PLoS ONE: potentielle rolle for Metnase transposasen Fusion Gene i tyktarmskræft gennem regulering af Key Gener

Abstrakt

Metnase fusion gen består af et sæt histon methyltransferase domæne og et transposasen domæne fra Mariner transposasen. Denne overføres element er involveret i kromosom decatenation, forbedrer DNA-reparation, fremmer fremmed DNA integration, og hjælper topoisomerase II-funktion. Denne undersøgelse undersøger rollen som Metnase i tyktarmskræft homeostase og vedligeholdelse af stemness fænotype i coloncancer stamceller (CSCS). Silencing af Metnase blev udført i menneskelige kræftceller før og efter behandling med cisplatin, og i kolon CSCS. Efterfølgende ændringer i ekspressionen af ​​gener involveret i reparationsmekanismer, DNA-syntese, topoisomerase II funktion og metastase samt stemness transkriptionsfaktorer blev undersøgt med RT-qPCR eksperimenter. Cellulær levedygtighed og apoptose blev vurderet med flowcytometri. Resultaterne antyder, at Metnase påvirker ekspressionen af ​​mange gener involveret i de ovennævnte processer. Desuden Metnase niveauer synes at påvirke ekspressionen af ​​NANOG, OCT3 /4, og SOX2. Undertrykkelse af Metnase førte også til en stigning i apoptose. Derfor kan Metnase besidde en vigtig rolle i DNA-reparation, topoisomerase II-funktion, og vedligeholdelse af stemness under udviklingen tyktarmskræft

Henvisning:. Apostolou P, Toloudi M, Kourtidou E, Mimikakou G, Vlachou I, Chatziioannou M, et al. (2014) potentielle rolle for Metnase transposasen Fusion Gene i tyktarmskræft gennem regulering af Key gener. PLoS ONE 9 (10): e109741. doi: 10,1371 /journal.pone.0109741

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret: 8. september 2014; Udgivet: 15 oktober 2014

Copyright: © 2014 Apostolou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Alle forfatterne er medarbejdere i Research Genetisk Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd), og modtog løn fra R.G.C.C. Ltd, som støttede denne undersøgelse. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle forfatterne er medarbejdere i Research Genetisk Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd). Den R.G.C.C. Ltd finansieret denne undersøgelse. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Metnase er en fusion gen med et sæt histon methyltransferase domæne og en Mariner transposasen domæne. Flere af de vigtigste funktioner i HsMar1 transposasen deles med Metnase [1]. Metnase er en ikke-homolog ende-sammenføjning (NHEJ) reparation protein [2], og er involveret i mange cellulære processer, herunder mægling af fremmed DNA integration, kromosom decatenation [3], og DNA-reparation [4] og replikation [5]. Metnase yderligere medierer resistens over for topoisomerase II-hæmmere gennem en interaktion med topoisomerase (DNA) II alpha (TOP2A) [6]. Disse etablerede roller i kombination med de seneste eksperimentelle data tyder på, at Metnase kan have en afgørende rolle i udviklingen af ​​kræft og progression, som kunne udnyttes under kræftbehandling.

Tyktarmskræft er den anden hyppigste årsag til kræft hos kvinder, de tredje i mænd, og den fjerde mest almindelige årsag til kræft død samlet [7]. Brugen af ​​platin-baserede kemoterapeutika er hverdagskost i behandlingsregimer. Men mange patienter enten besidde eller udvikle resistens over for disse forbindelser [8]. Desuden cancer stamceller (CSCS) har kapacitet til selv-fornyelse og er resistens over for kemoterapi og strålebehandling [9]. Derfor er forbedringer af de nuværende behandlingsstrategier påkrævet.

Den foreliggende undersøgelse undersøger forholdet mellem Metnase genekspression og kolorektal cancer udvikling. Som transposerbare genetiske elementer er impliceret i genom omlejring, kan de regulerer mange transkriptionsfaktorer. Disse faktorer kunne til gengæld regulere gener, der er involveret i resistens, metastase, eller apoptose. En evaluering af komplement af gener, der er berørt af Metnase samt deres sammenhæng med grundlæggende cellulære aktiviteter kan øge vores forståelse af, hvordan Metnase påvirker udviklingen af ​​kræft. En sådan viden kunne også bidrage til forbedringer i kræft behandling programmer.

