PLoS ONE: MicroRNA-10a nedreguleres af DNA-methylering og fungerer som en tumorsuppressor i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er fungere som posttranskriptionel regulatorer af genekspression i mange biologiske processer. Deres deregulering forekommer almindeligt i gastrisk cancer (GC). Selvom DNA methylering udgør en vigtig mekanisme til microRNA deregulering i kræft, stort set forbliver dette felt uudforsket.

Metode /vigtigste resultater

Total RNA blev ekstraheret fra væv af 100 patienter med GC og fire gastrisk cancercellelinjer. Ekspressionsniveauerne af MIR-10a blev bestemt ved real-time PCR med specifikke TaqMan prober. Desuden udførtes en funktionel analyse af MIR-10a i reguleringen af ​​celleproliferation, migration og invasion. Efterfølgende kvantitativ methyleringsspecifik PCR (qMSP) blev anvendt til at detektere status DNA-methylering i den CpG-øer opstrøms af

MIR-10a

. I denne undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​miR-10a GC celler var lavere end i normale celler, hvilket var på grund af hypermethylering af CpG øer opstrøms af

miR-10a

. Vi valideret også lidt lavere ekspression af MIR-10a i GC væv end deres hosliggende ikke neoplastiske væv i 100 GC patienter og bekræftet hypermethyleringen af ​​CpG-øer opstrøms for

MIR-10a

hos nogle patienter. Desuden re-introduktion af miR-10a i GC celler var i stand til at hæmme celledeling, migration og invasion. Bioinformatik og immunoblot-analyse viste, at tumor suppressor roller MIR-10a i GC-celler eventuelt gennem målretning HOXA1.

Konklusioner /Signifikans

Vores data indikerer, at MIR-10a virker som en tumorsuppressor i GC celler og er delvist bragt til tavshed ved DNA hypermethylering i GC, hvilket tyder på, at miR-10a kan tjene som en potentiel diagnostisk eller terapeutisk mål for GC

Henvisning:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) MicroRNA-10a nedreguleres af DNA-methylering og fungerer som en tumorsuppressor i Gastrisk cancerceller. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10,1371 /journal.pone.0088057

Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Frankrig

Modtaget: Januar 26, 2013; Accepteret: 4 Januar 2014; Udgivet: 31 Jan 2014

Copyright: © 2014 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (2011, 91.129.716, til JY), Beijing Municipal Videnskab Teknologi Kommissionen (2010B071, til J. Y.), Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (2009RC03, til J.Y .; 2010PYB06, til J.Y .; 2012G04, til J. Y.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den næsthyppigste årsag til kræftdødsfald i [1] verden. Hidtil har kun få tumorsuppressorgener og tumorrelaterede gener blevet rapporteret i GC. Selv omfattende undersøgelser er blevet udført for at identificere genetiske veje og mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​kræft, har nogle forbedringer på tidlig diagnosticering af kræft er foretaget. MikroRNA’er (miRNA) er endogene små ikke-kodende RNA, der er blevet identificeret som posttranskriptionel regulatorer af genekspression. Tidligere undersøgelser har vist, at miRNA udøver deres funktioner gennem ufuldkommen baseparring med 3′-utranslaterede region (3’UTR) af target mRNA [2], og miRNA er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med cellecyklus regulering, differentiering, udvikling og apoptose [3], [4]. Akkumuleret beviser indikerer, at miRNA er dereguleret i forskellige sygdomme, især i kræft. For eksempel MIR-216b er markant nedreguleret i nasopharyngeal carcinom [4]; MIR-340 er dereguleret i brystkræft og kan inhibere brystkræft cellemigration og invasion [5]; og MIR-31 blev identificeret som et onkogen i esophageal pladecellecarcinom [6]. Tilsammen har miRNA blevet identificeret som potentielle kandidater til nye diagnostiske biomarkører eller terapeutiske mål for kræft.

