PLoS ONE: Forudsigelse af lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af en kombineret Approach

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er den hyppigste dødsårsag fra faste maligniteter verdensplan. Øjeblikket, gemcitabin er det eneste stof, der er godkendt til behandling af kræft i bugspytkirtlen. Udvikling af nye terapeutiske lægemidler for denne sygdom er derfor et presserende behov. C-Map-projektet har givet et væld af genekspression data, som kan udvindes til genplacering narkotika, en lovende tilgang til nye lægemiddelforskning. Typisk er et lægemiddel betragtes som potentielt anvendelige til behandling af en sygdom, hvis lægemiddel-induceret differentiel genekspression profil negativt korreleret med de differentielt udtrykte gener i målsygdommen. Men mange af de potentielt nyttige lægemidler (puds) angivet ved genekspressionsprofil korrelation er sandsynlige falske positiver, fordi, i C-Map, de dyrkede cellelinier, som lægemidlet udgør ikke afledt fra syge væv. For at løse dette problem, har vi udviklet en kombineret fremgangsmåde til forudsigelse lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen. Vi først identificeret PUDs for kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af C-Map-baserede genekspression korrelation analyser. Vi anvendte derefter en algoritme (Met-express) til at forudsige vigtige bugspytkirtelkræft (KPC) enzymer involveret i bugspytkirtelkræft stofskifte. Endelig valgte vi kandidater fra puds ved at kræve, at deres mål være KPC enzymer eller de substrater /produkter af KPC enzymer. Ved hjælp af denne kombinerede tilgang, vi forudsagde syv lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen, hvoraf tre er understøttet af litteratur beviser, og tre blev eksperimentelt valideret til at være hæmmende for bugspytkirtelkræft celllines

Henvisning:. Ma Y, Hu J Zhang N, Dong X, Li Y, Yang B, et al. (2016) Forudsigelse af lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af en kombineret fremgangsmåde. PLoS ONE 11 (2): e0149896. doi: 10,1371 /journal.pone.0149896

Redaktør: Aamir Ahmad, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: August 13, 2015; Accepteret: 5 februar 2016; Publiceret: 24 feb 2016

Copyright: © 2016 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af International Science and Technology Samarbejde og Exchange Program i Shaanxi-provinsen (Grant nr 2015KW-045, XW), Videnskab og Technology Research Program i Shaanxi-provinsen (2013K-12-20-10, JH), og National Natural Science Foundation of China [91.231.116, 31.471.245, 31.071.113, WT]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den hyppigste dødsårsag fra faste maligniteter verdensplan [1]. De fem-års overlevelse på patienter diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen er mindre end 5% [2]. Denne dårlig prognose kan tilskrives en næsten symptomfri progression, manglen på effektive tidlig diagnosticering biomarkører, og begrænsninger i de tilgængelige behandlingsmuligheder. I øjeblikket gemcitabin er den eneste terapeutiske lægemiddel godkendt til behandling af kræft i bugspytkirtlen, men svarprocenten er dårlig [1]. Udvikling af nye terapeutiske lægemidler for kræft i bugspytkirtlen er derfor et presserende behov.

En fælles strategi for udvikling af lægemidler er at udføre high-throughput screening mod en stor pulje af molekyler, og identificere blyforbindelser, der viser aktivitet mod en givet mål [3]. Men selvom puljen af ​​tilgængelige små molekyler er meget stort, er det stadig ufuldstændig og den bedste forbindelse kan ikke medtages. Selv om en ledende forbindelse er identificeret gennem high-throughput screening, kan det ikke være vellykket til klinisk anvendelse i betragtning af kompleksiteten af ​​sygdomstilstanden [4].