Dette studie undersøger ekspressionsniveauerne af flere gener vigtige i cellulær udvikling og DNA-syntese og reparation før og efter knockdown af Metnase af siRNA. Disse gener blev DNA excision reparation protein (ERCC1), dipeptidylpeptidase IV (CD26), met-protoonkogen (cMET), TOP2A, topoisomerase (DNA) II beta (TOP2B), thymidylatsyntase (Tyms) og DNA (cytosin-5-) -methyltransferase 1 (DNMT1). Virkningen af ​​Metnase lyddæmpning blev også undersøgt i en kolorektal cancer cellelinie efter behandling med cisplatin. Mens oxaliplatin hovedsagelig anvendes i kliniske omgivelser, her ønskede vi at undersøge den rolle, som Metnase i en resistent cellelinje. Ifølge eksperimenter, der tidligere blev udført på HCT-116-cellelinien, har vi fundet, at flere resistensmekanismer udvikler sig efter behandling med cisplatin. Endelig blev en potentiel sammenhæng mellem Metnase og vedligeholdelse af stemness fænotype af tyktarmen CSC undersøgt ved lyddæmpning Metnase og måle niveauet af NANOG, POU klasse 5 homeobox1 (OCT3 /4), og SRY (sex bestemme region Y) -box2 (SOX2) , som alle har afgørende roller i opretholdelsen af ​​stemness [10], [11].

Materiale og metoder

Cell kultur

Humane kolon CSCS (36112-39P ; Celprogen, CA, USA) og HCT-116 human colon carcinomceller (91.091.005; ECACC, UK) blev dyrket i passende vækstmedium (M36112-39PS, Celprogen og D5546; Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) suppleret med 10% FBS (10270-106, Gibco, NY, USA) i 25 cm

2 kolber (E36102-29P-T25, Celprogen, og 430639, Corning, NY: USA) ved 37 ° C i en CO 5%

2 miljø. HCT-116 celler blev også behandlet med 1 mg /ml cisplatin (P4394, Sigma-Aldrich). I mere end 10 passager og dyrket i en lignende måde

siRNA transfektion

Under den eksponentielle vækst fase blev celler udpladet i plader med 24 brønde (E36112-39, Celprogen, og 831,836; Sarstedt, Nümbrect, Tyskland) og transficeret med Metnase-specifikke siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 Reagent (11.668-027; Invitrogen, CA, USA), ifølge producentens instruktioner. Den siRNA (5′-UAAAACCUCACCAGCAUAUUU-3 ‘) er designet i overensstemmelse med reglerne i Reynolds et al. [12] og underkastet BLAST analyse for at sikre specificitet. Efter 48 timers inkubation blev celler høstet ved trypsinisering (25.200-072; Invitrogen). Køretøj-alene og ikke-specifikke siRNA kontroller blev inkluderet. MRNA knockdown blev beregnet i forhold til den ikke-targeting kontrol siRNA i hvert forsøg. Forsøg blev gentaget tre gange in triplo. Ekspressionen af ​​genet af interesse og procentvise knockdown blev beregnet under anvendelse af komparativ Ct metode:

Evaluering af celler

Celler blev evalueret ved cellulære og molekylære assays. Cellulære assays var baseret på evnen hos CSCS til dannelse af mikrosfærer. Kulturerne er tidligere blevet evalueret af genekspression analyse af specifikke transkriptionsfaktorer, så autentificering af cellelinier blev gennemført ved måling af korte tandem repeat profil og sammenligne med fabrikantens profil. Dyrkning af CSCS blev gennemført i over 30 passager for at udelukke muligheden for at indarbejde embryonale stamceller (økonomiske og sociale råd) i forsøgene, da CSCS er udødelige modsætning økonomiske og sociale råd.

