PLoS ONE: Den antiapoptotisk funktion miR-96 i prostatakræft ved hæmning af FOXO1

Abstrakt

microRNA (miRNA) er små molekyler, der regulerer genekspression posttranscriptionally. I en tidligere undersøgelse identificerede vi MIR-96 at være opreguleret i prostatakræft prøver i sammenligning med normale tilstødende væv og til at være en uafhængig markør for biokemisk tilbagefald i en multivariat forudsigelsesmodel. Derfor undersøgte vi den funktionelle rolle af miR-96 i prostata carcinogenese. LNCaP og DU145 prostatacancerceller blev transient transficeret med MIR-96 prækursorer og fænotypiske forandringer blev analyseret. MIR-96 forøget proliferation og nedsat apoptose induceret af camptothecine i disse celler. In silico target forudsigelse identificerede FOXO1 som potentielle pro-apoptotiske MIR-96-mål. MIR-96 var i stand til at binde til begge bindinger sites i FOXO1 3’UTR i et luciferasereportergen assay. Overekspression af MIR-96 i LNCaP-celler resulterede i en reduceret FOXO1 udtryk. Overekspression af FOXO1 inducerede en stærk apoptotisk fænotype, som blev delvist reddet ved coekspression af MIR-96. RT-qPCR og immunhistokemi af 69 prostatakræft prøver afslørede en nedregulering af FOXO1 og en omvendt korrelation af miR-96 og FOXO1 proteinekspression. Som konklusion viser vi, at MIR-96 kan regulere apoptose i prostatacancer, ved at inhibere FOXO1 transskriptionsfaktoren

Henvisning:. Fendler A, Jung M, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K, Yousef GM (2013 ) Den antiapoptotisk funktion miR-96 i prostatakræft ved hæmning af FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10,1371 /journal.pone.0080807

Redaktør: Kin Mang Lau, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Januar 21, 2013; Accepteret: 16 Oktober 2013; Udgivet: November 19, 2013 |

Copyright: © 2013 Fendler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet af aF og KJ blev finansieret af Fonden for Urologic Research, Berlin og Sonnenfeld Stiftung, Berlin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er en ny klasse af små ikke-kodende RNA’er og regulere genekspression posttranscriptionally gennem hæmning af translation, men også gennem nedbrydning af de tilsvarende mRNA. Ca. 30% af alle mRNA forudses at blive ramt af miRNA [1]. Afhængigt af deres mål, miRNA funktion som tumorsupressors eller onkogener ved at styre store veje for carcinogenese, herunder celleproliferation, apoptose og cellemotilitet [2].

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige ondartet kræft hos mænd og den anden hyppigste årsag til kræft i den vestlige verden [3]. Mekanismer for PCa tumorigenese stadig ikke fuldt belyst, og der er mangel på diagnostiske og prognostiske markører.

deregulering af miRNA i PCa er blevet bevist af adskillige undersøgelser [4-9]. Deres ekspression korrelerer med tumor stadium og aggressivitet [10]. Vi har tidligere identificeret miR-96 i et sæt af liberaliserede miRNA i PSA. Dets ekspression er korreleret med Gleason score og den er en uafhængig markør for biokemisk tilbagefald [6].

I silico target forudsigelse ved hjælp miRecords identificerede FOXO1 blandt andre som et formodet mål for miR-96. FOXO1 er medlem af forkhead kasse transkriptionsfaktorer. Det udøver sin tumorsuppressive funktion via regulere transskription af vigtige regulatorer af cellecyklus og apoptose [11,12]. FOXO1 transkriptionsaktivitet reguleres via PI3K /AKT-vejen [13]. I bryst- og livmoderkræft, samt Hodgkin lymfomer FOXO1 er tidligere blevet vist at være reguleret af MIR-96 [14-16].

