinere tumor take rate (ved 10.000 celle inoculum) kan ligne en klinisk undersøgelse med patienten tumor heterogenitet, blev en statistisk analyse udført for at vurdere virkningen af ​​SC-1 på tumor tage satsen for colontumor linje undertavle. En signifikant forskel blev fundet (n = 7, Cochran Mantel-Haenzel fælles odds ratio, kontrol tumor tage rate: 10 af 35 mus; SC-1 behandlede take rate 19 af 35 mus, p = 0,04). Desuden er disse samme resultater plottet igen i grafisk form i figur S2. Hyppigheden af ​​tumorfremkaldende celler blev også beregnet og præsenteres for alle tumor linjer og de fleste SC-1 følsomme cellelinjer i figur S3.

De data, der viser øget tumor tage sats blev suppleret med den accelererede forekomsten af ​​målbare tumorer til SC-1 behandlede kolon tumor linjer, når beregnet ud fra plotte gennemsnitlig tumor vægt (op til 2000 mg) vs. tid for hver behandlingsgruppe (vifte af r for monteret linjer: 0.73-0.90). Ekstrapolering blev anvendt til bestemmelse af dagen, hvor en 1000 mg tumor ville forventes (tabel 2). Resultaterne og efterfølgende beregninger fandt, at 1000 mg tumorer i gennemsnit dannet efter forbehandling med SC-1 på mindre end halvdelen af ​​tiden for kontrollen behandlede gruppe (n = 5, parret Students t-test, middelværdi ± sem, SC-1 behandlet : dag 83 ± 19 vs. kontrol behandlet: dag 211 ± 79). Selv om denne forskel var ikke statistisk signifikant (p = 0,16), er det bemærkelsesværdigt, at for disse 5 tumorlinjer, tendensen var den samme:. Tidligere tidspunkt til 1000 mg tumor udseende i SC-1-behandlede celler i forhold til kontroller

det er ikke sandsynligt, at den observerede SC-1-induceret accelereret

in vivo

tumor vækst kunne forklare den øgede tumor tage på SC-1 behandlede tumor linjer, fordi et statistisk signifikant fald i celle tal efter

in vitro

SC-1 behandling blev observeret. (N = 6, parret Students t-test, p = 0,02, Tabel S1). Derudover var den gennemsnitlige GI

50 for colon-cellelinjer, når evalueret i NCI Anticancer skærm (2 dage eksponering), var 0,091 ± 0,07 uM (gennemsnit ± sem, n = 7, GI

50 (koncentration på som forbindelsen inhiberer 50% af kontrol cellevækst)), hvilket antyder en ensartet

in vitro

vækstinhibering blandt tumorlinjer. Endelig i et repræsentativt SC-1 sensitive tumor line (HCT-116), var der ingen forskel i fordelingen af ​​SC-1 behandlede cellepopulation tværs cellecyklussen sammenlignet med kontrol behandlede celler (fig S4).

for at undersøge manglen på en tumorigen virkning for SC-1-behandlede HCT-15 celler, blev begrænsende fortynding tumorigenicitet assay gentages med tilsætningen af ​​Matrigel til de injicerede celler (10, 100, 1000 og 10000 celler pr injektion). Et protein støtte såsom Matrigel kan tilvejebringe forankring, et substrat for angiogenese og vækstfaktorer. I dette tilfælde, som det ses tidligere [7], så få som 10 celler var nødvendige for at danne tumorer (tage rate 2 af 5 mus), når HCT-15 kontrolceller blev co-injiceret med Matrigel. For SC-1-behandlede celler co-injiceret med Matrigel, 5 af 5 mus havde tumordannelse i de 99 dage lange observationsperiode på 10 celler inokulum (figur 1). På den resterende cellemasse inokula (100, 1000 og 10000 celler pr injektion med Matrigel), tumorer dannet i alle mus, uanset eksperimentel behandling.

begrænsende fortynding tumorigenicitet assay blev udført med samtidig injektion af Matrigel. A. Kontrol behandlet HCT-15 tumor linje. B. SC-1 behandlede HCT-15 tumor linje. Tumorvægt for hver mus er afbildet. Tumordannelse blev forøget i SC-1 behandlede celler, når 10 celler /mus blev injiceret (SC-1 behandlet: 5 af 5 tumorer dannet, Kontrol behandlet: 2 af 5 tumorer dannet). Ved højere celle inokula alle mus dannede tumorer uafhængig af behandlingen. Hver linje i begge grafer repræsenterer en vækst på én tumor pr mus (A. A-E, B. F-J).