MIR-10a er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i tilblivelsen og udvikling af en række forskellige humane cancere. For eksempel er MIR-10a dereguleret i hoved og hals pladecellecarcinomer og også i hepatocellulært carcinom [7], [8]. Endvidere i human livmoderhalskræft, MIR-10a tjener som et onkogen ved at regulere CHL1 [9]; nedregulering af MIR-10a i kronisk myeloid leukæmi fremmer CD34

+ -celler proliferation [10]. Men funktionen af ​​MIR-10a og mekanismen underliggende gastrisk carcinogenese er fortsat uklare. I denne undersøgelse har vi måles nøjagtigt ekspressionen af ​​MIR-10a i 100 patienter med gastrisk cancer og undersøgt den rolle, MIR-10a i gastriske cancerceller. Vi fandt, at miR-10a blev nedreguleret i GC væv og håndhæves udtryk for miR-10a undertrykt spredning, migration og invasion af GC celler.

Epigenetisk ændringer, herunder DNA hypermethylering, histondeacetylering og histon methylering er tæt forbundet med gen inaktivering. Promotor hypermethylering menes at være en alternativ mekanisme til nedregulere tumorsuppressorgener i human cancer [11]. MiRNA hvis ekspression undertrykkes af DNA-methylering er blevet rapporteret i nogle få humane cancere [12] – [14]. For yderligere at undersøge, om nedregulering af MIR-10a stammer fra hypermethyleringen af ​​den genomiske region opstrøms for

MIR-10a

analyserede vi DNA methylering af CpG ø i promotorregionen af ​​

miR- 10a

i 55 GC patienter og fundet, at nedregulering af miR-10a i GC væv kan skyldes den hypermethylering af CpG-sekvenser i sin promotor.

Materialer og Metoder

patienter og prøver

Humane kliniske prøver blev indsamlet fra kirurgiske prøver fra 100 patienter med GC på Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, General Hospital i Folkets Befrielseshær og Shanxi Cancer Hospital. De tilsvarende hosliggende ikke neoplastiske væv fra den makroskopiske tumor margin blev isoleret på samme tid og anvendt som kontroller. Tumorer blev iscenesat i henhold til TNM (2010) kriterier for EU klassificering for International Cancer Kontrol (UICC). Alle prøver blev delt i to dele og blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Fire gastriske cancercellelinier (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45) blev alle bevaret i vores laboratorium og opretholdt i DMEM eller 1640 med 10% FBS. Den Clinical Research Ethics Committee of Institut for Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences godkendte forsknings- protokoller og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra deltagerne.

RNA Extraction, cDNA syntese af mRNA og miRNA, og Real- time PCR assays

Totalt RNA blev ekstraheret fra gastriske cancer væv og celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. RNA blev kvantificeret ved absorbans ved 260 nm og cDNA blev syntetiseret ved M-MLV revers transkriptase (Invitrogen) fra 2 ug totalt RNA. Oligo (dT) 18 blev anvendt som RT-primere til revers transkription af mRNA. En hårnåle-RT-primeren blev anvendt til revers transkription af miRNA. Kvantitativ RT-PCR blev udført i en Bio-Rad CFX96 realtids-PCR System (Bio-Rad, CA, USA) under anvendelse SYBR Premix Ex Taq kit (Takara, Dalian, Kina) eller TaqMan prober (Applied Biosystems, Foster City, CA , USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. PCR-betingelserne var som følger: 95 ° C i 30 s, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 34 s. For mRNA blev dataene normaliseret ved hjælp af den endogene GAPDH kontrol. For miRNA blev U6 snRNA anvendt som den endogene kontrol. Den relative mængde af MIR-10a blev målt med 2

-ΔΔCT metode. Primersekvenser er vist i tabel S1. Salg

DNA ekstraktion, methyleringsspecifik PCR (MSP) og Quantitative methyleringsspecifik PCR (qMSP)

Høj molekylvægt genomisk DNA blev ekstraheret fra gastriske cancervæv anvendelse af en DNA Extraction Kit (biomed, BJ, Kina) ifølge producentens instruktioner. Bisulfit modifikation blev udført ved anvendelse af Epitect bisulfit sekventering kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge protokollen. Op til 2 ug genomisk DNA blev anvendt som et udgangsmateriale. Normal lymfocyt DNA behandlet med CpG methyltransferase (M.SssI) (NEB, MA, USA) blev anvendt som en positiv kontrol, og et reaktionssystem uden skabelon blev anvendt som en blank kontrol.

