PLoS ONE: Transkriptionel Regulering af PES1 Expression af c-Jun i Colon Cancer

Abstrakte

Pescadillo er en nucleolar protein, der er blevet foreslået at være involveret i fosterudviklingen og ribosom biogenese. Dereguleret ekspression af humant pescadillo (PES1) blev beskrevet i nogle tumorer, men de præcise roller i tumorigenese fortsat uklar. I denne undersøgelse frembragte vi tre monoklonale antistoffer, der genkender PES1 med høj specificitet og følsomhed, som PES1 ekspression i human coloncancer blev analyseret immunhistokemisk. Ud af 265 kolon kræft væv, 89 (33,6%) viste positiv PES1 udtryk, som var betydeligt højere end i ikke-kræft væv (P 0,001). Silencing af PES1 i kolon kræftceller resulterede i nedsat proliferation, nedsat vækst af xenografter, og cellecyklusstop i G1 fasen, hvilket indikerer PES1 fungerer som et onkogen. Vi udforskes derefter den mekanisme, hvormed PES1 ekspression styres i humane coloncancerformer og viste, at c-Jun, men ikke JunB, Jund, c-Fos, eller mutant c-Jun, reguleres positivt PES1 promotor transskription aktivitet. Desuden har vi kortlagt -274 /-264 region PES1 promotor som c-Jun-bindende sekvens, som blev godkendt af kromatin immunopræcipitation og elektroforetiske mobilitet shift-assays. Desuden viste vi en positiv sammenhæng mellem c-Jun og PES1 udtryk i kolon kræftceller og tyktarmskræft væv. Opstrøms for c-Jun, blev det afsløret, at c-Jun NH2-terminale kinaser (JNK) man skal kunne kontrollere PES1 ekspression. Vores undersøgelse, i første omgang, afdækker onkogene rolle PES1 i tyktarmskræft og belyser den molekylære mekanisme dirigere PES1 udtryk

Henvisning:. Xie W, Feng Q, Su Y, Dong B, Wu J, Meng L, et al. (2012) Transkriptionel forordning af PES1 Expression af c-Jun i tyktarmskræft. PLoS ONE 7 (7): e42253. doi: 10,1371 /journal.pone.0042253

Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italien

Modtaget: Januar 20, 2012; Accepteret: 5 jul 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Xie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National 973 Program Kina (2009CB521805) og National Nature Science Foundation of China (81.172.367). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pescadillo

koder en nucleolar protein med flere motiver, herunder en BRCA1 C-terminal (BRCT) domæne, klynger af sure aminosyrer domæner, flere lokalisering signaler nukleare, og en bevaret site for SUMOylation [1]. Det blev oprindeligt identificeret som et gen væsentlig for zebrafisk embryonisk udvikling [2]. De efterfølgende undersøgelser vist, at pescadillo blev stærkt bevaret fra gær til menneske [1], [3] – [5]. Human ortholog af Pescadillo (PES1) danner et stabilt kompleks med Bop1 og WDR12 (PeBoW kompleks), som er afgørende for nucleolar lokalisering og dens funktion i rRNA forarbejdning [6] – [8]. BRCT-slettet eller -mutated form for PES1 er mindre stabil og kan ikke indarbejdes i PeBoW komplekset [9]. En anden nucleolar protein B23 fysisk interagerer med PES1 og er involveret i at kontrollere nucleolar lokalisering af PES1 [10]. Pescadillo har vist sig at spille en vigtig rolle i normal embryonisk udvikling, ribosom biogenese, DNA-replikation, kromosomale stabilitet, og cellecyklusprogression. Afbrydelse af pescadillo eller dets ortologer i gær, zebrefish og mus forringet fosterudviklingen [2], [3], [11], [12]. PES1 spiller en kritisk rolle i pre-rRNA forarbejdning og 60S ribosomale subunit modning, gennem dannelse af PeBoW komplekset [3], [7], [9], [13]. Desuden, knockdown af PES1 induceret celle-cellecyklusstandsnings og nedsat phosphorylering af retinoblastoma protein (Rb) [14]. Desuden har PES1 blevet påvist at binde DNA direkte og regulere gentranskription [15], hvilket antyder, at PES1 er et multifunktionelt protein bidrager til forskellige biologiske processer.