Kloning Effektivitet blev Øget Efter SC-1 Behandling af Colon Tumor Lines

Fordi forstærket klonogene kapacitet i blød agar har været forbundet med CSC afledt af patientens CNS og prostatatumorer [9], [13], var det af interesse at vurdere, om SC-1 behandlede kolon tumorlinjer ligeledes påvirket. De 3 tumorlinier med den største SC-1-induceret tumordannelse (COLO 205, HCT-116, og HT29) havde betydelige stigninger i kloningseffektiviteter (figur 2A, n = 3, parret Students t-test, p = 0,001 (COLO 205, HCT-116) og p = 0,01 (HT29)) som gjorde HCC-2998 og KM12 tumorlinjer. Det er bemærkelsesværdigt, at alle tumorlinier var steget klondannelseseffektivitet følgende SC-1 behandling, hvis assayet blev udført under anvendelse Matrigel stedet for blød agar (data ikke vist). Således er SC-1 sig at forøge kolonidannelse

in vitro

.

colon tumorlinjer blev behandlet i fem dage med 0,1 uM SC-1, høstet og analyseres derefter for deres evne til at danne kolonier i blød agar, aendre ekspressionen af ​​formodede CSC overflademarkører, og til at danne sfærer. A. kloningseffektivitet af tyktarmen tumorlinjer blev bestemt efter behandling med SC-1. I 5/7 tumorlinjer, SC-1-behandlede celler havde statistisk signifikante stigninger i kumulativ kolonidannende enhed (CFU) masse sammenlignet med kontrolgrupper behandlet celler (*** p lt; 0,001, ** p 0,1 * p 0,05, n = 3). I ét tilfælde (# p 0,05), SC-1 behandling reducerede kloning effektivitet. B. CD133 positive subpopulation blev forøget 2,5 gange i SC-1 behandlede HT29 colontumor linje (p = 0,03, n = 3). CD44 + CD24- subpopulation blev forøget efter SC-1 behandling i HCT-116 colon tumor linie (* p 0,05, n = 3). CD44 + subpopulationen blev signifikant øget efter SC-1 behandlinger (* p 0,05, n = 3) i SW-620 colon tumor linje. C. Tre tumorlinier (COLO 205, HCT-116, HT-29) udformet adhærerende kugler i nærvær af 0,1 uM SC-1 dyrket i standard medier indeholdende 5% FBS. Disse observationer var også tydelig på dag 5 i kultur. Alle billeder blev forberedt ved 400 × forstørrelse.

Expression af formodede CSC Markers blev Øget i Colon Tumor Lines efter SC-1 behandling

monoklonale antistoffer specificerer overfladeantigener på frisk isolerede tumorprøver er blevet anvendt som redskaber til at isolere CSC. For eksempel, O’Brien et al. [6] og Ricci-Vitiani et al. [14] oprenset CSC fra kolorektale tumorer via den glycosylerede CD133 epitop. Andre CSC markører indbefatter CD44 (enten i nærvær eller fravær af CD24), CD326, CD166 og [5], [9], [15] – [18]. Således blev ekspressionen af ​​disse markører undersøgt efter fem dages SC-1 behandling.

En statistisk signifikant stigning i antallet af celler, der udtrykker CD133 glycosylerede epitop blev fundet for HT29 tumor line efter SC-1 behandling (figur 2B, n = 3, parret tosidet Student t-test, p = 0,003, middelværdi ± sem, kontrol behandlet: 11,6 ± 3,7% positive, SC-1 behandlet: 27,6 ± 3,6% positive). I SW-620 tumor linje blev CD44 subpopulation øget efter behandling med SC-1 (figur 2B, n = 3, parret Students t-test, p = 0,03, gennemsnit ± sem, kontrol behandlet: 39,6 ± 8,5% positive, SC -1 behandlet: 74,1 ± 13,4% positive). Ingen øget ekspression af de formodede CSC markører var tydelig for COLO 205 tumorlinie (a SC-1 sensitive tumor linje). Ingen ændringer i CD326 og CD166 overfladeekspression blev observeret for nogen af ​​de tumorlinjer. Således forekom ændring i ekspression af visse CSC overflademarkører følgende SC-1 behandling i kolon tumorlinjer varierede med tumoren linje.