Vi hypotese, at MIR-96 også kan have en onkogen funktion i PSA. For at bevise denne antagelse, vi (a) undersøgte indflydelsen af ​​MIR-96-ekspression på fundamentale cellulære egenskaber såsom spredning, apoptose og migration på PCA cellelinier, (b) udføres i silico target forudsigelse, (c) undersøgte binding af miR- 96 til forudsagte bindingssteder i FOXO1 3’UTR og efterfølgende ændringer på mRNA’et og protein niveauer, (d) studerede redningen af ​​FOXO1-induceret apoptose ved mIR-96 og (e) korreleret mIR-96-ekspression med FOXO1 transkript og protein ekspression i human PCa og matches normal tilstødende væv. Vi viser, at MIR-96 inhiberer camptothecin-induceret apoptose og regulerer FOXO1 ekspression ved binding til 3′-UTR. I PCA prøver, vi identificeret en negativ korrelation af FOXO1 protein niveauer og miR-96-ekspression.

Materialer og metoder

Væv og cellelinjer

Forbundne normale og maligne vævsprøver af 69 PCA patienter blev opsamlet efter radikal prostatektomi mellem 2001 og 2005 på Charité University Hospital. For opsamledes hver patient klinisk-patologiske data (tabel 1). Undersøgelsen kaldes “microRNA som diagnostiske og prognostiske signaturer i urologiske tumorer” (EA1 /153/07) blev godkendt af etiske bestyrelse Charite Universitetshospital og der er indhentet skriftligt informeret samtykke.

Fotos Patienter for RT-qPCR (N = 69)

Patienter for TMA-analyse (N = 64)

N (%)

N (%)

Alder, år Median6363Range50-7246-74Pre-operative PSA

a, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T etape

apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) N stadium

apN0 /pNx67 (97) pN12 (3) M stadium

aM0 /Mx69 (100) M10 (0) Kirurgisk marginsR041 (60) R127 (39) Rx1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) Opfølgning, monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical gentagelse

a10 ( 15) 12 (19) tabel 1. Tumor karakteristika og klinisk-patologiske data patientkohorter.

aBiochemical tilbagefald blev defineret som den første postoperative PSA på mere end 0,1 ng /ml, hvilket bekræftes af mindst en efterfølgende stigende værdi ( vedvarende PSA stigning) efter opnåelse målbart PSA postoperativt, defineret som en detektionsgrænse på mindre end 0,04 ng /ml.RT-qPCR, real time kvantitativ PCR, TMA, væv microarray, PSA, prostata specifikt antigen, T stadium tumor stadium, N fase, lymfeknudemetastaser fase, M fase, metastaser fase. CSV download CSV

Væv blev hurtigt nedfrosset umiddelbart efter operationen og prøver som tidligere beskrevet [6]. Kort fortalt blev områder af tumor og normalt væv identificeres ved haematoxilin-eosin-farvning af en patolog og punch-biopsi med en serviet-micro-array nål. Kun kerner med mindst 90% tumor indhold blev overvejet til yderligere analyse.

LNCaP, DU-145, PC3 og 22rv-1 celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA,) supplere med 10% føtalt kalveserum og penicillin /streptomycin. Celler blev dyrket i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære. BPH-1-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 20% føtalt kalveserum, 20 ng /ml DHT, 5 ug /ml transferrin, 5 ng /pl natriumselenit og 5 ng /pl insulin. Cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) eller den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). Cellelinjer regelmæssigt for mycoplasmic forurening med RT-qPCR ifølge van Kuppeveld et al [17]. Desuden blev identiteten af ​​prostatacancerceller verificeret af den tyske prostatakræft Consortium.

Tissue Microarray

formalin-fikseret, paraffinindstøbt væv af 64 patienter blev brugt til opførelsen af ​​et væv microarray som tidligere beskrevet [18]. Haematoxilin-eosin-farvning blev udført for at identificere maligne og benigne områder. Områder af interesse blev Punch-biopsi med en 1,5 mm væv microarray nål og overført til modtageren blok. Hver tumor var repræsenteret af én kerne. Normalt væv fra colon, pancreas, nyre og 2 prostata og bindevæv blev anvendt som kontrol.

RNA-isolering

Totalt RNA fra friske frosne væv og cellekulturer blev isoleret under anvendelse af miRNeasy Minikit (Qiagen , Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktion som tidligere beskrevet detaljeret [6].

i ekstraktion af totalt RNA fra cellekultur, celler blev podet i plader med 6 brønde i en slutkoncentration på 3 x 10

5 celler per brønd og blev transficeret som beskrevet nedenfor. Efter 24 timer blev, 1 x 10

6 celler høstet i Qiazol (Qiagen).