For nylig blev fundet dereguleret ekspression af PES1 at være forbundet med cancerudvikling [1], [16] – [18]. PES1 blev unormalt opreguleret i voksne humane glioblastomer [1], hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCCs) [19], og gastrisk kræft [20]. PES1 udtryk var også signifikant forøget i brystkræft celler og væv på både mRNA og protein niveauer [21], og blev muligvis styret af østrogen [22]. Desuden har PES1 blevet linket til af mammale celler [16] det kromosomale ustabilitet [18], [23] og transformation. På trods af disse resultater, er lidt om den præcise rolle PES1 i tumorigenese og de faktorer, der styrer PES1 udtryk endnu ikke fastlagt.

I den foreliggende undersøgelse, viste vi høj ekspression af PES1 i tyktarmskræft væv. Vi fandt, at PES1 spiller en onkogen medvirke til at fremme proliferation af colon cancerceller og tumordannelse i nøgne mus model. Transskriptionsfaktor c-Jun forbedrer PES1 ekspression ved binding til promotorregionen af ​​PES1 og positiv korrelation mellem c-Jun og PES1 ekspression er tydelig i colon cancerceller og væv.

Materialer og metoder Salg

Etik Statement

indsamlingen af ​​vævsprøver blev godkendt og overvåget af Research Ethics Committee of Peking University Cancer Hospital Institut. Skriftligt informeret godkender opnåedes fra alle patienter før operation. Dyreforsøg, herunder antistof generation og xenograft tumor model blev godkendt og overvåget af Research Ethics Committee of Peking University Cancer Hospital Institute.

Materialer

Ekspressionsplasmider til c-Jun, JunB, Jund og c-Fos blev venligst stillet til rådighed af Dr. Zhihua Liu (Peking Union Medical College, Kina). Den dobbelte mutant c-Jun-S63A /S73A var en gave fra Dr. Dirk Bohmann (University of Rochester Medical Center). pGL3-Basic og pRL-SV40-plasmider blev indkøbt fra Promega (Madison, WI, USA). Antistoffer mod c-Jun (H-79, sc-1694) og c-Fos (sc-52) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mod JunB (D253, BS1196) og Jund (V249, BS1198) var fra Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Antistof mod JNK1 (ab27709) var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-β-actin blev købt fra California Bioscience (Coachella, CA, USA). Anti-GAPDH var fra Proteintech (Chicago, IL, USA). Kinaseinhibitorer U0126 og LY294002 blev indkøbt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). SP600125 blev indkøbt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Frembringelse af monoklonalt antistof

Hybridomer der secernerer anti-PES1 antistoffer blev genereret ifølge en standardprotokol. Kort fortalt blev fem BALB /c-mus (købt hos Animal Center of Chinese Academy of Medical Sciences) immuniseret med rekombinant GST-PES1 protein (50 ug pr mus) emulgeret i Freunds adjuvans (Sigma) fire gange med 3 ugers mellemrum. På dag 4 efter den sidste immunisering blev milten fjernet fra en immuniserede mus og cellerne blev fusioneret med Sp2 /0 myelomaceller under anvendelse af 50% (v /v) polyethylenglycol 4000 (Merck, Darmstadt, Tyskland). Hybridomer blev dyrket i HAT (hypoxanthin, aminopterin og thymidin, Sigma) selektionsmedium. Efter 14 dage blev supernatanterne høstet og screenet for tilstedeværelsen af ​​specifikke anti-PES1 monoklonale antistoffer (mAb’er) ved ELISA. De stabile hybridomaer blev ekspanderet og mAb’erne blev renset ved protein A /G-koblede sepharoseperler (Invitrogen) kromatografi.