Molekylær Analyser

RNA fra cellekulturer blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini kit (74105; Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA-prøver blev bedømt både spektrofotometrisk og ved agarosegelelektroforese visualisering af 18S-28S bands. Genomisk DNA blev fjernet ved anvendelse af RNase-fri DNase (79254; Qiagen) .Subsequently, 1 ug dette RNA blev anvendt som en template til cDNA syntese med en iScript cDNA-syntese kit (1.708.891; Bio-Rad, CA: USA). Real-time PCR, blev udført under anvendelse af iTaq Universal SYBR Green Supermix (1725124; Bio-Rad) med hver prøve i tre eksemplarer. Specifikke primere for hver markør og for et endogent kontrol gen (18S rRNA) blev udformet med Genamics Expression 1.1 software [13] – [16]. Primer sekvenser blev analyseret ved BLAST at udelukke dem, der forstærkes uønskede gener. Tabel 1 viser sekvenserne af primerne

PCR-reaktionen programmet var følgende:. Indledende denaturering ved 95 ° C, 50 cykler af denaturering ved 95 ° C i 10 sek, efterfulgt af annealing ved 59 ° C i 30 sek. Et sidste forlængelsestrin blev udført ved 72 ° C i 10 minutter efterfulgt af smeltekurveanalyse. Data blev analyseret ifølge fremgangsmåden af ​​Livak og Schmittgen [17]. I alle PCR-reaktioner, blev egnede kontroller anvendes. Den positive kontrol var cDNA fra en universel menneskeret reference-RNA (740.000 til 41, Agilent, CA, USA) og negative kontroller var no-skabelon, ingen enzym styrer samt Humant genomisk DNA (G304A, Promega, WI, USA). Endelig blev en no-revers transkription kontrol anvendes i cDNA syntese. Standardkurverne for alle primere er vist i figur S1

Flowcytometri

Celler blev farvet med PE Annexin V og 7-amino-actinomycin. (559.763, BD Biosciences, CA, USA) i 15 minutter efterfulgt af resuspension i 0,5 ml sheath fluid (8.546.859; Beckman Coulter, Nyon, Schweiz) og flowcytometri analyse af mere end 50.000 begivenheder. Data blev analyseret med FCS Express Software (DeNovo). I hvert tilfælde relevante positive og negative kontroller blev brugt

Statistisk analyse

kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) resultater blev vurderet i henhold til den Kolmogorov-Smirnov test.; alle prøver havde normalfordeling. Medianværdier blev anvendt til analysen. Mann-Whitney test blev også udført på de qPCR data [18], [19]. Alle eksperimenter blev udført i tredobbelte tre gange. En p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Gene Expression

Silencing af Metnase udtryk ved siRNA var op til 65% effektive i HCT-116 celler, 52. % i HCT-116-celler behandlet med cisplatin, og 40% i kolon CSCS (Figur 1-3). Suppression af Metnase i HCT-116-celler førte til en stigning i CD26-genekspression og et fald i ekspressionen af ​​alle andre gener målte Dette fald var højere for TOP2A, TOP2B, ERCC1, Tyms, og DNMT1, der spænder fra 25-35%, mens der blev observeret et mindre fald på 5-10% af cMET ekspression (figur 1). ERCC1 er involveret i DNA-reparationsprocesser, og dets ekspression er blevet forbundet med følsomhed denne cellelinje til platinforbindelser [20].

Relativ genekspression af transkriptionsfaktorer i Colon CSCS efter Metnase knockdown. Andelen af ​​Metnase knockdown nåede 40%. Den ΔΔCt metode blev anvendt til at udføre analysen. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet af Ct-værdier. Analyserne blev udført tre gange og en p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. I kontrolprøven den gennemsnitlige værdi 1,00 indikerer, at der ikke er nogen ændring i genekspression. Værdier 1 viser en stigning i genekspression mens værdier 1 indikerer et fald i genekspression. Betingelserne for efterfølgende eksperimenter var de samme.

Relativ genekspression af transkriptionsfaktorer i HCT-116-celler efter Metnase knockdown. Procentdelen af ​​knockdown nåede 65%.

Relativ genekspression af transkriptionsfaktorer i HCT-116-celler behandlet med cisplatin, efter Metnase knockdown. Procentdelen af ​​knockdown nåede 52%.