dannede kugler Efter SC-1 Behandling

Sphere dannelse er en CSC karakteristisk, uanset om stammer fra patientens tumorer [18] eller bevarede tumor linier af hjernen, bryst, eller hud dyrket under serumfri betingelser [8]. SC-1 behandlede colontumor linjer blev undersøgt for kugle-dannelse under anvendelse celledensiteter tidligere publicerede [19], [20] og i nærvær af serum. Fordi serum menes at indeholde differentierende stoffer [21], kan denne analyse betragtes strengere end andre [22]. I HCT-116 og HT29 tumorlinjer, ensartede adhærerende kugler med veldefinerede grænser dannet i 24 timer (Figur 2C) på trods af tilstedeværelsen af ​​serum. Derudover sfære dannelse forekom i en brøkdel af den dyrkede COLO 205 tumorlinie (figur 2C). Disse samme ændringer i morfologi var også til stede på dag 5 efter behandling (data ikke vist). I de resterende tumorlinjer blev sfære dannelse fundet i koncentrationer højere end dem testet her (data ikke vist). Kuglen formation assay blev gentaget under anvendelse af serumfrie betingelser og lignende resultater blev opnået (figur S5).

SC-1 Behandling Nedsat Phospho-ERK1 /2-og Øget OCT4 proteinekspressionsniveauer Salg

En tidligere rapport [12] viste, at SC-1 hæmmede phospho-ERK1 /2 protein niveauer efter 30 minutters eksponering i murine embryonale stamceller resulterer i vedligeholdelse af selvfornyelse

in vitro

uden lymfocyt hæmmende faktor eller feeder-celler. For at bestemme om SC-1 nåede det samme mål i de behandlede colontumor linjer, blev ændringer i overflod af phospho-ERK 1/2 (p-ERK) og total ERK1 /2-protein evalueret ved immunoblotting på tidspunkter svarende til dem, der tidligere undersøgt (figur 3A). I HT29 behandlede tumor line, phospho-ERK 1/2 proteinniveauer (i forhold til de samlede ERK1 /2 proteinniveauer) var nedsat i 5 min (67 ± 0,06% af kontrolværdien), nåede et lavpunkt på 1 time (46 ± 0,06 % af kontrol), og forblev faldt under resten af ​​tidsforløbet (4 timer, 68 ± 0,10% af kontrolværdien). Det er således sandsynligt SC-1 er ved at nå dets beslægtede molekylære mål i HT29 tumor linje.

Colon tumorlinjer blev behandlet med SC-1 (0,1 pM), høstet, lyseret og probet for proteinerne ifølge interesse efter elektroforese i SDS-PAGE-geler i de angivne tidspunkter. A. I SC-1 behandlede HT29 tumor line, phospho-ERK1 /2 /total ERK1 /2 proteinniveauer blev reduceret til 67 ± 0,06% af kontrol ved 5 min, 56 ± 0,06% af kontrolværdien på 30 min, og 46 ± 0,06% af kontrol værdi på 1 time (n = 3, p 0,05). B. Forøget OCT4 proteinekspression grund SC-1 var afhængig af tumoren linje. Repræsentative forsøg er vist for figur S4A-B (n = 2).

Øget i OCT4 proteinekspression i SC-1 behandlede kolon tumor linjer ville være i overensstemmelse med identifikationen af ​​SC-1 i en celle-baseret skærm, der opdages opretholdelsen af ​​en OCT4-medieret GFP signal i muse embryonale stamceller vokser uden eksogene faktorer eller feeder-celler [12]. OCT4 er en transkriptionsfaktor vigtige for fosterudviklingen, regulerer pluripotens [23]. Derfor ændringer i Oct4 proteinniveauer efter eksponering for SC-1 blev evalueret. I 2 af de 7 colontumor linjer (HCC-2998 og HT29), blev OCT4 proteinekspression forøget med SC-1-behandling (figur 3B). For de resterende tumor linjer, OCT4 proteinekspression var uændret eller faldet. Den varierende effekt af SC-1 på OCT4 proteinekspression korrelerede ikke med tumordannelse. Derfor er det usandsynligt OCT4 spiller en vigtig rolle i de observerede SC-1 effekter.