Cellekultur og transfektion

HCT116, SW480, RKO, og AGS-celler opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler blev holdt i DMEM eller RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en CO 5%

2 miljø. Til transfektion blev celler podet i dyrkningsplader, dyrket til 50-80% konfluens og transficeret med plasmider eller siRNA anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. I DNA plasmid transfektion blev 1,6 ug DNA anvendt per brønd i 12-brønds dyrkningsplade. I siRNA transfektion blev 50 pmol siRNA anvendes per brønd i 12-brønds dyrkningsplade. Efter transfektion blev celler inkuberet i yderligere 48-72 timer, inden de blev høstet til luciferase assayet eller genekspression testning. Alternativt efter transfektion i 48 timer blev celler behandlet med de angivne kinaseinhibitorer til en anden 36 timer. siRNA sekvenser anvendt til at vælte ekspressionen af ​​c-Jun og JNK1 var som følger: siRNA-c-Jun, GCAAAGAUGGAAACGACCUUCUAUGTT; siRNA-JNK, AAAGAAUGUCCUACCUUCUTT.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i en modificeret RIPA-buffer indeholdende 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na

3VO4, 20 mM NaF, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og 1 × proteasehæmmer cocktail (Roche, Mannhelm, Tyskland). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i phosphatbufret saltvand (PBS) i 2 timer ved stuetemperatur blev membranerne inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (Jackson, West Grove, PA). Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens-detektion (Pierce, Rockford, IL, USA). Relative optiske tætheder af protein bands til at lastning kontrol (GAPDH) blev kvantificeret ved Scion billede software.

immunhistokemisk analyse

For immunhistokemisk farvning, alle kliniske prøver blev fikseret i frisk fremstillet 10% neutral pufret formalin, indlejret i paraffin og skæres i 5 um snit. Efter bagning ved 60 ° C natten over blev snit afvokset og rehydreret. Derefter blev antigen retrievaling udføres via høj trykkogning i EDTA (pH 8,0, Zymed). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering i 3% hydrogenperoxid i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter blokering med 5% fedtfri mælk blev snit inkuberet med specifik PES1 mAb 3B1 (1:500) ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubering med sekundært antistof fra EnvisionTM kittet (Dako Cytomation, Cambridge, UK) i 45 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsproduktet blev visualiseret med diaminobenzidin (DAB, Sigma) i 5 minutter ved stuetemperatur og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Oprenset IgG fra normalt museserum blev anvendt som en negativ kontrol. Resultaterne blev vurderet uafhængigt af to patologer (Q.F. og B.D.). Prøven med mere end 20% immunfarvning celler blev klassificeret som den positive tilfælde.

Hæmning af PES1 af RNA-interferens

For at stabilt banke ned endogen PES1 udtryk, vi brugte lentivirus pakning shRNA ekspressionsvektor ( indkøbt fra GenePharma, Shanghai, Kina) at inficere celler. Målceller blev inficeret med lentivirus i 24-48 timer i overensstemmelse med producentens instruktion. Den RNAi oligonukleotider sekvens bruges til at banke ned endogen PES1 udtryk er som følger: PES1-RNAi-1, GGAACACTGTAGAGCGTTTAA; og PES1-RNAi-2, GAAGATGCAGAGGCTGGTTCA.

Proliferationsassay

Celler blev podet på plader med 96 brønde ved initial densitet på 1,0 x 10

3 per brønd. På hvert tidspunkt blev celler farvet med steril MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium, 0,5 mg /ml, Sigma) i 4 timer ved 37 ° C, efterfulgt af fjernelse af dyrkningsmediet og tilsætning af 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO). Absorbansen blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser ved en bølgelængde på 490 nm. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

kolonidannelse assays

Celler blev udpladet på plader med 6 brønde (1 x 10

3 celler per brønd) og dyrket i to uger. Kolonierne blev farvet med 0,5% krystalviolet i 30 minutter efter fiksering med methanol i 30 minutter ved stuetemperatur.

Cellecyklusanalyse

Celler blev høstet ved centrifugering, vasket to gange med iskold PBS og fikseret i 75% ethanol (i PBS) ved 4 ° C natten over. Efter vask to gange med kold PBS blev celler resuspenderet i PBS indeholdende 0,1 mg /ml RNase (Sigma). Efter 30 minutter ved 37 ° C blev cellerne resuspenderet i PBS indeholdende 50 ug /ml propidiumiodid (PI) og derefter analyseret med et flowcytometer (BD, Calibur). Fordelingen cellecyklus blev beregnet ved hjælp af Cell Quest og Mod-fit software.