RNA udbytte og A260 /280-forholdet blev overvåget med en Nano Drop ND-100 spektrometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) og RNA Integrity Numbers (RIN) blev vurderet med en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Kun RNA-prøver med et RIN 6 blev inkluderet i analyserne.

Real time kvantitative PCR

mRNA-niveauer blev analyseret ved RT-qPCR. RNA fra celler blev revers transkriberet under anvendelse af Omniscript Revers transkriptase og Oligo-dT-primere (Qiagen) ifølge producentens anbefalinger. Reaktioner blev udført i et totalt volumen på 20 pi under anvendelse af 1 ug totalt RNA. Reaktioner blev inkuberet med et trin en termisk cykliseringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantificering af FOXO1 fra cellelinier blev udført under anvendelse af 2 x Hurtig SYBRgreen MasterMix (Applied Biosystems) under anvendelse af 1 pi cDNA i 20 pi totale volumen. Primersekvenser er angivet i tabel S1. Primere blev udformet til at frembringe en amplicon spænder mindst 1 intron. Specificitet af amplifikation blev sikret ved primer sprængning og smeltekurve analyser.

mRNA fra vævsprøver revers transkriberet under anvendelse af Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) fra 1 ug RNA i 20 pi samlet volumen . Kvantificering af FOXO1 blev udført under anvendelse UPL probe # 11 (Roche) og Universal Probes Master Mastermix (Roche) i 10 pi totalvolumen.

miRNA blev detekteret ved RT-qPCR hjælp af TaqMan miRNA assay som tidligere beskrevet [6 ].

Alle prøver blev kørt tredobbelt og middelværdi og SD blev beregnet. FOXO1 ekspression blev normaliseret til TUBA1B [19], mens MIR-96 blev normaliseret til MIR-130b [6]. Standardkurver blev målt for hvert gen for at korrigere for effektivitet (FOXO1: E = 1,95; TUBA1B: E = 1,96; MIR-96: E = 1,83; MIR-130b: E = 1,83). Normalisering blev udført som tidligere beskrevet [6].

Konstruktion af luciferase vektorer

målgen 3’UTR-sekvenser blev klonet ind i pMiR rapport vektoren (Ambion Austin TX, USA). Målsekvenser af FOXO1 3’UTR blev amplificeret fra BPH1 cDNA ved anvendelse AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) og genspecifikke primere (tabel S1), klonet ind i pCR 2.1-TOPO-vektoren (Invitrogen) og amplificeret i TOP10 kemisk kompetente celler (Invitrogen). Plasmid-DNA fra positive kloner blev ekstraheret med QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) og sendes til sekventering under anvendelse af M13 uni (-21) og M13 rev (-29) primerne (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg, Tyskland). Restriktionsspaltninger af positive pCR2.1 vektorer og de pMiR rapporten vektorer blev udført med Sad og Spel (New England Biolabs, Ipswich, MA). Begrænsede skær og pMiR rapport vektor blev ligeret under anvendelse af 1 U T4 DNA-ligase (Invitrogen) og amplificeret i kemisk kompetente DH5a-celler (Invitrogen). Positive kloner blev identificeret ved koloni-PCR. Plasmid-DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).

Transfektion af PCA cellelinier med præ-miRNA, miRNA inhibitorer og plasmid-DNA

LNCaP og DU145 celler blev transficeret med præ- miRNA forstadier, anti-miRNA hæmmere eller præ-mIR-NC # 1 (Applied Biosystems) i en slutkoncentration på 10 nM eller 500 ng FOXO1 fuld længde klon (Origene, Rockville MD, USA) under anvendelse siPort NeoFX transfektion middel (Applied Biosystems) . For hver assay blev en ingen transfektionskontrol båret. For luciferasereportergen assays celler blev yderligere transficeret med 500 ng pMiR rapport vektor og β-galactosidase styrevektor.