SC-1 Hæmmet RSK2

In Vitro

og en RSK2 Inhibitor Øget Colony Formation

en bioinformatisk sti analyse [24], [25] af gener, der korrelerede med NCI60 GI

50 fingeraftryk for SC-1 foreslået en rolle for RSK2 og dets regulerende aktivitet i mTOR pathway. RSK2 (90 kD ribosomal S6 kinase), en kinase med både en N- og C-terminale funktionelle domæner, phosphorylerer flere mål og phosphoryleres af ERK1 /2, en anden SC-1-mål. Som en nedstrøms effektor, RSK2 signaler mange cellulære adfærd, herunder celle overlevelse, vækst, proliferation og migration [26]. Det er også bemærkelsesværdigt, at en kongener af SC-1 er blevet co-krystalliseret med Bcr-ABL1 kinase [27], hvilket antyder, at SC-1 kan have andre molekylære mål. Vi undersøgte, om SC-1 kunne hæmme

in vitro

kinase aktivitet RSK2 og fundet en EF

50 på 2,5 ± 1,8 pM (figur 4A, EF

50, koncentration, hvor de sammensatte hæmmer 50% af kontrolaktivitet, n = 5). Potentiel inhiberende aktivitet af SC-1 på et tilfældigt udvalg af andre proteinkinaser (Aurora kinase B, Chk1, og Chk2) blev også evalueret i det samme assay, og ingen virkning blev fundet (figur 4A). For at bestemme om aktiviteten af ​​beslægtede (til RSK2) proteinkinaser i AGC-kinase familien blev inhiberet af SC-1, blev yderligere studier udført (tabel 3). Ingen hæmmende effekt på kinaseaktiviteten blev fundet for Akt1, PKA, og PKC ved eller under den testede maksimale koncentration (10 uM); dog SC-1 var hæmmende for p70S6K (1,4 uM IC

50). Fordi SC-1 inhiberede disse udvalgte kinaser i det mikromolære område og kinaseassay adskiller sig fra den ene rapportering Dataene i figur 4A, blev den positive EF

50 værdi for Abl1 kinase rapporteret i tabel 3 samt. Disse resultater var i overensstemmelse med forudsigelser rapporteret af OKRAM et al. [27].

COLO 205 tumorcellelinie blev behandlet med SL0101 (1,25 uM) og SC-1 (0,1 pM) i 24 timer forud for blød agar kloning, lysat forberedelse, og immunblotting. A. SC-1 inhiberede RSK2 N-terminale domæne

in vitro

kinaseaktivitet med en EF

50 på 2,5 ± 1,8 um (middelværdi ± SD, n = 5), men ikke i andre lignende assays for Aurora kinase B, Chk1, eller Chk2 kinaser. B. Nedsat RSK2 proteinniveauer (33%) blev fundet hos 5 dage efter SC-1 behandling i COLO 205 tumor linie (n = 2). C. Behandling (24 timer) af COLO 205 tumorlinie med SL0101, en kaempferol glycosid RSK2 inhibitor, øget kolonidannelse (≥60 um) i blød agar (n = 2, repræsentativt eksperiment vist).

Da SC-1 hæmmede RSK2 kinase aktivitet, vi først bestemmes, hvis RSK2 protein niveauer blev ændret. Efter 5 dages eksponering for 0,1 uM SC-1, blev RSK2 proteinniveauer faldt betydeligt 33% i COLO 205 tumorlinie (p = 0,007, n = 3, figur 4B).

Hvis RSK2 spiller en rolle i cellesignalerende afgørende for CSC fænotype, ville det forventes, at øget kolonidannelse ville forekomme efter behandling med en kendt RSK2 inhibitor. Med henblik herpå blev COLO 205 tumorlinie behandlet med SL0101, en kaempferol glycosid med ingen aktivitet mod MEK, Raf, eller PKC [28], i 24 timer forud for kloning i blød agar og vurderet for kolonidannelse 7 dage senere. Statistisk signifikante stigninger i kolonidannelse blev fundet på 1,25 uM behandling og på alle plating tætheder (figur 4C, n = 3, parret to tailed Students t-test, p = 0,05). For SC-1 behandlede celler på denne forkortede eksponering (24 timer (Figur 4C) vs. 5 dage (figur 2A)), blev forøget kolonidannelse findes kun på højeste udpladningsdensitet.