Vi observerede lignende resultater i HCT-116 celler behandlet med cisplatin. Den forøgede fald i topoisomerase II-genekspression set efter Metnase inaktivering i HCT-116-celler behandlet med cisplatin sammenlignet med dem ikke behandles, er også bemærkelsesværdig. Tyms og DNMT1 udtryk blev reduceret med op til 60%, mens TOP2B udtryk blev reduceret med 18-35%, og cMET med næsten 40%. ERCC1 niveauer blev ikke påvirket, hvilket indikerer, at behandling med cisplatin for mange passager fører til udvikling af resistensmekanismer (figur 2).

Efter nedregulering af Metnase i kolon CSCS, det eneste gen målt som viste forøget ekspression var CD26. Et fald blev observeret for de Tyms og TOP2A gener, mens ekspressionen af ​​ERCC1, cMET, og TOP2B optrådte upåvirket (figur 3). Disse resultater viste, at CSCS er mere modstandsdygtige over for kemoterapeutiske midler end differentierede cancerceller. Generelt blev ekspressionsniveauerne af gener betragtes som stemness transkriptionsfaktorer faldet efter silencing af Metnase ekspression i CSCS. Dette fald i ekspression var op til 60% for SOX2, 40% for OCT3 /4 og 45% for NANOG (figur 4).

Relativ genekspression analyse af stemness transkriptionsfaktorer NANOG, OCT3 /4, og SOX2 efter Metnase knockdown.

Cell levedygtighed-apoptose

antallet af celler undergår apoptose som bestemt ved flowcytometri blev fordoblet efter undertrykkelse af Metnase udtryk i både HCT-116 og HCT- 116 + cisplatin celler. En stigning i antallet af døde celler blev også observeret. Imidlertid blev cellulær levedygtighed ikke signifikant ændret. I kolon CSCS, nedsat cellelevedygtighed efter Metnase lyddæmpning, men blev ikke observeret nogen ændring i antallet af celler, der undergår apoptose. Populationen af ​​døde celler var højere i HCT-116-cellelinje end i de to andre. Dette kunne tilskrives de resistensmekanismer, der udvikler i cisplatin-behandlede cellelinje, eller sådanne mekanismer kan oprindeligt findes i CSCS. Tabel 2 viser data for hver cellelinie.

Diskussion

Metnase fusion gen methylerer histon H3 ved lysin 36 og besidder mange egenskaber ved en transposasen, herunder terminal inverteret repeat sekvens-specifik DNA-binding og DNA looping [21]. Det kan dog ikke fuldstændig gennemførelse reaktioner. Gennem sin methylering aktivitet, er Metnase impliceret i DNA-reparation af NHEJ pathway. Denne reparation aktivitet kræver en interaktion med Pso4 [22]. Den ERCC1 protein er også involveret gennem nukleotid excision reparation [23]. Denne undersøgelse tyder på, at der findes en sammenhæng mellem ERCC1 udtryk og Metnase. Specifikt undertrykkelse af Metnase medførte nedsat ekspression af reparationen genet, men dette var mindre udtalt, når celler blev behandlet med cisplatin. Dette understøtter endvidere en rolle for ERCC1 i cisplatinbehandling.

TOP2A er det primære decatenation enzym, løse sammenfiltrede eller catenated kromatider [24]. Denne undersøgelse bekræfter også, at Metnase medierer resistens over for topoisomerase II a-hæmmere, med genekspression af TOP2A påvirket mere end andre gener efter Metnase knockdown. Dette fald blev forbedret i celler behandlet med cisplatin og i CSCS. Endvidere undertrykkelse af både TOP2A og TOP2B blev observeret, hvilket indikerer, at Metnase kunne være et mål for kombinationskemoterapi med topoisomerase II-inhibitorer.