natrium bisulfate- behandlede DNA blev amplificeret under anvendelse af Bio-Rad CFX96 realtids-PCR System (Bio-Rad) ved anvendelse af KAPA SYBR® fAST qPCR Kits (KAPA Biosystems) med følgende betingelser: 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 54 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. qMSP reaktioner blev udført tre gange. Methyleringen niveauet i en prøve blev estimeret som Lu L et al. beskrevet [15]. Primersekvenser er vist i tabel S1.

5-Aza-2′-deoxyazacytidine Behandling

mavekræft celler blev podet i 10 cm skåle (1 × 10

6 celler pr skål) én dag før lægemiddelbehandling. Cellerne blev behandlet med 1 pM 5-aza-2′-deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, USA) hver 24 timer i 3 dage.

Celledyrkning og Oligonukleotider transfektion

De humane gastrisk cellelinier HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, og MGC-803 blev opretholdt i DMEM (Gibco, BRL , UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Disse cellelinjer blev opretholdt ved 37 ° C i befugtet luft indeholdende 5% CO

2.

MIR-10a efterligner, blev kapløbet efterligner, siHOXA1 siRNA og kapløbet siRNA syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina ) og transficeret ind i cellerne i en endelig koncentration på 50 nmol /l ved hjælp DharmaFECT1 Reagent (Dharmacon, TX, USA).

Cell Proliferation og Colony Formation Assay

de mimic- eller siRNA- transficerede celler blev podet i plader med 96 brønde (5000 celler /brønd). Celler blev inkuberet med 10% CCK-8 (DOJINDO, Japan) ved 37 ° C, indtil visuel farve omdannelse indtraf. Opformeringsrater blev bestemt ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 timer efter transfektion.

efterligner-transficerede celler blev trypsiniseret og genudpladet på 200 celler per brønd i plader med 6 brønde og opretholdt i 1640 med 10% FBS. Cellerne blev dyrket i 7 dage, fikseret med methanol og farvet med 0,1% krystalviolet i 20% methanol i 15 minutter.

Cell Apoptose Assay Salg

Apoptosis assays blev udført i HGC-27 og MGC-803 cellelinjer under anvendelse af Annexin V-FITC Apoptose Detektion kit i (BD Biosciences) ifølge producentens protokol og derefter analyseret ved Calibur flowcytometer (Becton Dickinson).

Cell Migration og invasion assays

En sårhelende assay blev udført for at vurdere cellemigrering. En kunstig sår er oprettet en sammenflydende cellemonolag uden FBS ved anvendelse af en 200 uL pipettespids 24 timer efter transfektion. At visualisere migrerende celler og sårheling, blev billeder taget ved 0, 12, 24, 36, 48, 60 timer.

I Transwell invasion assays, HGC-27 og MGC-803 celler suspenderet i 0,2 ml RPMI 1640 eller DMEM uden FBS blev anbragt på den øverste kammer i hver indsats (Millipore, MA, USA) belagt med 40 pi 1 mg /ml matrigel. Det nedre kammer blev fyldt med 600 pi RPMI 1640 eller DMEM-medium med 10% FBS som ernæringsmæssige tiltrækningsstof. 24 timer senere blev invasionen cellerne fastgjort til den nedre overflade fikseret med 20% methanol og farvet med May-Gruwald-Giemsa (MGG). Membranerne blev derefter skåret og indlejret under dækglas. Celler i tre forskellige visuelle felter blev talt, og alle assays blev udført tre gange.

Western Blotting

Western blot-analyse blev udført ifølge standardmetoder. Proteiner blev separeret ved 10% SDS-PAGE og derefter overført til PVDF-membraner (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membraner blev blokeret natten over med 5% fedtfri tørmælk og inkuberet i 2 timer med et anti-HOXA1 antistof (Bioworld, MN, USA) ved 1:500 fortyndinger eller anti-GAPDH-antistof (Proteintech, Chicago, USA) ved 1: 50.000 fortyndinger. Efter vask med TBST (10 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20) blev membranerne inkuberet i 2 timer med sekundært antistof (zsgb-bio, Beijing, Kina).