Luciferase reportergenassay

LNCaP-celler blev dyrket til 80% konfluens og podet i 6 Tja plader ved en endelig densitet på 2 x 10

5 celler pr. Otteogfyrre timer efter transfektion blev celler fritliggende med en skraber og totalt protein blev ekstraheret i 80 pi lysisbuffer (Applied Biosystems). Luciferase og β-galactosidase-aktivitet i ekstrakterne blev detekteret ved anvendelse af Dual-Light kombinerede Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Luciferaseekspression blev normaliseret til p-galactosidaseekspression. Hver reaktion blev udført in duplo, og resultaterne er vist som gennemsnit af tre uafhængige assays.

Western Blot

I ekstraktion af totalt protein fra cellekultur blev celler udsået i 6-brønds plader i en slutkoncentration på 3 x 10

5 celler per brønd og blev transficeret som beskrevet ovenfor. Protein blev ekstraheret efter 72 timer i 100 pi NENT buffer (20 mM TRIS-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2% NP40, 0,2% SDS, pH 7,5) eller RIPA puffer (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5 % natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-base, 100 uM PMSF, 1 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml sojabønne trypsin inhibitor, 2 mM EDTA). Totalt protein blev opløst på 10% SDS-PAGE geler og overført til en 0,45 um polyvinyldifluorid membran. Den membran blev blokeret med 2% skummetmælk og undersøgt med følgende antistoffer: kanin anti-FOXO1 pAb, muse-anti-ACTB mAb (Sigma Aldrich, München, Tyskland), kanin anti-Akt pAb, kanin anti-Pakt Pab (Cell Signaling teknologier, Danvers, MA) og gede-anti-kanin, HRP-konjugeret eller kanin-anti-muse, HRP-konjugeret sekundært Ab (DAKO, Hamburg, Tyskland). Membraner blev farvet med ECL (Pierce, Bonn, Tyskland) eller avanceret ECL løsning (GE Healthcare, München, Tyskland) i 5 min og udviklet på fluor-S multiimager (BioRad, München, Tyskland). For at bestemme relative protein koncentration blev bandet intensitet beregnet med ImageJ 1.43r (https://rsb.info.nih.gov/ij) og normaliseret til p-actin.

spredning assay og analyse af cellecyklus

Proliferation af præ-mIR-96 transficerede LNCaP-celler blev vurderet ved metabolisk omdannelse af 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromid (MTT) (Sigma-Aldrich). Cellerne blev dyrket til 80% konfluens og podet i plader med 96 brønde ved en slutkoncentration på 6 x 10

3 celler per brønd og transficeret som beskrevet ovenfor. Cellerne fik lov til at hvile i 24 timer og efterfølgende var serum-udsultet. Kulturer blev inkuberet i 5 mg /ml MTT i 4 timer og lyseret i 10% SDS i 0,01 M HCI. Lysater blev inkuberet ved 37 ° C natten over og absorbansen af ​​formazan blev målt ved 550 nm. Hver reaktion blev udført tre gange, og resultaterne er vist som gennemsnit af tre uafhængige assays. For cellecyklusanalyse celler blev dyrket til 80% konfluens og podet i plader med 6 brønde ved en slutkoncentration på 1,5 x 10

5 celler per brønd og transficeret som beskrevet ovenfor. Cellerne fik lov til at hvile i 24 timer og blev efterfølgende serum-udsultet i 24 timer. Celler blev farvet med 20 pg /ml propidiumiodid tilsat 200 ug /ml RNAse i 0,1% Triton X-100 og analyseret ved anvendelse af FacsScan flowcytometer og CellQuest Software (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada). Hver prøve blev målt i to eksemplarer og resultaterne præsenteres som gennemsnit af tre uafhængige analyser.

sårheling assay

For at vurdere den migrative phenotyp af DU-145 celler på miR-96 transfektion vi udførte en sårhelende assay. Cellerne blev dyrket til 80% konfluens, podet i plader med 6 brønde og transficeret som beskrevet ovenfor. Cellerne fik lov at vokse til konfluens og monolaget blev ridset med en 100 pi pipettespids. Genindvandringen af ​​celler til såret blev vurderet ved livet cell imaging i 24 timer under serum sult. Procentdel af åbent areal blev målt med den software TScratch software [20] ved definerede tidspunkter (0,5,10,15,20 h). Alle værdier blev normaliseret til procentdelen af ​​åbent areal ved 0 timer. To tilfældigt udvalgte områder af hvert scratch blev analyseret. Data er repræsenteret som gennemsnittet af tre uafhængige assays.