Tumor xenograft assay

nu /nu hunmus (fra Vital River Laboratories, Beijing, Kina) mellem 7 og 8 uger blev brugt til

in vivo

undersøgelser. Hver forsøgsgruppe bestod af 4-5 nøgne mus. 4 × 10

6 celler i 100 pi PBS blev subkutant injiceret i armhulen hos nøgne mus. Efter 22 dage blev mus oprevne og tumorerne blev fjernet og vejet. De viste data er middelværdier ± SD af mus i hver gruppe.

Genekspression microarray

RNA blev ekstraheret fra celler med Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge protokollen foreslået af udbyderen. Genekspression profiler i PES1-tavshed HCT116 og kontrol celler blev undersøgt ved hjælp af Agilent Human Genome CGH Microarray 44K. Efter normalisering blev fold forandring udtryk beregnes. AP-værdi mindre end 0,05 og fold-ændring tærskel 2 blev udvalgt til at identificere statistisk signifikante transkriptionelle ændringer.

Luciferaseassayreagens

For at analysere promotor aktivitet PES1, 5′-flankerende region plus 172 bp af transskriberet PES1 sekvensen blev dannet ved PCR under anvendelse af følgende primere: fremadrettet, 5′-CCGCTCGAGCTGGCATTATCCTGGAGTCAC-3 ‘(Xhol-sted understreget), bagside, 5’CCCAAGCTTGAAAAGAGTCGACCCCATGC-3′ (Hindlll-sted understreget). Det amplificerede fragment fra det genomiske DNA fra HCT116 celler blev indsat i pGL3-basisk plasmid vektor, og det resulterende plasmid blev betegnet som pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). De luciferase reporter plasmider, pGLB-PES1 (-1413 /+ 172), pGLB-PES1 (-902 /+ 172), pGLBPES11 (-416 /+ 172), pGLB-PES1 (-315 /+ 172), pGLB-PES1 (-282 /+ 172), pGLB-PES1 (-274 /+ 172), pGLB-PES1 (-264 /+ 172), pGLB-PES1 (-254 /+ 172) og pGLB-PES1 (-75 /+ 172 ) blev dannet fra pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). pGLB-PES1-promotor eller 5’-deletionskonstruktioner blev cotransficeret med pRL-SV40 i celler. Efter transfektion i 72 timer blev celler høstet i Passive Lysis Buffer (Promega) og cellelysaterne blev analyseret for luciferaseaktivitet med Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens anvisninger. Luciferaseaktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

chromatin immunoprecipitation (chip)

Celler blev fikseret med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af vask to gange med iskold PBS og høstet ved afskrabning. Efter centrifugering blev cellepellets lyseret i 400 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 × protease inhibitorer cocktail). Prøver blev inkuberet på is i 10 minutter og sonikeret fire gange i 15 sekunder hver gang med intervaller på 15 sekunder til opnåelse af kromatin-fragmenter på ca. 200-1000 bp nukleotider. Prøverne blev centrifugeret ved 12.000 rpm, 4 ° C i 10 minutter. Efter fjernelse af en kontrol prøve (20 pi supernatanter blev fortyndet i 80 pi fortyndingsbuffer og opbevaret ved -20 ° C) blev supernatanter fortyndet med 9 volumener ChIP fortyndingspuffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 × protease inhibitorer cocktail). Prøver blev præinkuberet med protein A /G-perler plus 10 ug laksesperma-DNA ved 4 ° C i 2 timer, og derefter centrifugeret ved 1000 rpm, 4 ° C i 2 min. Supernatanter blev inkuberet ved 4 ° C natten over med 0,2 ug c-Jun-specifikt antistof eller IgG, der var blevet præinkuberet med protein A /G perler og 10 ug laksesperma-DNA. Perlerne blev derefter vasket med TSE I (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40), TSE II (0,1% SDS, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 500 mM NaCl), TSE III (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 250 mM LiCI, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoxycholat) buffere i dreje sig en gang, efterfulgt af vask to gange med TE-buffer (pH 8,0). Efter den sidste vask blev immunpræcipitater elueret og revers tværbundet ved inkubation natten over ved 65 ° C i elueringspuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO

3). DNA blev derefter oprenset med et PCR-oprensningskit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Elueret DNA blev PCR-amplificeret med primere omfattende c-Jun-bindende site af PES1 promotoren. Det kromosomale DNA input og chip-DNA med ikke-specifik IgG blev underkastet den samme PCR-amplifikation. PCR-produkter blev separeret på en 2% agarosegel indeholdende ethidiumbromid og detekteret via ultraviolet belysning. Følgende primere blev anvendt til PCR. Specifikke primere for c-Jun-binding (Primer-S, 139 bp fragment, -363 til -225 regionen PES1 promotor), Forward primer, CTTGACAACGCAATCCTATCG; Revers primer, CCTGATGACGATTCATTGACTGT; og negativ kontrol-primere (primer-N, 110 bp fragment, -1473 til at -1364 region PES1 promotor), Forward primer, CAACTAGCTGGGGTTACAGG; Revers primer, GAGATCAGGAGTTTGAGAC. Følgende antistoffer blev anvendt:. Kanin polyklonalt anti-c-Jun (H-79, Santa Cruz) og kanin normal IgG (Santa Cruz) Salg

Elektroforetisk mobilitet (EMSA) Salg

Celler blev vasket to gange med iskold PBS og høstet ved afskrabning. Efter centrifugering blev cellepellets resuspenderet i 160 pi iskold buffer A (10 mM Hepes, 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF) og inkuberet på is i 20 minutter. Og derefter en anden 40 pi puffer A indeholdende 2,5% NP-40 blev sat til prøven med intermitterende hvirvelbehandling i 10 s. Efter centrifugering 12.000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter blev cellepellets resuspenderet i 40 pi iskold buffer B (20 mM Hepes, 400 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) og anbragt på is med intermitterende hvirvelbehandling i 25 min. Cellerester blev fjernet ved centrifugering. Supernatanter indeholdende nukleare protein blev opbevaret ved -70 ° C. Bindingsassays blev udført ved at inkubere 8 ug kerneprotein i bindingspuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM KCI, 1 mM DTT, 10 pg laksesperma-DNA) med 30 fmol biotinmærkede oligonukleotider i et slutvolumen af 20 pi i 20 minutter ved stuetemperatur. For kold konkurrence, blev en 1000 gange overskud af de umærkede oligonukleotider tilsat til bindingsreaktionen 20 min før tilsætning af de mærkede oligonukleotider. For supershift assays, blev 0,1 ug antistof inkuberet med bindende blandinger indeholdende 10 fmol biotinmærket probe i 40 minutter ved stuetemperatur. DNA-proteinkomplekser blev separeret ved elektroforese gennem en 6% nativ polyacrylamidgel i 0,5 × TBE ved 100 V i 180 minutter ved 4 ° C. Gelerne blev derefter overført til en positivt ladet nylonmembran. De bundne prober blev visualiseret ved HRP-konjugeret streptavidin og kemiluminescerende substrat (Thermo Chemiluminescent nucleinsyrepåvisning kit). Oligonucleotidproberne anvendt i EMSA var som følger: Probe1, CTTCCGCCCCTCTCCGTCCCAACATGCAAC (-284 /-255 sekvens af PES1 promotor); Probe-W (indeholdende tidligere identificeret vildtype c-Jun bindende sekvenser), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCTGACTCACCCGGGCCCGGG; Probe-Am (indeholdende muterede AP-1 bindingssekvenser), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCGTCGGATCCCGGGCCCGGG [24]. Proberne blev syntetiseret og mærket med biotin ved SBS Genentech (Beijing, Kina). De komplementære oligonukleotider blev annealet i 20 mM Tris (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, og 1 mM DTT.