Statistik

Hvert forsøg blev gentaget mindst tre gange. Den Students t-test (to-halet) og x

2 test blev udført, og statistisk signifikans blev defineret som α = 0,05 (to-side). Midlerne ± SD vises i figurerne.

Resultater

miR-10a nedreguleret i mavekræft Celler

Vi undersøgte udtryk for moden miR-10a i fire humane gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45) og en human gastrisk epitel celle linje (GES). Udtrykket niveau af miR-10a i GES var signifikant højere end niveauerne i de to gastrisk cancer cellelinier (HGC-27 og MGC-803) og var ikke-signifikant, men observerbar højere end niveauerne i de to andre gastrisk cancer cellelinjer (MKN-45 og SGC-7901) (fig. 1a). Disse data antydede, at nedregulering af miR-10a kunne være relevante for tilblivelsen og udviklingen af ​​GC.

en Ekspressionen af ​​miR-10a i fire humane gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC- 803, SGC-7901 og MKN-45) og en human gastrisk epithel cellelinie (GES) blev påvist under anvendelse realtids-PCR med TaqMan prober. b Udtrykket af miR-10a i 100 par GC væv sammenlignet med deres matchede tilstødende ikke-neoplastiske væv. c Udtrykket af miR-10a i GC væv var lavere end i tilstødende væv, selv om der var ingen statistisk signifikante forskelle. P = 0,148, parret t-test, to-halet. U6 snRNA blev anvendt som den endogene kontrol.

Den Angivelse af miR-10a i kliniske GC Patienter og deres Sammenhæng med klinisk-patologisk Kendetegn

For yderligere at undersøge forholdet mellem miR-10a og GC tilblivelse, detekteres vi ekspressionen af ​​mIR-10a i 100 kliniske patienter ved TaqMan probe afledt realtids-PCR som beskrevet ovenfor. Ud af 100 par GC-prøver blev ekspressionen af ​​MIR-10a nedreguleret i 58 tilfælde (58/100, 58%) i forhold til de tilsvarende tilstødende væv (fig. 1b). Samlet set ekspressionen af ​​MIR-10a blev nedreguleret i GC væv sammenlignet med tilstødende væv, selvom nedregulering var ikke statistisk signifikant (p = 0,148, parret t-test, to-halet) (fig. 1c).

for at vurdere sammenhængen mellem ekspressionen af ​​miR-10a og de klinisk-patologiske karakteristika, blev patienterne inddelt i to grupper efter den relative ekspression af miR-10a i kræft væv ifølge en tidligere publiceret papir [16] . Som vist i tabel S2, blev der observeret en statistisk signifikant sammenhæng mellem de to TNM grupper. Der er flere patienter, der er i I + II stadium i gruppen med lavere ekspression af MIR-10a i deres GC væv. Dette forhold viste, at MIR-10a kan være vigtigere i tidlig cancer carcinogenese. demonstrerede Men vores data, at udtrykket niveau af miR-10a havde ingen sammenhæng med alder, køn, histologisk type, tumor procentdel, venøs invasion, nerve invasion, position, BORRMANN skrive, pT stadium PN scenen eller pM scenen.