Apoptose assay

LNCaP og DU145-celler blev dyrket til 80% konfluens og podet i plader med 6 brønde ved en slutkoncentration på 2 x 10

5 celler per brønd og transficeret som beskrevet ovenfor. Apoptose blev induceret med 10 pM camptothecin (CPT) (Sigma Aldrich) i serumfrit medium i 24 timer. Celler blev farvet med Annexin V-FITC (Invitrogen) og propidiumiodid (PI) (Invitrogen) Kulturer blev analyseret under anvendelse af FacsScan flowcytometer og CellQuest Software (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada). Hver prøve blev målt in duplo, og resultaterne er præsenteret som gennemsnit af tre uafhængige assays.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på 2 um lysbilleder af vævet mikroarray som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt blev væv afparaffineres i xylen og antigener blev demasked i en pressur komfur. Objektglas blev probet med kanin-anti-FOXO1 mAb (cellesignalering Technologies), biotinyleret linker-Ab og streptavidin-konjugeret sekundært Ab (DAKO) og farvet med Fast Red til den ønskede intensitet. Kerner blev modfarvet med haemalaun. Slides blev dækket ved hjælp Aquatex montering medium (Merck KGH, Darmstadt, Tyskland). Farvning af FOXO1 blev analyseret i tumor kirtler og normal tilstødende væv for hver patient hvis relevant. Da den samlede farvning for FOXO1 kun var svag, blev det scorede som nuværende (1) eller fraværende (0) alene.

I silico target forskning

I silico target søgen efter MIR-96 mål var udføres ved hjælp af miRecords (https://mirecords.biolead.org/). Vi brugte det kriterium, at en formodet mål skulle blive opdaget af Targetscan, Miranda, PicTar og to andre forudsigelse algoritmer. Placering af MIR-96 bindingssteder i 3’UTR af FOXO1 blev analyseret under anvendelse Targetscan 5.1.

Statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism version 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc udgave 10.3.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgien) eller SPSS 19,0 (IBM, Somers, NY). T-test, en-vejs eller to-vejs ANOVA, Kolmogorov-Smirnof normalitet test, Wilcoxon-test, McNemar test, Kaplan-Meier analyse og Cox proportional hazard regression blev udført. Alle tests blev udført tosidede og P-værdier. 0,05 blev betragtet signifikant

Resultater

Funktionel karakterisering af miR-96

Vi har tidligere rapporteret, at miR- 96 opreguleres og forudser biokemisk tilbagefald i prostatakræft annonce derfor hypotese et onkogen funktion af miR-96 i prostata. Den højere ekspression af MIR-96 ekspression i prostatacancerceller linjer i sammenligning med den godartet prostata-cellelinien BPH-1 (figur S1A) pegede endvidere på et onkogent funktion. At etablere en funktionel rolle miR-96, blev LNCaP og DU145 celler transficeret med syntetiske miR-96 precursor molekyler eller antisense-hæmmer. Først vurderede vi rollen som MIR-96 på celleproliferation. LNCaP og DU145 celler transficeret med MIR-96 viste en højere proliferationshastighed i sammenligning med de transfektionsteknikker kontroller (figur 1A + B). Dette pro-proliferative virkning blev delvis vendes ved cotransfektion med sin antisense inhibitor.

LNCaP og DU145 celler blev transficeret med 10 nM pre-MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombination af præ-mIR-96 og anti-mIR-96. Effekten i (A) LNCaP og (B) DU145 på celleproliferation under serumudsultning blev målt ved MTT-assay i løbet af tre dage. Alle data blev normaliseret på proliferation af kontrolkulturer på dag 1 og er vist som middel (± SD) af tre uafhængige assays. * P 0,05, To-vejs ANOVA. Celle cyklus overgang blev målt ved PI-farvning i transficerede (C) LNCaP og (D) DU145 celler. Celler blev serumudsultet én dag efter transfektion i yderligere 24 timer og efterfølgende fikseret og farvet. Sort, G1-fasen; lysegrå, S-fase; mørkegrå, G2 /M-fase. Data er vist som gennemsnit af tre uafhængige assays. Apoptose i CPT-behandlede (E) LNCaP- og (F) DU145 celler. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med 10 pM CPT i 24 timer. Celler blev farvet med Annexin V-FITC og PI. Fraktion af tidlige (sorte søjler) og sene (hvide søjler) apoptotiske celler blev målt ved flowcytometri. Data er vist som gennemsnit (+ SD) af tre uafhængige assays. * P 0,05; Bonferroni post-test (P 0,001, Tovejs ANOVA).

