PLoS ONE: TMEFF2 Er en PDGF-AA bindende protein med Methylering-associerede Gene Silencing i flere kræfttyper Herunder Glioma

Abstrakt

Baggrund

TMEFF2 er et protein, der indeholder en enkelt EGF-lignende domæne og to follistatin-lignende moduler. Den biologiske funktion af TMEFF2 fortsat uklart med modstridende rapporter tyder både en positiv og en negativ sammenhæng mellem TMEFF2 udtryk og menneskelige kræftformer.

Metode /vigtigste resultater

Her er vi rapportere, at det ekstracellulære domæne af TMEFF2 interagerer med PDGF-AA. Denne interaktion kræver aminoterminale region af det ekstracellulære domæne indeholder Follistatin moduler og kan ikke medieret af det EGF-lignende domæne alene. Endvidere det ekstracellulære domæne af TMEFF2 interfererer med PDGF-AA-stimuleret fibroblastproliferation på en dosis-afhængig måde. TMEFF2 udtryk nedreguleres i humane hjerne kræft og er negativt korreleret med PDGF-AA udtryk. Undertrykt udtryk for TMEFF2 er forbundet med dets hypermethylering i flere humane tumorer, herunder glioblastom og kræft i æggestokkene, rektal, kolon og lunge oprindelse. Analyse af gliom undertyper indikerer, at TMEFF2 hypermethylering og reduceret ekspression er forbundet med en delmængde af ikke-Proneural gliomer, der ikke viser CpG island methylator phentoype.

Konklusioner /Signifikans

Disse data giver den første bevis for, at TMEFF2 kan fungere til at regulere PDGF signalering og at den er hypermethyleret og nedreguleres i gliom og flere andre kræftformer, hvilket tyder en vigtig rolle for dette protein i ætiologien af ​​humane cancere

Henvisning:. Lin K, Taylor JR Jr, Wu TD, Gutierrez J, Elliott JM, Vernes JM et al. (2011) TMEFF2 Er en PDGF-AA bindende protein med Methylering-associerede Gene Silencing i flere kræfttyper Herunder gliom. PLoS ONE 6 (4): e18608. doi: 10,1371 /journal.pone.0018608

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: December 1, 2010; Accepteret: 7 marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Genentech. Det bidragyder havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere var medarbejdere i Genentech, når dette arbejde blev udført. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

TMEFF2, også kendt som tomoregulin [1], TPEF [2], HPP1 [ ,,,0],3] og TENB2 [4], koder for et transmembrant protein, der indeholder en enkelt epidermal vækstfaktor (EGF) -lignende domæne og to follistatin-lignende moduler [1], [4] – [6]. Den biologiske funktion af TMEFF2 stadig undvigende med modstridende rapporter fra forskellige grupper. Der er rapporteret Opløselige former af TMEFF2 ekstracellulære domæne til svagt stimulere erbB-4 /HER4 tyrosinphosphorylering i MKN 28 gastriske cancerceller [1], og fremme overlevelsen af ​​mesencephaliske dopaminerge neuroner i primær [6] kultur. Som bevis for sin positive rolle i celledeling, har forhøjet TMEFF2 udtryk været forbundet med højere prostatakræft kvalitet og hormon uafhængighed ved flere grupper [4], [7], [8]. I modsætning hertil har andre rapporteret nedregulering af TMEFF2 i androgen-uafhængig prostatacancer-xenotransplantater, samt vækstinhibering fremkaldt af ektopisk ekspression af TMEFF2 i androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinier [5]. Desuden er 5′-regionen af ​​TMEFF2 genet hyppigt hypermethyleret i nogle kræftformer [2], [3], [9] -. [16], hvilket tyder på en mulig tumor suppressor rolle TMEFF2 i disse kræftformer

blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF’er) ikke kun spille en vigtig rolle i udviklingsmæssige og fysiologiske processer, men også direkte impliceret i human cancer og andre proliferative lidelser (revideret i [17] og [18]). Det humane genom indeholder fire PDGF-ligander, PDGF-A, B, C og D, og ​​to receptorer, PDGFRα og PDGFRβ Alle PDGF’er kan danne funktionelle disulfidbundne homodimerer, mens kun PDGF-A og B er blevet vist at danne funktionelle heterodimerer. PDGFRs fungerer også som homo- og hetero-dimerer, der adskiller sig i deres tilhørsforhold til forskellige PDGF dimerer (revideret i [17] og [18]). Den α-underenheden af ​​PDGFR er blevet vist at binde PDGF-A, B og C-kæder, hvorimod β subunit menes at binde kun B og D kæder. De biologiske responser induceret af de forskellige PDGF-ligander afhænger af de relative antal af de receptor-underenheder på en given celletype og de specifikke PDGF dimerer stede.

follistatin modul-holdige proteiner er blevet tidligere vist at være i stand til at binde og modulerer funktionen af ​​en række vækstfaktorer, herunder medlemmer af transformerende vækstfaktor beta (TGF-β-familien, PDGF’er og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [19] – [24]. til dato er der imidlertid ingen bindingspartner er blevet rapporteret for TMEFF2. i denne rapport har vi identificeret PDGF-AA som en vækstfaktor, som interagerer med TMEFF2. Desuden viser vi, at det ekstracellulære domæne af TMEFF2 forstyrrer PDGF-AA-stimuleret fibroblast proliferation i en dosisafhængig måde . Vores data giver det første bevis på, at TMEFF2 kan fungere til at regulere PDGF signalering, og give ny mekanistisk indsigt i de tilsyneladende modstridende roller TMEFF2 i humane kræftformer. Derudover viser vi for første gang, at ekspressionen af ​​TMEFF2 nedreguleres i gliom og flere andre kræftformer, og at denne nedregulering korrelerer med DNA methylering. Sammen antyder disse data en vigtig rolle TMEFF2 i udviklingen og progressionen af ​​menneskelige kræftformer.

Resultater

Det ekstracellulære domæne af TMEFF2 interagerer med PDGF-AA

TMEFF2 forudsiges til at indeholde et transmembrandomæne (TM) domæne med en aminoterminal (NT) signalpeptidsekvens (SP) (fig. 1A). Rekombinante proteiner indeholdende det ekstracellulære domæne (ECD) i TMEFF2 fusioneret til et FLAG-mærke (TECD-FLAG) eller Fc-delen af ​​det humane immunoglobulin gamma (hFcγ (TECD-Fc) ved carboxyterminalen (CT) blev udtrykt i pattedyrceller og oprenset fra cellekultursupernatanter (fig. 1B). det oprensede TECD-FLAG og TECD-Fc løb på det forudsagte ~55 kDa og -70 kDa på SDS PAGE under reducerende betingelser, (fig. 1c). NT sekventering af oprensede proteiner afslørede at signalpeptidet blev spaltet mellem resterne 40 og 41 i begge rekombinante proteiner (fig. 1d).

(A) Hydropatiafbildning af TMEFF2 protein baseret på algoritmen ifølge Kyte og Doolittle [53] og den forudsagte domæne struktur baseret på NT-sekventering af det rekombinante TECD i denne undersøgelse og Horie et al., 2000 [6]. SP, signal peptid; FS I, follistatin-lignende domæne I; FS II, follistatin-lignende domæne II; EGF, epidermal vækstfaktor-lignende domæne; TM, transmembrane domæne; N-Gly, potentielle steder for N-bundet glycosylering; GAG, potentielt sted af glycosaminoglycan binding. (B) Skematisk fremstilling af den rekombinante TECD-FLAG og TECD-Fc-fusionsproteiner på linie med den fulde længde TMEFF2 (TMEFF2-FL). (C) Oprenset TECD-FLAG og TECD-Fc blev analyseret ved SDS-PAGE under reducerende betingelser med Coomassie blue-farvning. (D) NT-sekventering af det oprensede TECD-FLAG og TECD-Fc afslørede kløvningssted signalpeptidet. Aminosyresekvensen identificeret ved NT sekventering er understreget. Pilespids angiver signalpeptidspaltningsstedet.