miR-10a Hæmmer Cell Proliferation

in vitro

for at udforske den rolle, miR-10a i gastrisk carcinogenese, vi transficeret miR-10a efterligne ind i GC cellelinjer HGC-27 og MGC-803, som begge udviste høj transfektionseffektivitet (fig. 2a). Som påvist ved CCK-8 vækstassays 0, 1, 2, 3 og 4 dage efter mimic transfektion, overekspression af MIR-10a reduceret celleproliferation i begge cellelinier, hvorimod scramble mimic havde ingen virkning på celleproliferation sammenlignet med de ubehandlede celler (fig. 2b). Efterfølgende blev kolonidannelse assays udført for at vurdere den proliferative evne efterligne-transficerede HGC-27 og MGC-803-celler og viste, at overekspression af MIR-10a i HGC-27 celler reducerede kolonidannelse (fig. 2c). Ingen af ​​de MGC-803-celler dannede kolonier, som kan være på grund af cellernes relativt svag vedhæftning. For yderligere at imødegå effekten af ​​miR-10a på celle apoptose i de to GC cellelinjer, blev tidlig apoptose af MGC-803 og HGC-27 celler undersøgt ved Annexin V farvning efter miR-10a efterligner transfektion. Som forventet, få tidligt apoptotiske celler (20,8% i HGC-27 og 22,9% i MGC-803) blev påvist i kapløbet mimiske-behandlede celler, hvorimod miR-10a efterligner behandling øgede procentdelen af ​​tidlige apoptotiske celler (28,4% i HGC -27 og 27,7% i MGC-803) (fig. 2d). Kollektivt, konkluderede vi, at MIR-10a kunne undertrykke celleoverlevelse i GC-celler ved at inducere celle apoptose.

a MIR-10a ekspression i HGC-27 og MGC-803-celler transficeret med 50 nmol /l scramble eller miR- 10a efterligne i 48 timer. b Vækstundersøgelser efter CCK-8 ved 0, 1, 2, 3, 4 dage efter mimic transfektion. c Kolonidannelse assay af ubehandlede, scramble-transficeres og MIR-10a-transficerede HGC-27-celler. d MGC-803 og HGC-27 celler blev farvet med PE Annexin V og 7-AAD 72 timer efter behandling med miR-10a efterligner eller kapløbet. Tidlig apoptotiske celler er vist i nederste højre kvadrant. Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P. 0,001

miR-10a Hæmmer Cell Migration og Invasion

in vitro

Vi yderligere vurderet virkninger af miR-10a på celle migration og invasion, som var de vigtigste bestemmende faktorer for ondartet progression og metastase. Migrationen evne blev demonstreret ved en sårheling /scratch assay i HGC-27 og MGC-803 celler. Begge cellelinier behandlet med MIR-10a mimic var markant mindre migrerende end de behandlet med scramble kontrol eller ubehandlede celler ved 12, 24 og 36 timer efter at ridse (fig. 3a). Endvidere har vi foretaget en Matrigel celleinvasion assay og farves de invaderede celler til måling af de retningsbestemte invasions evner af cellerne efter ektopisk udtrykker MIR-10a i de to cellelinier. Den invasionsevne af celler transficeret med miR-10a efterligner blev dramatisk faldt sammenlignet med kapløbet kontrol og ubehandlede celler (fig. 3b). Disse resultater viste, at MIR-10a spillet en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellemigrering og invasivitet i GC og foreslog, at nedregulering af MIR-10a kunne bidrage til tumormetastase i gastrisk carcinogenese.

en HGC-27 og MGC -803 celler blev ubehandlet eller transficeret med 50 nmol /l scramble eller mIR-10a i 24 timer, og sårene blev foretaget. Det relative forhold af sårlukning per felt er vist ved 0, 12, 24, 36, 48 timer. Bar, 500 pm. b HGC-27 og MGC-803 celler blev ubehandlet eller transficeret med 50 nmol /l scramble eller MIR-10a i 24 timer, og en transwell invasion assay blev udført. Det relative forhold af invasive celler pr vises. Bar, 50 um og 100 um. Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P. 0,001