Næste, vi behandlet spørgsmålet om, hvorvidt denne forbedrede spredning kan skyldes en frigivelse af cellecyklus kontrol eller nedsat apoptose. For at bestemme virkningen af ​​MIR-96 på cellecyklusregulering, antallet af LNCaP og DU145 celler i G1, S eller G2 /M fase blev bedømt ved flowcytometri ved transfektion med MIR-96 i serum-udsultede celler. Hovedparten af ​​LNCaP-celler var i G1 under serumudsultning (71,0-76,7%) og mindre fraktioner var i S-fase (4,8 til 5,3%) eller i G2 /M (18,6 til 23,7%, figur 1C). Der var ingen signifikante forskelle (Anden-Way ANOVA, P = 0,12) i cellecyklus overgang i celler transficeret med miR-96 prækursorer og inhibitorer i forhold til kontrollerne. DU145 blev overgang hurtigere gennem cellecyklus, hvilket resulterer i et højere antal celler i G2 /M (30,1 til 34,4%) og S-fasen (19,2 til 22,7%) og mindre celler i G1 (43,9 til 50,7, figur 1D). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i cellecyklus overgang ved transfektion, derved bekræfter observationerne i LNCaP-celler (Second-vejs ANOVA, p = 0,2).

Som den forbedrede spredning ikke kunne forklares ved øget cellecyklus overgang, undersøgte vi effekten af ​​miR-96 transfektion på apoptose. LNCaP og DU145 celler blev transficeret med præ-MIR-96, MIR-96 inhibitorer eller krypteret kontrol og apoptose blev induceret med 10 pM camptothecin (CPT). CPT induceret apoptose i LNCaP kontrolkulturer med 13,2% tidligt apoptotiske celler og 5,6% sent apoptotiske celler og i DU145-celler (24,2% tidligt og 5,9% sent apoptotiske celler) (figur 1E + F). Forbigående transfektion med MIR-96 forstadier reducerede den del af tidlig apoptotiske og sene apoptotiske celler med 28% (LNCaP) og 25% (DU145) (anden-vejs ANOVA, P 0,001). Specificiteten af ​​den observerede effekt af miR-96 blev bekræftet af miR-21, der tjente som en positiv kontrol [22], og udviste en lignende hæmning af apoptose og miR-16, der tjente som en negativ kontrol og påvirkede ikke apoptose i prostata kræftceller.

Vi undersøges yderligere migration af DU-145 celler ved transfektion med miR-96. DU-145 viste en migrative fænotype og var i stand til at remigrate til 60% af arealet af den oprindelige såret inden for 20 timer (figur S2). Transfektion med MIR-96 precursor eller MIR-96 inhibitoren havde ingen effekt på cellemigration i sammenligning med transfektion med scrambled kontrol eller ikke-transficeret kontrol (anden-vejs ANOVA, P = 0,71).