Siden follistatin (FS) modul-holdige proteiner er blevet vist at interagere med PDGF-ligander [19] undersøgte vi evnen af ​​hver af de 3 dimere former af PDGF-ligander, PDGF-AA, BB og AB, til at interagere med ECD af TMEFF2 hjælp enzymmaerket Assays (ELISA). Ved hjælp af en biotinyleret anti-PDGF-A antistof, observerede vi en dosisafhængig binding, når 1 til 10 ng /ml PDGF-AA blev tilsat til den immobiliserede TECD-FLAG. En svag binding blev påvist under anvendelse af PDGF-BB og et biotinyleret anti-PDGF-B-antistof, hvorimod ingen signifikant binding blev detekteret for PDGF-AB ved hjælp af biotinyleret anti-PDGF-A antistof (fig. 2A). Mens der var kun en svag baggrund binding mellem PDGF-AA og de ikke-coatede plastbrønde, bindingen af ​​PDGF-AA til immobiliseret TECD-FLAG var sammenligneligt med dets binding til et immobiliseret anti-PDGF antistof under de samme betingelser (fig. 2A) . Ingen specifik binding blev detekteret for en række andre proteiner undersøgt, herunder EGF-receptoren familiemedlemmer (EGFR, HER2, HER3 eller HER4) og tumornekrosefaktor-receptor (TNFR) fusioneret til hFcγ. Desuden blev ingen signifikant binding detekteret mellem TMEFF2 ECDs selv når TECD-Fc blev anvendt som en analyt. Som en positiv kontrol, et anti-FLAG monoklonalt antistof udviste dosisafhængig binding til TECD-FLAG-coatede brønde Fig. 2B).

(A) Binding af dimer PDGF ligander til TECD-FLAG coatede brønde. PDGF-AA, blev AB eller BB anvendt på TECD-FLAG coatede brønde (faste symboler) eller tomme brønde (åbne symboler) og påvist med biotinyleret anti-PDGF-A (for PDGF-AA AB) eller PDGF-B (for PDGF-BB) antistoffer efterfulgt af streptavidin-HRP. Anti-PDGF pAb overtrukne brønde blev anvendt som en positiv kontrol for PDGF-AA binding (x). (B) Binding af seks rekombinante Fc-mærkede ECDs og et anti-FLAG-mAb til TECD-FLAG coatede brønde. HRP-konjugeret anti-muse og anti-humane Fcy blev anvendt til at detektere anti-FLAG-mAb og Fc-mærkede proteiner, henholdsvis. (C) TECD-Fc blev anvendt til brønde overtrukket med PDGF-AA, AB eller BB og detekteret med HRP-konjugeret anti-humant Fcy. (D) TECD-Fc og andre Fc-mærket ECD af forskellige transmembrane proteiner blev påført PDGF-AA coatede brønde og detekteret med HRP-konjugeret anti-humant Fcy. TNFR, tumornekrosefaktor-receptor; PDGFRβ, PDGF receptor β; mOX40, murine OX40. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser mellem dubletter. Repræsentative grafer af mindst tre uafhængige forsøg er vist.

For at bekræfte, at bindingen observeret er faktisk på grund af samspillet mellem PDGF-AA og TMEFF2-ECD, så immobiliseret vi PDGF ligander på pladerne og anvendt TMEFF2-ECD fusioneret til et andet mærke, TECD-Fc, som en analyt. I overensstemmelse med resultaterne opnået med immobiliseret TECD-FLAG, TECD-Fc udviste signifikant dosis-afhængig binding kun til immobiliseret PDGF-AA, men ikke AB, BB, CC eller DD (fig 2C,.. Supplerende Fig S1A). Lignende resultater blev opnået under anvendelse etiketten fri ForteBio platform (Menlo Park, CA) til måling af PDGF-binding til biotinyleret TMEFF2-FLAG immobiliseret på streptavidin-coatede sensor. PDGF-AA, blev den stærkeste binding til TMEFF2 mens PDGF-BB, AB, CC, og DD viste stærkt reduceret affinitet (data ikke vist). Rekombinant opløselig PDGF-receptor α ekstracellulære domæne (sRa), på den anden side viste dosisafhængig binding til alle 3 immobiliseret PDGF dimerer AA, AB og BB (supplerende fig. S1B), hvorimod PDGF-receptor βECD-Fc (PDGFRβ- Fc) fusionsprotein var ikke i stand til at binde PDGF-AA (fig 2D), i overensstemmelse med den rapporterede specificitet af disse receptorer [25] – [27].