miR-10a Mål HOXA1 i GC

miRNA udfører biologiske funktioner gennem en negativ regulering af deres mål gener. Det er blevet rapporteret, at den onkogenet HOXA1 er et direkte mål for MIR-10a i megakaryocytopoiese og human pancreascancer [17] – [19]. Som forudsagt af PicTar, der var en komplementær sekvens mellem har-MIR-10a og HOXA1 3’UTR (fig. 4a). Men det er uvist, om miR-10a regulerer celleproliferation, migration og invasion i GC ved at målrette HOXA1. At præcisere deres regulerende forhold, først påvist vi proteinet og mRNA-niveauer af HOXA1 i MIR-10a efterligner-transficerede HGC-27 og MGC-803 celler ved anvendelse af Western-blotting og RT-PCR. Vi observerede en tydelig nedgang i HOXA1 proteinniveauet i nærvær af MIR-10a efterligner forhold til scramble kontrol i de to celler (fig. 4b). MRNA-niveauet af HOXA1 blev også nedreguleret i HGC-27-celler, hvilket antyder, at MIR-10a inhiberer HOXA1 ekspression ved nedbrydning mRNA HOXA1 i HGC-27-celler. Der var imidlertid ringe ændring i mRNA-niveauet af HOXA1 i MGC-803 celler, hvilket antyder, at MIR-10a kan nedregulere HOXA1 ekspression gennem translationel undertrykkelse men ikke mRNA spaltning i MGC-803-celler (fig. 4C). Desuden analyserede vi de proteinniveauer af HOXA1 i 24 GC patienter. Blandt disse prøver, der var 12 patienter, hvor miR-10a blev nedreguleret i deres GC væv og 12 patienter, hvor miR-10a blev opreguleret i deres GC væv (fig. 4d). HOXA1 blev opreguleret i de fleste af de patienter, hvor miR-10a blev nedreguleret i deres GC væv. Tilsvarende HOXA1 blev nedreguleret i de fleste af de patienter, hvor miR-10a blev opreguleret i deres GC væv. En sammenligning af MIR-10a niveauer og proteinniveauer af HOXA1 i GC viste en omvendt korrelation mellem MIR-10a og HOXA1 (r

2 = 0,1839, P = 0,0366) (fig. 4e). Kollektivt, disse resultater giver stærke beviser for, at HOXA1 er et direkte mål for miR-10a i GC. Vi har registreret også mRNA-niveauet af HOXA1 hos disse patienter, og observeret, at mRNA-niveauet af HOXA1 hos flere patienter ikke var i overensstemmelse med proteinniveauet som viste, at MIR-10a regulerer ekspressionen af ​​sit mål, HOXA1 gennem translationel undertrykkelse men ikke mRNA spaltning i disse patienter (fig. S1).

en forudsigelsen af ​​bindingen mellem miR-10a og HOXA1 af Pictar. b HOXA1 proteinekspression i HGC-27 og MGC-803 celle transficeret med miR-10a efterligner. c HOXA1 mRNA-niveau i HGC-27 og MGC-803 celle transficeret med miR-10a efterligner. d Western blot-analyse af HOXA1 proteinniveau i 24 GC patienter. Det venstre panel viser udtryk for HOXA1 i 12 GC patienter, hvor miR-10a blev nedreguleret i deres GC væv (C) sammenlignet med de tilsvarende tilstødende ikke-neoplastiske væv (N). Højre panel viser ekspression af HOXA1 i 12 GC patienter, hvor MIR-10a blev opreguleret i deres GC væv (C) sammenlignet med den ikke-neoplastiske væv (N). e Inverse korrelation mellem HOXA1 protein niveauer og miR-10a udtryk i ovenstående 24 GC patienter.

Knock-down af HOXA1 Undertrykt mavekræft cellevækst og migration

in vitro

Dernæst spurgte vi, om HOXA1 spillet en vigtig rolle i gastriske kræftceller. For at undersøge, hvilken rolle HOXA1 i GC, vi bankede ned endogene HOXA1 i HGC-27 og MGC-803-cellelinjer at påvise effekt på celledeling og celle migration. Vi observerede, HOXA1 undertrykkelse inhiberede celleproliferation og migrering af HGC-27 og MGC-803 celler, henholdsvis (fig. 5a og 5b). Disse resultater antyder, MIR-10a fungerer som tumorsuppressor i GC-celler ved at undertrykke HOXA1 ekspression.