Identifikation af miR- 96 målgener

for at identificere regulerede mål, som potentielt udgør de apoptotiske effekter, vi spillede i silico target søgning i miRecords og anset forudsigelsen kun gyldig, hvis målet blev identificeret af Miranda, Targetscan og PicTar, og to yderligere forudsigelse algoritmer. Således har vi identificeret 209 mål for MIR-96 (tabel S2). Sættet af forudsagte målgener blev yderligere analyseret med hensyn til deres gen ontologi (GO) vilkår for at identificere apoptose-relaterede gener. 21 ud af 209 forudsagte MIR-96-mål havde en apoptose-relaterede GO benævnelse, der anvendes (tabel S2). Vi undersøgte også antallet af bindingssteder og deres evolutionære bevarelse i Targetscan 5.1. og udført en litteratursøgning for at identificere mål med en kendt tumorsuppressive funktion i PSA. En af de forudsagte mål blev FOXO1 valgt til yderligere validering grundet dens kendte tumorsuppressive funktion i prostatacancer. Korrelation af miR-96 og FOXO1 udskrift udtryk i LNCaP og DU145 celler viser en omvendt korrelation udtryk (figur S1A + B). Den FOXO1 3’UTR huser to 8-mer miR-96 bindingssteder på position 264-270 og position 2138-2145. Mens den første bindingssted er stærkt bevaret, den anden miRNA bindingssted er ikke. Vi konstruerede luciferase-reportere indeholdende 200-300 bp lange sekvenser omslutter de forudsagte målsteder. Cotransfektion af begge FOXO1 3’UTR luciferase reportere med præ-MIR-96 i LNCaP-celler viste en 40% reduktion af luciferaseaktivitet sammenlignet med transfektion kontrol (One-way ANOVA, P 0,01), mens transfektion med miR- 96 inhibitor eller scrambled kontrol påvirkede ikke signifikant luciferaseaktivitet (figur 2A). Tilsætning af MIR-96 antisense-sekvenser udgivet sin hæmning kun lidt. Selv om den anden MIR-96 bindingssted i FOXO er 3’UTR kun delvist bevaret, et lignende bindingsaktivitet med 42% reduktion af luciferaseaktivitet (ANOVA, P 0,05) blev observeret i sammenligning med kontrollen (figur 2B). Tilsætning af MIR-96 antisense-sekvens delvist formindsket denne virkning, mens antisense-sekvensen alene ikke påvirkede luciferaseaktivitet. Den krypterede miRNA sekvens resulterede i en lille, men ikke signifikant inhibering af luciferaseaktivitet.

LNCaP-celler blev transficeret med 10 nM pre-MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombination af præ-mIR-96 og anti-mIR-96 samt 500 ng pMiR rapport β-galactosidase kontrol plasmid og 500 ng pMiR rapport plasmid til FOXO1 3’UTR A) bindingssted 1 i position 264-270 og B) binding site 2 i position 2138-2145. * P 0,05, ** P 0,01, En-vejs ANOVA og Tukey multiple sammenligning indlæg test

Reduktion af miR-96 target genekspression in vitro

miRNA. er foreslået for at hovedsagelig inhibere proteintranslation, men nogle miRNA har også vist sig at føre til en i det mindste delvis nedbrydning af den korresponderende mRNA [23]. At etablere den vigtigste mekanisme, hvormed miR-96 hæmmer FOXO1 i PCa og at bevise, at mekanistisk binding af miR-96 til 3-UTR kan resultere i en reduceret udtryk for FOXO1, vi transficeret LNCaP og DU145 celler med miR-96 forløber og /eller inhibitoren. MIR-96 niveauer i begge cellelinier var 400 gange højere i de MIR-96 transficerede celler og i de cotransficerede celler i sammenligning med kontrolkulturerne (ANOVA, P 0,001; Figur 3A + B). Tilsvarende blev FOXO1 mRNA reduceret mere end to gange i MIR-96 transficerede celler (ANOVA, P 0,01, figur 3C + D), mens transfektionen med MIR-96 antisense-sekvensen og den krypterede miRNA viste ingen effekt på FOXO1 ekspressionsniveauer (figur 3C + D). Yderligere til reduktion af FOXO1 afskrift, observerede vi en 1,6 gange og 2,6 gange reduktion af FOXO1 protein i LNCaP og DU145 celler efter ektopisk overekspression af miR-96 forløber, mens protein niveauer ikke væsentligt ændret i celler transficeret med miR -96 inhibitor eller scrambled kontrol (figur 3E + F, figur S3A + B). Tilsammen understøtter dataene den hypotese, at MIR-96 inhiberer FOXO1 ekspression.

prostatacancerceller blev transficeret med 10 nM pre-MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombination af præ-mIR-96 og anti-mIR-96. MIR-96 ekspression i (A) LNCaP og (B) DU145-celler og FOXO1 ekspression i (C) LNCaP og (D) DU145 celler. Data er vist som gennemsnit (+ SD) af tre uafhængige assays. ** P 0,01, *** P 0,001, En-vejs ANOVA. FOXO1 blev AKT, og Pakt proteinekspression i (E) LNCaP og (F) DU145-celler visualiseret ved western blotting. p-actin blev anvendt som en loading kontrol.