TMEFF2 interagerer med PDGF-AA gennem FS modul. holdig region når det udtrykkes på overfladen af ​​pattedyrceller

for at bestemme om ECD af TMEFF2 kan interagere med PDGF-AA, når det udtrykkes på overfladen af ​​pattedyrceller, vi transficerede 293-celler med konstruktioner indeholdende fuldlængde TMEFF2 (TMEFF2-FL), eller en trunkeret TMEFF2 uden det intracellulære domæne (TMEFF2-ΔICD) (fig. 3). PDGF-AA eller PDGF-AB blev derefter tilsat til dyrkningsmediet og får lov at binde til celleoverfladen i 30 minutter. Ubundne PDGF-ligander blev efterfølgende vasket væk og cellelysater blev underkastet immunpræcipitation med enten et polyklonalt antistof (pAb) anerkendelse både PDGF-AA og AB dimerer, eller et pAb anerkender ECD af TMEFF2. Som vist i fig. 3 supplerende Fig. S8, et anti-PDGF-A antistof kunne detektere denatureret PDGF-A monomer i de anti-PDGF immunopræcipitater fra celler inkuberet med enten PDGF-AA eller PDGF-AB, hvilket antyder, at begge PDGF-dimerer bundet til celleoverfladen, enten gennem interaktioner med specifikke receptorer eller ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Imidlertid blev PDGF-A påvist i anti-TMEFF2 immunpræcipitater kun fra celler inkuberet med PDGF-AA, men ikke fra dem inkuberet med PDGF-AB. Desuden PDGF-AA var til stede i anti-TMEFF2 immunopræcipitater fra celler, der udtrykker enten den fulde længde TMEFF2 eller ICD-trunkeret TMEFF2. Dette er i overensstemmelse med ELISA resultat viser, at PDGF-AA, men ikke PDGF-AB udviste dosisafhængig binding til ECD af TMEFF2.

Flere bånd af TMEFF2-FL og TMEFF2-ΔICD blev påvist ved anti- TMEFF2 mAb grund af forskellige grader af glycosylering og proteoglycan fastgørelse [4]. mAb, muse monoklonalt antistof; pAb, kanin-polyklonalt antistof; Ig LC, let kæde af Ab anvendes til immunopræcipitation.

TMEFF2 indeholder 2 FS moduler og et EGF-lignende domæne. At dissekere hvilke domæner af TMEFF2 er involveret i dets interaktion med PDGF-AA, vi gjort Herpes simplex type 1 glycoprotein D (gD) -epitope mærkede deletionsmutanter af TMEFF2 og undersøgt deres evne til at binde PDGF-AA, når det udtrykkes på overfladen af ​​293 celler (fig 4 .. supplerende figur S8). Som forventet, PDGF-AA co-immunpræcipiteret med gD-mærkede fuldlængde TMEFF2 af et anti-gD-monoklonalt antistof. Men når gD-tagged TMEFF2 mutanter mangler enten NT FS I (gD-TMEFF2-ΔFS I) eller begge FS moduler (gD-TMEFF2-ΔFS I /II) blev immunfældet med det samme anti-gD-antistof, intet PDGF AA blev bragt ned, selv om begge mutant TMEFF2 proteiner blev bragt ned i immunopræcipitaterne. FACS-analyse bekræftede også membran ekspression af alle 3 gD-mærkede proteiner (Supplemental Fig. S2). Dette antyder, at NT-regioner indeholdende FS I-domænet er nødvendige for PDGF-AA interaktion, hvorimod EGF-domænet alene er utilstrækkelig for denne interaktion. I overensstemmelse med dette resultat, et rekombinant His-mærket tandem-array af EGF domænet af TMEFF2 heller ikke godtgjort specifik binding til PDGF-AA-coatede plader ved ELISA (data ikke vist). Salg

Flere bånd af TMEFF2 -FL og TMEFF2-ΔFS jeg blev opdaget af anti-TMEFF2 mAb på grund af forskellige grader af glycosylering og proteoglycan fastgørelse [4].