Ekspression af dipeptidylpeptidase IV (CD26) er korreleret med tyktarmskræft progression og CD26 + CSCS har blevet identificeret i human colorectal cancer. Her blev CD26 genekspression steget i alle tilfælde af Metnase knockdown. Dette enzym er forbundet med immunregulering, signaltransduktion og apoptose. Dette indikerer, at Metnase er involveret i reguleringen af ​​apoptose, måske gennem en interaktion med CD26 [25].

cMET proto-onkogen koder for hepatocytvækstfaktor-receptoren og er tæt forbundet med udviklingen af ​​kræft. Aberrant aktivering af cMET fører til tumorvækst, angiogenese og endelig metastase. I modsætning til normale stamceller, CSCS udtrykker cMET, lette kræft persistens og spredes [26]. Negativ feedback regulering af MET-afhængige invasiv vækst ved Notch er blevet demonstreret i Drosophila [27], og Notch generne også regulere MET i mennesker [28]. Men denne undersøgelse fandt ingen sammenhæng i cMet niveauer med dem af Metnase transposasen.

Vi observerede en sammenhæng mellem Metnase og to gener vigtige i DNA homeostase, Tyms og DNMT1. Genekspression af begge blev faldet i alle cellelinier efter silencing af Metnase ekspression. Tyms genererer thymidinmonophosphat, som efterfølgende phosphoryleret til thymidin trifosfat til anvendelse i DNA-syntese og reparation [29]. DNMT1 er et enzym involveret i reguleringen af ​​methylerede cytosinrester, og dens afvigende methylering er forbundet med kræft udvikling [30]. Dette fald i niveauet af Tyms og DNMT1 var forøget i celler behandlet med cisplatin. Derfor kan Metnase være impliceret i kræft udvikling og etablering gennem interaktion med eller indflydelse af flere enzymer, der besidder vigtige roller i kræft.

Vi undersøgte også forholdet mellem Metnase og transkriptionsfaktorer essentielle for at opretholde stemness. CSCS defineres ved evnen til at forny sig selv, differentiere og proliferere. CSCS udtrykker mange transskription faktor markører, men det vigtigste er NANOG, OCT3 /4 og SOX2 gen. NANOG udtrykkes i økonomiske og sociale råd og har en central rolle i at opretholde pluripotens. Dens overekspression forårsager selvfornyelse i økonomiske og sociale råd, mens dens fravær fører til differentiering [31], [32]. For at opretholde stemness, er tilstedeværelsen af ​​to yderligere transkriptionsfaktorer, OCT3 /4 og SOX2 påkrævet. OCT3 /4-ekspression er også forbundet med en udifferentieret stadie og selvfornyelse, danner en heterodimer med SOX2 og sammen disse to proteiner binder til DNA. SOX2 er en transkriptionsfaktor afgørende for opretholdelse pluripotens, men dens ektopisk ekspression kan være involveret med unormal differentiering af colorektale cancerceller [33], [34]. Knockdown af Metnase medførte nedsat genekspression af alle transkriptionsfaktorer, hvilket indikerer, at Metnase kan være involveret i kræft etablering samt i kræft udvikling og fremskridt.

Cellular levedygtighed optrådte upåvirket af Metnase knockdown. Den cisplatin-behandlede cellelinie viste sig at have færre døde celler i sammenligning med den ikke-behandlede cellelinie. Lignende resultater blev opnået ved hjælp af kolon CSCS. Dette understøtter yderligere modstanden i kemoterapi observeret i CSCS. Imidlertid Metnase inaktivering gjorde indflydelse på antallet af celler, der undergår apoptose. Disse kunne forklares ved at udvikle alternative apoptose-unddrage mekanismer udviklingslande i CSCS sammenlignet med den behandlede cellelinje.

Denne undersøgelse identificerer, at Metnase fusionsgenet er stærkt involveret i DNA reparationsmekanismer, DNA-syntese, topoisomerase II modstand, apoptose, og vedligeholdelsen af ​​stemness fænotype i tyktarmskræft. er behov for yderligere undersøgelser for at belyse detaljerne i disse interaktioner.

Støtte Information

Figur S1.

Standardkurver – standardkurver for alle anvendte primere. A: 18S rRNA, B: Metnase, C: ERCC1, D: cMET, E: CD26, F: TOP2A, G: TOP2B, H: Tyms, I: DNMT1, J: NANOG, K: OCT3 /4, og L: . SOX2

doi: 10,1371 /journal.pone.0109741.s001

(TIF)