et Vækstundersøgelser efter CCK-8 ved 0, 1, 2, 3, 4 dage efter siHOXA1 transfektion. b HGC-27 og MGC-803 celler blev ubehandlet eller transficeret med siHOXA1 eller kontrol i 24 timer, og sårene blev foretaget. Det relative forhold af sårlukning per felt er vist ved 0, 12, 24, 36 timer. Bar, 500 pm. Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P. 0,001

miR-10a epigenetisk Lyddæmpet i GC cellelinjer

For at belyse, om den lave udtryk for miR-10a i GC væv var et resultat af epigenetical ændringer, vi behandlede HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45 celler med en DNA-methylering hæmmer 5-AZA. Ekspressionen af ​​MIR-10a blev opreguleret i HGC-27, SGC-7901 og MKN-45 celler, når de blev behandlet med AZA, hvilket antyder, at ekspressionen af ​​MIR-10a kan blive undertrykt i disse celler ved DNA-methylering (fig. 6a).

en Validering af ekspressionen af ​​miR-10a i HGC-27, MGC-803, SGC-7901 og MKN-45 cellelinjer behandlet med 5-AZA. b Den genomiske struktur

miR-10a

og det omkringliggende område. Den CpG Øen er placeret på 1,6 kb opstrøms for

miR-10a

. Lodrette flåter repræsenterer CpG sites. c qMSP analyse af methylering niveau

miR-10a

genomisk region i GC cellelinier og efter 5-AZA behandling. d methylering niveau

miR-10a

genomisk region i GC væv (kræft) var højere end deres matchede tilstødende ikke-neoplastiske væv (normale) i 55 GC patienter. e Den inverse korrelation mellem miR-10a udtryk og status methylering af miR-10a genomisk region i de undersøgte 55 GC patienter. f Methyleringen niveau på MIR-10a genomiske region i GES, HGC-27 og MGC-803 celler. Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01, ***, P. 0,001

For at undersøge reguleringen af ​​miR-10a ved DNA methylering, vi søgte det menneskelige genom database for tilstedeværelsen af ​​CpG øer omkring miR -10a hjælp “CpG Island Searcher” software og identificeret en CpG ø beliggende 1638 bp opstrøms af

miR-10a

(fig. 6b). Endvidere har vi opdaget DNA methylering status ved hjælp qMSP og MSP i de fire GC cellelinjer. CpG island blev hypermethyleret i alle fire GC cellelinier, som var i overensstemmelse med den lave ekspression af MIR-10a i disse GC cellelinier. Når GC cellelinjer blev behandlet med 5-aza-CdR blev methylering niveau faldet sammenlignet med DMSO-gruppen (fig. 6c).

nedreguleringen af ​​MIR-10a i GC Patienter skyldtes den Hypermethylering sine CpG Islands of

Vi undersøgte yderligere status methylering af CpG ø i GC væv og det tilstødende normale væv af 55 tilfældigt udvalgte sager gennem qMSP. Methyleringen niveau i de 55 GC væv var højere end i de tilstødende ikke-cancervæv (p 0,01), hvilket var konsistent med den lave ekspression af MIR-10a i GC væv (FIG 6d.). Derudover valgte vi tilfældigt to par prøver på at analysere DNA methylering niveau ved bisulfate sekventering PCR (BSP) for at validere nøjagtigheden af ​​MFP. Resultaterne af BSP stemte overens med den for qMSP og blev suppleret som fig. S2. Endvidere methylering niveau af MIR-10a (M /M + U) i disse GC patienter udviste en omvendt korrelation med ekspressionen af ​​MIR-10a (r

2 = 0,1956, P = 0,0006) (fig. 6e). Vi har registreret også methylering niveau af MIR-10a i normale gastriske celler og gastriske cancercellelinier. Resultaterne af qMSP afslørede, at CpG øen var delvist methyleret i GES celler, men yderst hypermethyleret i de to gastriske cancercellelinier HGC-27 og MGC-803, som også foreslået, at CpG øen opstrøms

MIR-10a

blev hypermethyleret i GC-celler (fig. 6F). Kollektivt, disse resultater giver stærke beviser, at ekspressionen af ​​MIR-10a blev reguleret af DNA-methylering i disse GC patienter. Den nedregulering af miR-10a i GC patienter skyldtes hypermethylering af sine CpG øer.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi bestemt, at miR-10a blev nedreguleret i menneskelig gastrisk cancer delvis skyldes dens DNA promotor hypermethylering. Yderligere undersøgelser viste, at overekspression af miR-10a undertrykt celleproliferation, migration og invasionsevne i GC cellelinjer HGC-27 og MGC-803, eventuelt ved at målrette onkogen HOXA1.