TMEFF2 modulerer PDGF-stimuleret proliferation af NR6 fibroblaster

PDGF-ligander er potente mitogener af bindevævsceller, herunder fibroblaster, glatte muskelceller, chondrocytter, og nogle endotelceller [17], [28], [29]. Konstateringen af, at TMEFF2 interagerer med PDGF-AA på ng /ml koncentrationer af både rekombinante TMEFF2 ECD og PDGF-AA fik os til at undersøge muligheden for, at TMEFF2 kan regulere PDGF-AA signalering. Vi først spurgt, om PDGFRα, den eneste receptor, der binder PDGF-AA, kunne konkurrere med TECD for PDGF-AA binding. Som vist i Supplemental Fig. S1c, TECD-Fc-binding til PDGF-AA-overtrukne plade blev blokeret af det opløselige ekstracellulære domæne af PDGFRα, sRa, på en dosisafhængig måde, hvilket indikerer, at TMEFF2 ECD og sRa binder til PDGF-AA på overlappende sites.

Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​TMEFF2-ECD på PDGF stimuleret proliferation. Den murine fibroblastcellelinie NR6 udtrykker både PDGF-receptorer α og β [30], og udviser dosisafhængig proliferation som respons på PDGF-AA eller PDGF-AB som målt ved BrdU-inkorporering (fig. 5A, C). Når 10 ng /ml PDGF-AA blev tilsat i nærvær af stigende koncentrationer af Fc-mærket TECD blev BrdU inkorporering inhiberet på en dosis-afhængig måde ved koncentrationer mellem 0,6 og 2.000 ng /ml TECD-Fc (fig. 5B) . Denne virkning var svarende til den i sRa som også inhiberede PDGF-AA-induceret BrdU-inkorporering på et tilsvarende koncentrationsområde, omend med en lidt højere effektivitet. PDGF-AB-induceret BrdU inkorporering, på den anden side, ikke var påvirket af TECD-Fc under samme betingelser (fig. 5D). Interessant sRa havde også ringe virkning på PDGF-AB-induceret proliferation, selv om overensstemmelse med tidligere rapporter [31], kan PDGF-AB binder sRαwith en affinitet svarende til PDGF-AA (Supplemental Fig. S1B). Dette kan skyldes evnen hos PDGF-AB til at binde til alle 3 PDGFR dimerer, αα, αβ eller ββ [26], hvorimod PDGF-AA kan signalere kun gennem PDGFR αα dimers.It er muligt, at PDGF-AB kan have en højere affinitet for det native PDGF-receptor αβ dimerer end for sRa, eller at der kan være mere rigelige PDGF-receptor αβ dimerer og /eller PDGF-receptor ββ dimerer på disse celler

(A) (C) Dosisafhængig stimulering af BrdU inkorporering af PDGF-AA og PDGF-AB i NR6 celler. (B) (D) Virkninger af stigende koncentrationer af TECD-Fc (fyldte søjler) eller PDGF sRa (åbne søjler) på 10 ng /ml PDGF-AA (B) eller PDGF-AB (D) stimulerede BrdU inkorporering.

TMEFF2 udtryk nedreguleres i hjernen kræft og er negativt korreleret med PDGF-A udtryk

5′-region TMEFF2 gen ofte hypermethyleret i nogle kræftformer [2], [3], [9] – [16], hvilket tyder på en mulig tumor suppressor rolle for TMEFF2 i disse kræftformer. At sammenligne ekspressionsniveauerne af TMEFF2 i humane væv, analyseres vi Affymetrix microarray data fra GeneLogic, Inc. (Gaithersburg, MD) indeholdende multiple human tumor og normale vævsprøver. Højeste niveauer af TMEFF2 ekspression blev fundet i prostata og hjernevæv (Supplemental Fig. S3, S4).