Diskussion

Bulk populationer af colontumor linjer fra NCI60 Panel blev udsat for et lille molekyle, som giver selvfornyelse egenskaber og undersøgt for karakteristika i overensstemmelse med CSC fænotype. Forbehandling med SC-1 steg tumorigenicitet ved lav celle inokula i HT29 og HCT-15 tumorlinjer. Kloning i blød agar blev forøget i de fleste tumorlinjer. Andelen af ​​celler, der udtrykker CD133 og CD44, formodede CSC overfladeantigener, blev forøget. Sfære dannelse i respons på SC-1-behandling blev også observeret under serum indeholdende og serumfri betingelser. For at bekræfte, at SC-1 blev ændre dets beslægtede molekylære mål, protein ekspression af phospho-ERK1 /2 blev målt og viste sig at falde efter 5 min og op til 4 timer efter eksponering. Ekspression af OCT4, en transkriptionsfaktor, der opretholder pluripotens i normale embryonale stamceller, blev forøget i nogle (2/7) af de tumorlinjer efter SC-1 behandling. SC-1 hæmmede RSK2

in vitro

kinase aktivitet. Et resultat er i overensstemmelse med dette fund, en anden RSK2 inhibitor øge clonogenicity af et kolon tumor linje, impliceret dette protein som en kandidat molekylært mål mægle CSC fænotype.

Resultaterne af denne proof of concept studie, der spørger, om en lille molekyle kan ændre og /eller inducere karakteristika i overensstemmelse med CSC fænotype i kolon tumor linier støtter muligheden for at benytte et lille molekyle at etablere en

in vitro

model af CSC biologi. HT29 tumor linje viste sig at være den mest SC-1 følsomt, eftersom tumorer kunne findes med så få 100 SC-1 behandlede celler, blev clonogenicity forøget, sfærer dannet under betingelser, som normalt begrænser en sådan morfologi og under betingelser, der var tolerante, og ekspression af CD133 og OCT4 blev øget. Således er foreslået en række muligheder for at forske CSC biologi. Først kan oprenses SC-1-behandlede colon tumor line subpopulationer udtrykker formodede CSC antigener, derefter igen undersøgt for karakteristika i overensstemmelse med CSC fænotype at forbedre

in vitro

model. Det ville også være af interesse at bestemme, om SC-1 kan opretholde en formodet HT29 CSC subpopulation i langvarig kultur, overvinde den fænotypiske ligevægt beskrevet for ustabile stilk-lignende subpopulation identificeret i SUM159 brysttumor linje [11]. Alternativt kan stamme-lignende celler, som findes i SUM159 brysttumor linje blive udsat for SC-1 at bestemme, om subpopulationen vender tilbage til dets blandede ligevægt af stamceller-lignende og ikke-stamceller-lignende celler eller opretholdes som stamme-lignende. Og endelig, som oprindeligt foreslået, tumor biopsi afledt CSC kunne behandles med SC-1 at afgøre, om der stadig er fænotype.

Ryd identifikation af subpopulationen eller subpopulationer påvirket af SC-1 kunne ikke bestemmes her, fordi bulk-populationer af tumorlinjer blev behandlet. For at øge sandsynligheden for at demonstrere en SC-1 effekt, blev udnyttet heterogene tumor linjer. Således er det muligt, at enten SC-1 opretholdt CSC karakteristika allerede eksisterende i colon tumor linjer eller biokemisk etablerede de funktionelle parametre målt

de novo

. Hvis sidstnævnte er tilfældet, er resultaterne understøtter forestillingen om, at CSC fænotype er plast [29].

Det er vigtigt at bemærke, at en SC-1 effekt ikke var konsistent på tværs af de syv kolon tumor linjer (tabel 4 ). For eksempel blev samlet tumorigenicitet af SC-1-behandlede tumorceller steg betydeligt ved 10000 celleinokulum men i hvilken grad dette skete afhang af tumoren linje og betingelserne for tumorigenicitet assay. HT29 behandlede tumor linje blev betragtet som den mest SC-1 sensitive cellelinje, fordi kun 100 celler var påkrævet til at danne tumorer, mens, under de samme begrænsende betingelser (fravær af et protein support), HCT-15-tumorceller var ude af stand til at danne tumorer, selv i kontrol forhold og 10000 celle inokulum. Tilsætningen af ​​Matrigel til både kontrol og behandlet HCT-15 tumor line forbedret tumorigenicitet og demonstrerede en SC-1 effekt på 10 celler inokulum. Om Matrigel var simpelthen en fælde mekanisme, en levering af vækstfaktorer, eller en egnet matrix til angiogenese er ikke klart på dette tidspunkt og afventer yderligere undersøgelse. Endvidere til den kritiske krav til Matrigel for HCT-15 tumor line vokse

in vivo

antyder, at receptorer, såsom integriner som binder ekstracellulære matrix-komponenter og signal celleoverlevelse kan være afgørende for at studere CSC biologi. Det er bemærkelsesværdigt, at integrinreceptorer er formodede CSC overflademarkører [30], [31]; SC-1 kan modulere disse receptorer.