Real-time reverse transkription polymerasekædereaktion

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret fra celler med TRIzol-reagens (Invitrogen) og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega). Den kvantitative PCR blev udført med ABI StepOne Real-Time PCR-system (Applied Biosystems) under anvendelse af SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan) ifølge producentens instruktioner. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer. Relativ genekspression blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCt fremgangsmåde i overensstemmelse med producentens anvisninger. Rengøring gen glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase

(GAPDH)

blev brugt som interne kontroller for at normalisere

PES1

mRNA-ekspression. Følgende primere blev anvendt:

PES1

, frem CCCAAGCAGAGGCAAAGG, omvendt CTGACATCTCCCCATCGG;

c-Jun

, frem CGCCCCTGTCCCCCATCG, omvendt TGTGCCACCTGTTCCCTG;

GAPDH

, frem CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG, omvendt CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG. Primere af kvantitativ RT-PCR til validering af resultaterne af Microarray blev noteret i tabel S1.

Statistisk analyse

Dataanalyse blev udført under anvendelse af SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). En to-halet uafhængig-prøve

t

test blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem forskellige forsøgsgrupper. Korrelationen af ​​c-Jun og PES1 i tyktarmskræft væv blev analyseret ved Pearson korrelationskoefficient med SPSS-software. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved P 0,05

Resultater

PES1 er overudtrykt i tyktarmskræft

Vi først genereres tre monoklonale antistoffer (mAb’er) genkender human PES1.. Gennem ELISA og Western blot-analyse, blev disse tre mAb’er vist til specifikt at binde til GST-PES1 protein, men ikke til GST (fig. S1A og S1B). Endvidere kunne disse mAb’er genkender endogent PES1 i Western blot assay (fig. S1c). Dernæst bekræftede vi specificiteten af ​​mAb 3B1 ved at analysere totale cellelysater af kontrol og PES1 shRNA-transfekterede AGS gastrisk kræftceller. Et proteinbånd svarende til den forventede molekylstørrelse af PES1 (69 kD) blev ablateret ved en kort hårnål RNA (shRNA) mod PES1 (fig. S1D). Desuden har vi vist, at mAb 3B1 kunne anvendes i ELISA, Western blot og immuncytokemi analyse med højere følsomhed og affinitet, sammenlignet med en kommerciel antistof (fig. S1E-G).

For at undersøge ekspressionen af PES1 i tyktarmskræft væv, vi udførte immunohistochemistical analyse af humane coloncancer væv og matches tilstødende væv med mAb 3B1. Som vist i figur 1A og 1B, PES1 udviste stærk nuklear farvning (brun kerner) i cancerceller og lymfeknuder, hhv. Ud af de 265 kolon kræft væv, 89 (33,6%) var positive for PES1 udtryk, mens kun 2,7% (7/265) af tilstødende væv viste PES1 farvning (fig. 1E). Forskellen på PES1 udtrykket mellem tyktarmskræft væv og ikke-kræft væv var signifikant (P 0,001). Endvidere 20/40 (50%) af lymfeknuder viste positiv PES1 farvning, også signifikant højere (P 0,001) end i ikke-cancervæv. Derfor er disse resultater viste PES1 udtryk var opreguleret i humane coloncancer væv.

immunhistokemisk analyse af PES1 udtryk i humane coloncancer væv. Tallene viser den stærkt kerner farvning af PES1 i tyktarmskræft væv (A) og lymfeknuder (B). Negativ farvning af PES1 i ikke-cancervæv støder op til tumoren blev vist i (C). Normalt muse-IgG blev anvendt som en negativ kontrol i tyktarmskræft væv og vist i (D). Repræsentative lav (× 100) og høj (x 400) forstørrelse er vist. (E) Oversigt over PES1 ekspression i humane coloncancer væv, matchede tilstødende væv, og lymfeknuder. a angiver signifikant forskel mellem tyktarmskræft versus matchede tilstødende væv. b angiver signifikant forskel mellem lymfeknuder versus tilstødende noncancerous væv.