FOXO1 aktivitet er direkte reguleret af fosforylering af Akt på eksterne signaler vækst, hvilket resulterer i translocalization fra kernen. For at kontrollere om miR-96 overekspression væsentligt ændrer opstrøms Akt signalering, vurderede vi Akt og phosphoryleret Akt udtryk i miR-96 overekspression celler. Hverken Akt eller fosforylerede Akt niveauer blev væsentligt ændret ved transfektion med miR-96 forstadier eller inhibitorer (Figur 3E + F), hvilket viser, at aktiviteten af ​​FOXO1 ikke blev påvirket af ændringer i Akt ekspression eller aktivitet.

For yderligere at understøtte den hypotese, at miR-96 kontroller FOXO1 i prostatakræft og derved beskytter celler fra apoptose, vi transficeret LNCaP og DU145 celler med en fuld længde FOXO1 cDNA. Ektopisk ekspression af FOXO1 resulterede i en stærk opregulering af FOXO1 som valideret RT-PCR og westernblotting i både LNCaP og DU145 celler (Figur 4A-D). På grund af den stærke farvning intensitet FOXO1 i transficerede celler, FOXO1 i kontrolceller, er endnu ikke synlig på blottet og blev først synlige efter længere redegørelsen gange. Cotransfektion med miR-96 reducerede FOXO1 mRNA-niveauer med 2,5- og 1,7-fold i LNCaP og DU145 celler (One-way ANOVA, p 0,001), mens protein niveauer blev reduceret med 2,8 og 2.1- fold (figur 4C + D, Figur S3C + D).

LNCaP og DU145 celler blev transficeret med 500 ng FOXO1 fuld længde klon eller tom vektor, 10 nM pre-mIR-96 eller præ-mIR-NC # 1. FOXO1 udtryk i (A) LNCaP og (B) DU145 celler. Data er vist som gennemsnit (+ SD) af tre uafhængige assays. *** P 0,001, En-vejs ANOVA. FOXO1 proteinekspression i (C) LNCaP og (D) DU145-celler blev visualiseret ved Western blotting. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. Apoptose i CPT-behandlede (E) LNCaP- og (H) DU145 celler. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med 10 pM CPT i 24 timer. Celler blev farvet med Annexin V-FITC og PI. Fraktion af tidlige (sorte søjler) og sene (hvide søjler) apoptotiske celler blev målt ved flowcytometri. Data er vist som gennemsnit (+ SD) af tre uafhængige assays. ns, P 0,05, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, Tovejs ANOVA, Bonferroni indlæg test). Cell cyklus overgang blev målt ved PI farvning i transficeret (F) LNCaP og (I) DU145 celler. Celler blev serumudsultet én dag efter transfektion i yderligere 24 timer og efterfølgende fikseret og farvet. Sort, G1-fasen; lysegrå, S-fase; mørkegrå, G2 /M-fase. Data er vist som gennemsnit af tre uafhængige assays. *** P 0,001, En-vejs ANOVA. Analyse af subG1 top i (G) LNCaP- og (J) DU145 celler. Data er vist som gennemsnit af tre uafhængige assays. *** P 0,001, En-vejs ANOVA

I det næste trin, vi vurderet, om FOXO1 har en modsatrettet rolle miR-96 i prostatacancerceller og om effekten kunne være reddet. ved cotransfektion med mIR-96. FOXO1 stærkt induceret apoptose i begge cellelinier (Tovejs ANOVA, p 0.001, figur 4E + H). Behandling med CPT havde kun en mild yderligere virkning på cellerne. Samtidig overekspression af MIR-96 delvist reddet FOXO1 induceret apoptose i ubehandlet samt CPT-behandlede celler, men effekten var små og ikke signifikant i alle behandlinger (figur 4E + H).

Proliferation blev også kraftigt reduceret i FOXO1 transficeret LNCaP og DU145 celler, men MIR-96 ikke signifikant vende virkning (figur S4A + B).