miRNA er blevet rapporteret til at regulere forskellige udviklingsmæssige og cellulære processer, og er impliceret i mange humane sygdomme, især i cancer. MiRNA undertrykke genekspression ved at målrette mRNA gennem binding til deres 3 ‘UTR’er. Disse miRNA udviser regulatoriske roller ved patogenesen af ​​cancer og er involveret i celleproliferation, differentiering, apoptose, metastase og resistens [4], [20]. MIR-10a spiller en vigtig rolle i flere kræftformer, herunder hepatocellulær cancer [9], pancreascancer [17], akut myeloid leukæmi [21] og kronisk myeloid leukæmi [10]. Den abnorme ekspression af MIR-10a vil kunne spille en afgørende rolle ved malign transformation og er i forhold til vævsspecificitet. Dens deregulering kan bidrage til udviklingen af ​​mave neoplasi.

validering af ekspressionen af ​​miR-10a i kliniske prøver viste, at miR-10a blev nedreguleret i 58 (58/100, 58%) GC væv sammenlignet med de tilstødende væv. Men Weidong Chen

et al.

Undersøgt ekspressionen af ​​miR-10a i 33 GC sager og bemærkede, at miR-10a udtryk var højere i GC væv end i de tilstødende væv [22]. Den manglende sammenhæng kan være et resultat af den andet antal af kliniske prøver og indistinctive skift af miR-10a i GC væv. Vores data bør være mere biologisk-repræsentant på grund af de større antal af kliniske prøver. Kun en større del, men ikke alle GC patienter har en nedregulering af MIR-10a i deres GC væv skønt MIR-10a fungerer som en tumorsuppressor i gastriske cancerceller. Dette kan være på grund af tydelig mekanisme af tilblivelsen af ​​GC i forskellige individer. Der kan være nogle andre vigtige gener eller faktorer, der er ansvarlige for tumorigenese i GC patienter i hvis GC væv miR-10a er uændret eller opreguleret. Derudover MIR-10a-ekspression udviste ingen korrelation med klinisk-patologiske karakteristika bortset TNM fase, hvilket indikerer, at MIR-10a kan spille en delvis rolle i tumorigenese især i tidlige stadier.

Mange miRNA er blevet rapporteret at korrelere med tumorigenese imidlertid den underliggende molekylære mekanisme er stadig uklar. I vores rapport, en funktionel analyse af miR-10a, herunder celleproliferation, migration og invasion assays, hjalp os til bedre at forstå det bidrag, miR-10a til gastrisk carcinogenese. Transfektion af MIR-10a efterligne signifikant inhiberede celleproliferation, migration og invasivitet i GC-celler, hvilket viser, at undertrykkelsen af ​​MIR-10a kan fremme tumorudvikling i gastrisk carcinogenese. Der er behov for fremtidige undersøgelser for at belyse denne mekanisme.

I det menneskelige genom,

miR-10a

er placeret opstrøms for

HOXB4

.

MIR-10b

, et andet medlem af miR-10 familien er placeret opstrøms for

HOXD4

. Disse to medlemmer er forskellige fra hinanden i kun én base og har samme frø sekvenser, hvilket tyder på deres lignende funktioner. Kwoneel Kim [12] har rapporteret, at MIR-10b spiller en rolle i GC som en tumorsuppressor. I vores undersøgelse demonstrerede vi, at overekspression af MIR-10a inhiberede tumor proliferation, migration og invasivitet, som var magen til funktionen af ​​MIR-10b i GC. HOX-gener er stærkt konserverede transkriptionsfaktorer, der er afgørende for korrekt anterior-posterior mønsterdannelse af kroppens akse [23]. HOXA1 er blevet valideret som et direkte mål for miR-10a i human bugspytkirtelkræft [17] og megakaryocytopoiese [18].