PES1 fremmer tyktarmskræft celledeling og vækst

in vitro

in vivo

for at undersøge den biologiske funktion af PES1 i patogenesen af ​​coloncancer, blev lentiviral-medieret stabil ablation af PES1 udført i HCT116, RKO, og SW480 colon cancerceller med to par shRNAs. Både shRNA effektivt tavshed ekspressionen af ​​endogene PES1 i disse cellelinier (fig. 2A). In vitro afslørede analyser, udtømning af endogene PES1 medførte væsentlige hæmninger af celleproliferation (Fig. 2B) og kolonidannelse (fig. 2C). Cell cyklus analyse yderligere vist, at celler havde tendens til at blive akkumuleret i G1 fasen, men mindre i S fasen efter PES1 ablation (fig. 2D), tegn på G1 /S anholdelse. Der blev imidlertid ingen signifikant forskel i den stadige niveauer af apoptotiske celler mellem kontrol shRNA og PES1-specifikke shRNAs-transficerede celler (data ikke vist). Desuden har vi podet den PES1-ablateret HCT116 og RKO celler i nøgne mus til at undersøge effekten af ​​PES1 på xenograft tumordannelse. Som vist i fig. 2E, nedregulering af PES1 hæmmede tumorvækst

in vivo

.

(A) Western blot-analyse for PES1 protein i HCT116, RKO, og SW480 celler transduceret med shRNA-kontrol og PES1 shRNA konstruerer ( PES1-shRNA-1 og PES1-shRNA-2), henholdsvis. (B) Vækst kurver af angivne celler transduceret med PES1 shRNAs, som undersøgt af MTT assay. Værdier præsenteres repræsenterer middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (C) Silencing of PES1 faldt kolonidannelse. Fotografierne demonstrerer resultaterne af koloni-dannelse assay af celler i pladen (venstre panel). De relative kolonidannende tal (højre panel) blev opnået fra tre uafhængige forsøg. (D) Silencing af PES1 resulterede i cellecyklusstop. Kvantificering af cellecyklus fordelinger blev afledt fra tre uafhængige forsøg. Værdier repræsenterer middel ± SD. (E) Silencing endogen PES1 inhiberer tumorvækst af HCT116 og RKO celle i nøgne mus. Den højre panel viser tumor vægt shRNA-kontrol og shRNA-1. Værdier præsenteret repræsenterer middelværdier ± SD.

For at få indsigt i PES1 biologiske funktioner, vi udførte microarray analyse med PES1 stabilt tavshed HCT116 celler og kontrol celler. Gener med samme mønster af ændringer i både shRNA-1- og shRNA-2-transficerede celler blev plukket. blev identificeret i alt 633 gener, der skal forskelligt udtryk (enten 2 fold stigning eller fald) på PES1 lyddæmpning, herunder 305 opreguleret og 328 ned-regulerede gener. Bioinformatiske analyse blev udført for at identificere veje ramt af PES1 ablation med Gene ontologi Analyse værktøj (fig. S2A). Disse veje blev rangordnet efter betydning (P-værdier). I overensstemmelse med resultaterne af funktionel analyse, gener relateret til kontrol af celleproliferation udgør den primære kategori påvirket af PES1 ablation (fig. S2A). Vi undersøgte derefter udtryk for fire ned-regulerede gener (

BCL2

,

FGF9

,

satb1

, og

AVP

) og fire up-regulerede gener (

id3

,

MSX2

,

gdf11

, og

smad3

) ved kvantitativ RT-PCR i HCT116 og SW480 celler, og bekræftede resultaterne af microarray analyse (fig. S2B).