In situ

hybridiseringsforsøg bekræftede høje niveauer af TMEFF2 mRNA-ekspression i normale voksne og føtale centrale nervesystem, samt både maligne og ikke-maligne prostata væv (Supplemental Fig. S5). Det gennemsnitlige ekspressionsniveau TMEFF2 er betydeligt højere i prostatakræft væv sammenlignet med normale prostatavæv (figur 6A;.. Supplemental Fig S3, S4), overensstemmelse med tidligere rapporter [7]. I modsætning hertil TMEFF2 udviser signifikant lavere gennemsnitlige niveauer af udtryk i maligne hjerne prøver, især i glioblastomer (GBMS), sammenlignet med normale hjernevæv (figur 6B;.. Supplerende Fig S3, S4). De fleste andre væv udtrykker TMEFF2 ved meget lavere niveauer end hjerne og prostata. Adskillige væv viser også en tendens til reduceret udtryk i kræftformer, såsom kolorektal, spiserør og mave, med statistisk signifikant forskel i tarmkræft prøver sammenlignet med normale colon væv (Supplemental Fig. S3, S4). Disse data er i overensstemmelse med en eventuel tumor suppressor rolle TMEFF2 i disse væv.

(A) Affymetrix signal intensitet TMEFF2 udtryk i prostatakræft vs ikke-kræft væv baseret på GeneLogic data. (B) Affymetrix signalintensiteten af ​​TMEFF2 ekspression i normal hjerne vs kræft hjernevæv baseret på GeneLogic data. Hver åben cirkel i (A) (B) repræsenterer en patientprøve. Box-og Whisker plot er også inkluderet i de rå data til at angive middelværdien og den 25. og 75. percentil intervaller. De whiskers er tegnet på 1,5 gange interkvartile område fra boksen. (C) (D) Normaliserede signaler af TMEFF2 (C) og PDGF-A (D) mRNA-ekspression i Proneural (PN), proliferativ (spred), eller Mesenchymale (MES) undertyper af 36 gliom prøver. Mean signaler for hver undertype vises som mellemværker. *

s

≤0.05; **,

s

≤0.005. (E) TMEFF2 udtryk er negativt korreleret med PDGF-A udtryk i 133 (76 MD Anderson og 57 UCSF) HGG prøver (Pearson korrelationskoefficient r = -0,37). Hver akse repræsenterer normaliserede signaler af hvert gen. Alle udtryk data blev opnået ved hjælp af Affymetrix HG-U133A og HG-U133B GeneChips fra sonde 223557_s_at for TMEFF2 og 205463_s_at for PDGF-A hhv.

High Grade gliomer (HGGs) er blevet klassificeret i tre molekylære undertyper baseret på lighed med definerede udtryk signaturer: Proneural (PN), proliferativ (spred) og Mesenchymale (MES) [32]. Den Proneural undertype udtrykker gener forbundet med normal hjerne og processen med neurogenese. Denne subtype er blevet forbundet med en bedre prognose [32], og er for nylig blevet knyttet til en undergruppe af tumorer, der udviser en gliom-CpG island methylator fænotype (G-CIMP) og isocitratdehydrogenase 1 (IDH1) mutation (se nedenfor) [33 ]. I modsætning hertil har de to andre undertyper er af dårligere prognose [32], og er kendetegnet ved en lighed med enten stærkt proliferative cellelinier eller væv af mesenkymal oprindelse, med genekspression programmer indikerer celleproliferation eller angiogenese. Microarray analyse af TMEFF2 i et sæt af 36 HGG prøver, der indeholdt 12 prototypiske tilfælde af hver underklasse [32], [34], viste signifikant højere niveauer af TMEFF2 ekspression i PN-underklassen end spred og MES underklasser (fig. 6C). Interessant, viste PDGF-A en næsten spejl-image, modsatte tendens med det højeste udtryk i MES underklasse (fig. 6D). En sådan tendens blev ikke observeret for PDGF-B i disse prøver (data ikke vist). Yderligere analyse af microarray data i 76 HGG prøver fra MD Anderson Cancer Center (MDA) og 57 HGG prøver fra University of California i San Francisco (UCSF) tyder på en negativ sammenhæng mellem TMEFF2 og PDGF-A udtryk i begge sæt prøver (fig. 6E ). Disse data er konsistente med den hypotese, at PDGF-AA kan være en vigtig vækstfaktor nødvendige for udviklingen af ​​ikke-PN HGGs, og at TMEFF2 ekspression kan vælges against i disse HGGs som er afhængige af PDGF-AA signalering.