Fremgangsmåderne til at udvikle et nyt lægemiddel er ikke kun meget dyrt, men også tidskrævende. For nylig har drug repositionering (dvs. nye terapeutiske anvendelser af eksisterende lægemidler) tilvejebragt et lovende alternativ vej til nye opdagelse af lægemidler [5]. Fordelen ved at anvende en eksisterende lægemiddel fremgår; det er blevet allerede godkendt, hvilket gør det potentielt salgbare i en hurtigere og mere omkostningseffektiv ved at springe fase I kliniske forsøg måde. Der er blevet foreslået adskillige fremgangsmåder til lægemiddelindgivelse repositionering [5]. Mange af disse er baseret på en analyse af genekspression data [6]. Begrundelsen for genekspression-baserede drug repositionering er enkel: hvis to lægemidler fremkalde lignende genekspressionsmønstre, så de kunne have lignende terapeutiske virkninger. Efter denne rationale, Lamb

et al

. udviklet “Connectivity kort (C-Map) projektet” ved at generere udtryk profiler for dyrkede humane celler udsat for tusindvis af forskellige lægemidler [7]. C-Map-projektet har givet et væld af data, der kan udvindes til at identificere nye terapeutiske anvendelsesmuligheder for eksisterende lægemidler.

Som reaktion på lægemiddelbehandling, dyrkede celler kan undergå væsentlige ændringer på transkriptomet niveau. Men på samme tid, ville syge celler (fx cancerceller) også har betydelige ændringer i ekspressionen af ​​et stort antal gener [8]. Hvis ændringerne i genekspression mønstre induceret af et lægemiddel er negativt korreleret med ændringer i cancer-specifik genekspression mønstre, så er det sandsynligt, at behandling med dette lægemiddel har potentialet til at ændre genekspression mønstre i cancerceller, og dermed cancer celleudvikling . Dette koncept er blevet undersøgt i adskillige undersøgelser [9,10]. For eksempel, Kunkel

et al

. identificeret ursolsyre, kan der reducerer fastende-induceret muskelatrofi, anvendte den fremgangsmåde af negativ genekspression korrelation [9]. Men denne tilgang begrænset i at dyrkede celler i C-Map-projektet er ikke afledt af syge væv. Således kan den observerede negative korrelation mellem lægemiddelinducerede og sygdomsspecifikke celle-specifikke ændringer i genekspression ikke være biologisk meningsfuld, og de identificerede lægemidler kan være falske positive. Således er der behov for yderligere foranstaltninger for at vælge lægemiddelkandidater.

Kræftceller undergår signifikante metaboliske ændringer og tilpasninger [8]. For eksempel i bugspytkirtelkræftceller, er der en signifikant øget optagelse af glukose, der driver ukontrolleret celledeling [11,12]. Enzym-kodende gener, der spiller vigtige roller i ændret cancercellelinie metabolisme er derfor potentielle lægemiddelmål [8]. I C-Map, er kendt målene i hvert lægemiddel. Hvis målene er de vigtigste pancreas cancer (KPC) enzym-kodning gener involveret i cellens stofskifte, og hvis lægemiddelinducerede ændringer i genekspression mønstre negativt korreleret til ændringer i bugspytkirtelkræftceller, så er det meget sandsynligt, at dette stof vil være af terapeutisk anvendelse. Men uanset om målet for et kendt stof er genet af et vigtigt enzym, og som enzym-kodende gener er nøglen i bugspytkirtelkræft cellens stofskifte, er ikke kendt.

For nylig har vi udviklet en algoritme kaldet Met- udtrykker til forudsigelse af de vigtigste enzym-kodende gener i cancer stofskifte og har søgt denne algoritme held til lunge-, lever-, og brystkræft [13]. Denne algoritme involverer integrere en cancer gen co-ekspression netværk med et metabolisk netværk bestående af enzym-kodende gener. Fordi Met-express er en generel fremgangsmåde, kan den påføres let at forudsige KPC enzym-kodende gener, som derefter kan anvendes til udvælgelse af lægemiddelkandidater, der opnås ved gen-ekspression baseret analyse. Efter denne strategi, vi forudsagde syv lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen. Tre er understøttet af litteratur beviser, mens de andre er værdig til yderligere undersøgelse.