Det er vigtigt, selv om, ikke eksisterer en ensartet definition af CSC overflademarkører [32], [33]. Formodede CSC overflademarkører blev evalueret efter SC-1 eksponering i kolon tumor linjer og eventuelle ændrede udtryk var ikke universel, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. Men CD133, en bemærkelsesværdig og fælles kolon CSC markør i biopsiprøver, blev øget ca. 2 gange i behandlede HT29 tumor linje. Endvidere HT29 tumor linje var den mest SC-1 følsomme linje med hensyn til tumorigenicitet. Derfor kan SC-1 udsat HT29 tumor linje være en passende model for CSC, der udtrykker CD133. Men i summarisk, forbliver det muligt, at mekanistisk, SC-1 effekt på CSC karakteristika generelt og overflademarkør virkning, specifikt kan afhænge af den underliggende genetiske og epigenetiske heterogenitet og ikke alle tumorlinier udsat for SC-1 vil blive nyttige

in vitro

modeller. Tilsammen dataene i denne rapport støtter den opfattelse, at dæmme-lignende egenskaber er ikke kun heterogene mellem tumortyper, men også mellem tumorer, der opstår fra den samme organ som angiver, at der er betydelig plasticitet i dannelsen af ​​CSC yderligere.

SC-1 eksponering inducerede ikke klæbende sfære dannelse og i næsten alle celler i HT29 og HCT-116 tumor linjer på 0,1 uM testede dosis. Dette assay blev udført anderledes end tidligere rapporter [19], [20] ved at udnytte kalvefosterserum og væv dyrkningsbeholdere, der letter celleadhærens og som kan anses strengere eftersom serum kan inducere differentiering [21]. Yderligere undersøgelser, hvor serum og vedhængende overflader blev fjernet, bekræftede denne konklusion. Tilsammen tyder disse resultater på, at SC-1 kan være fremme en af ​​de nødvendige processer for metastase, løsrivelse fra den primære tumor. Hvorvidt teser trin er i overensstemmelse med definitionen af ​​en cancer stamcelle er ikke klart på nuværende tidspunkt, men foreslår en rolle for SC-1 i EMT overgang [34].

Det er sandsynligt, at SC-1 er ved at nå på mindst en af ​​dens rapporterede molekylære mål (ERK1 /2) [12], da så tidligt som 5 min efter eksponering er forholdet mellem phospho-ERK1 /2 til total ERK1 /2 proteinniveauer blev reduceret i HT29 tumor linje. Endvidere lipofile natur SC-1 (målt ved log P) foreslog, at den er i stand til at krydse cellemembranen. Mens forventes MAPK signalering at fremme vækst og dets hæmning ville være antitumorigenic [35], den dynamiske karakter af ERK1 /2 hæmning og andre kendte og ukendte mål for SC-1 kan fremme de funktionelle egenskaber, vi studerede.

virkningsmekanismen af ​​SC-1 er ukendt på dette tidspunkt og vi igangsat undersøgelser udnytte de offentligt tilgængelige data, genekspression profiler i NCI60 Anticancer Drug Screen [24], [25] for at undersøge dette. Især en bioinformatik pathway analyse af gener, der korrelerede med SC-1 NCI60 GI

50 gennemsnitlig graf foreslog en rolle for mTOR pathway ved modulering af de observerede væksthæmmende effekter (

in vitro

) med RSK2 inkluderet i mTOR pathway [26]. I to separate

in vitro

kinase inhiberingsassays, RSK2 blev hæmmet af SC-1. Når endvidere COLO 205 tumor linje blev udsat for en kendt RSK2 inhibitor (SL0101 ved lav koncentration), forøget klonogene aktivitet blev observeret; derved antyde RSK2 måske, i hvert fald, at spille en rolle i at fremme clonogenicity. Men den

in vitro

EF

50 2,5 uM overstiger koncentrationen af ​​SC-1 (0,1 uM) anvendt i alle undersøgelser præsenteres her. Denne modsigelse kan forklares ved en langsom kataboliske hastighed på SC-1 eller transport parametre, der koncentrerer SC-1 intracellulært til niveauer nærmer den målte EF

50. [40].