PES1 udtryk reguleres af c-jun i kolon kræftceller

Vi var interesseret i at finde ud af den faktor (er) styrer PES1 overekspression i kolon kræft væv . Præliminære data antydede, at der var højere PES1 mRNA-ekspression i colon cancer væv end i match tilstødende væv, men ingen dereguleret methylering blev fundet i promotorregionen af ​​PES1 genet (data ikke vist). Desuden blev flere potentielle transcriptionsfaktor bindingssites inden PES1 promotoren identificeret, herunder aktivator protein-1 (AP-1) bindingssteder. For bedre at forstå den transkriptionelle regulering af PES1 blev 2060 bp af 5′-flankerende sekvens i PES1 genet og 172 bp af den transkriberede sekvens klonet fra HCT116 celler og subklonet ind pGLB luciferasereporterplasmid. Derefter undersøgte vi, om AP-1 kan regulere PES1 transkription. Transkriptionsfaktoren AP-1 består af flere komponenter, såsom c-Jun, JunB, Jund og c-Fos, som danner homo- eller hetero-dimer at binde promotorsekvenserne downstream gener [25]. Reguleringen af ​​disse AP-1 underenheder på PES1 promotor blev undersøgt ved luciferase reporter assay. Den pGLB-PES1-promotoren (-2060 /+ 172) blev co-transficeret med c-Jun, JunB, Jund eller c-Fos i HCT116 og SW480 celler, hvis ekspression blev valideret ved Western blot (fig. 3A). PES1 promotoraktivitet blev stærkt forøget med c-Jun, men minimalt af andre underenheder (fig. 3B). Vi testede også synergistiske virkninger af c-Jun og c-Fos på PES1 promotor-aktivitet. Til dette formål pGLB-PES1-promotoren (-2060 /+ 172) blev co-transficeret med c-Jun plus c-Fos. Luciferaseaktiviteten induceret ved co-transfektion med c-Jun plus c-Fos var ikke væsentligt forøget, og endnu lavere end den, c-Jun alene (fig. 3B), hvilket antyder, at heterodimerisering mellem c-Jun og c-Fos er utilstrækkelig til fremme promoter aktivitet PES1. Phosphorylering af serin-63 og serin-73 i NH

2-terminale transaktiveringsdomæne af c-Jun af JNK (c-Jun NH

2-terminale kinaser) er essentiel for den transkriptionelle aktivitet af c-Jun [ ,,,0],26]. Vi bemærkede, at substitution af disse serinrester med alaniner (c-Jun-S63A /S73A) i høj grad svækkede phosphoryleringen (fig. 3C) og PES1 promotoraktivitet (fig. 3D), hvilket antyder, at phosphorylering af c-Jun er kritisk for aktivering PES1 udtryk.

(A) Western blot-analyse påvise ektopisk c-jun, JunB, Jund og c-Fos i HCT116 og SW480 celler. GAPDH er vist som en loading kontrol. (B) Luciferase reporter assay i colon cancerceller. pGLB-PES1-promotoren (-2060 /+ 172) blev co-transficeret med angivne plasmider i HCT116and SW480-celler. Relativ luciferaseaktivitet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Den tomme vektor blev anvendt som kontrol og den relative luciferaseaktivitet blev sat til 1. (C) Ekspression af vildtype og c-Jun-S63A /S73A i HCT116 og SW480 celler. Phosphorylering af c-Jun blev også påvist. (D) pGLB-PES1-promotoren (-2060 /+ 172) blev co-transficeret med c-Jun eller c-Jun-S63A /S73A i HCT116 og SW480 celler, så reporter assay blev udført som i (B).

c-Jun regulerer PES1 promoter aktivitet ved direkte binding til PES1 promotor

for at kortlægge c-Jun-bindende site på PES1 promotor, en serie af 5′-deletionsmutanter blev genereret og analyseret ved co-transfektion med c-jun. Sammenlignet med regionen -2060 /+ 172, yderligere sletning,

dvs

-1413 /+ 172, -902 /+ 172, -416 /+ 172, -315 /+ 172, -282 /+ 172, og -274 /+ 172, ikke mærkbart ændre reporter aktivitet, men yderligere sletning fra -274 til -264 forårsagede en reduktion i luciferaseaktiviteten -80% (fig. 4A). I mellemtiden har vi analyseret deletionsmutanter i fravær af exogent c-Jun, og også fundet at deletion fra -274 til -264 markant reduceret reporter aktivitet (fig. 4A) .Disse data tyder -274 /-264 er en potentiel c -Jun bindende sekvens på PES1 promotoren. Dernæst udføres chromatin immunoprecipitation (chip) assay at underbygge c-Jun s binding til PES1 promotoren. Som vist i fig. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.