TMEFF2 er hypermethyleret i flere tumortyper med sit udtryk negativt korreleret med methylering niveauer

Hypermethylering af TMEFF2 genet i humane kræftformer er blevet rapporteret i flere væv, herunder kolorektal, mave- og esophageal kræft [2], [ ,,,0],3], [9] – [12], [16]. Men disse væv udtrykker meget lave niveauer af TMEFF2 selv i normale prøver, hvilket gør betydningen af ​​gensuppression mindre klart i disse tumorer. Da status methylering af TMEFF2 ikke er blevet rapporteret i gliom og de fleste andre væv, analyserede vi alle offentligt tilgængelige data fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) med resultater på både Agilent udtryk og Infinium methylering arrays [35]. Af de syv tumortyper, hvor disse data er tilgængelige i øjeblikket, kun glioblastom, og lejlighedsvis æggestokkene og rektal kræft prøver viser betydelige niveauer af TMEFF2 udtryk (fig. 7). Alle prøver med høje niveauer af TMEFF2 udtryk svarer til lave CpG ø methylering, mens prøver med en methylering beta værdi på mere end 0,1 har en undertrykt udtryk for TMEFF2, hvilket er særligt tydeligt i GBM prøver (t-test p-værdi 4 × 10

-14). TMEFF2 ekspression er knap påviselig i næsten alle colonadenocarcinom, rektal adenocarcinom, lungeadenocarcinom og lung pladecellecarcinom prøver. Mens de fleste af disse tumorprøver viser methylering beta værdier større end 0,1, er der utilstrækkelige data til at afgøre, om forskellige tærskler for methylering beta værdier findes i forskellige tumortyper for undertrykt TMEFF2 udtryk eller andre mekanismer eksisterer for at undertrykke sit udtryk. Ikke desto mindre, sammen med andre offentliggjorte rapporter om TMEFF2 methylering i andre tumortyper disse data er i overensstemmelse med den hypotese, at TMEFF2 er bragt til tavshed gennem DNA methylering i en betydelig del af de menneskelige kræftformer, herunder gliom og kræft i æggestokkene, rektal, tyktarm og lunger oprindelse.

methylering niveauer er afbildet på x-aksen ved midling af beta værdierne fra de to Infinium prober, cg06856528 og cg18221862, og mRNA ekspressionsniveauer opnået på Agilent chippen er plottet på y-aksen.

for nylig, en delmængde af gliomer med karakteristisk promoter DNA methylering ændringer, kaldet G-CIMP, er blevet identificeret i forbindelse med TCGA GBM prøver [33]. Interessant, G-CIMP-positive tumorer tilhører en delmængde af Proneural tumorer og er tæt forbundet med IDH1 mutation. Disse tumorer har en gunstig prognose inden GBMS som helhed og også i Proneural delmængde. For at forstå forholdet mellem TMEFF2 methylering og G-CIMP signatur, vi sammenlignet methylering status TMEFF2 mod sæt TCGA GBM prøver med tilgængelige G-CIMP og IDH1 mutation oplysninger. Af de TCGA analyserede prøver af Noushmehr et al. [33], 88 overlappede med de prøver, som vi analyserede ved hjælp af offentligt tilgængelige datasæt. 76 af disse var G-CIMP-negative og 12 var G-CIMP-positive. Alle 76 G-CIMP-negative prøver var negative for IDH1 mutationen, mens alle 12 G-CIMP-positive prøver var positive for IDH1 mutationen.