Materialer og metoder

Indsamling og behandling af pancreas cancer datasæt

Vi anvendte følgende kriterier ved valg af pancreas genekspression datasæt fra NCBI GEO database [14]. Vi søgte databasen GEO med nøgleordene: “menneskelige pancreascancer”. Vi krævede prøverne i en pancreatisk genekspression datasæt være fra normale og cancer væv, i stedet for fra ikke-tumorvæv, såsom perifere mononukleære blodceller og spyt. Vi krævede også antallet af nomal og kræft prøver være sammenlignelige med hinanden, og prøven størrelse genekspression datasæt være større end 30. Med disse kriterier, har vi fået tre bugspytkirtlen genekspression datasæt (se tabel 1 for GEO accessionsnumre og beskrivelser). To af tre datasæt har mere end 90% af almindelige gener.

R pakke til limma [15] blev anvendt til at normalisere genekspressionsprofiler i disse datasæt. Log2 transformation af ekspressions- værdier blev påført, hvis medianen udtryk værdi i den oprindelige datasæt var større end 16. Gener med for mange null ekspressionssystemer værdier blev fjernet. At inspicere, om de tre pancreas datasæt var for ligner hinanden, vi beregnet et Pearson Correlation Coefficient (PCC) for hvert par af de tre datasæt ved hjælp ekspressionsprofilen af ​​de fælles gener. PCCS for GDS4336 og GDS4103, GDS4336 og GDS4102, GDS4103 og GDS4102 var 0,702, 0,734, og 0,908, henholdsvis. Således havde gener i disse tre datasæt korreleret, men ikke meget lignende ekspressionsniveauer, hvilket gør det hensigtsmæssigt at bruge dem i denne undersøgelse. Endelig Vi bruges limma at identificere gener, der blev differentielt udtrykte (DE) mellem cancer og normale prøver [15]. En DE genet blev identificeret, hvis dens justerede p-værdi (FDR) var under 0,01 og fold ændring var større end 2.

Indsamling af C-Map-gen rang profiler

Gene rang profiler blev downloadet fra C-Map database [7]. Et gen rang profil svarede til en rangeret gen differentiel ekspression profil for en dyrket cellelinje i respons på lægemiddelbehandling, med den mest op- og ned-regulerede gener sorteret laveste og højeste hhv. I alt blev 6.100 lister over sorteret gener opnået, svarende til behandling af fem dyrkede humane cellelinier med 1.309 lægemidler.

Bestemmelse af korrelationen mellem DE gener i en bugspytkirtelkræft datasæt og lægemiddel-induceret rangeret gen lister i C-Map

Den procedure, der er beskrevet i Lamb

et al

. [7] blev fulgt til at beregne korrelationer mellem bugspytkirtlen kræft dE gener og narkotika-induceret klassificeret gen lister fra C- Kort. Kort fortalt, for en lægemiddel-induceret gen rang liste og listen over DE gener fra en pancreascancer genekspression datasæt, anvendt vi Kolmogorov-Smirnov test [16] for at fastslå, om disse to lister var negativt korreleret, dvs. opreguleret gener i bugspytkirtelkræft blev nedreguleret i lægemiddelbehandlede dyrkede celler (placeret nær bunden af ​​lægemiddel-induceret rang liste), og vice versa. Den p-værdi fra Kolmogorov-Smirnov test blev justeret ved FDR [17]), og tærsklen betydning for den justerede p-værdi blev fastsat til 0,1.

Met-express procedure

Detaljeret procedurer Met-express er beskrevet i vores tidligere publikation [13]. Kort fortalt blev en cancer gen co-ekspression netværk først konstrueret til en cancer genekspression datasæt ved at følge proceduren tidligere [18] beskrevne. Hvert netværk blev derefter delt i gen co-ekspression moduler ved hjælp Qcut [18]. En modtager opererer karakteristisk kurve blev plottet for hvert gen modul ved hjælp af medianen genekspression værdi i hver prøve at klassificere kræft versus normale prøver, og arealet under Receiver Operating karakteristik at bestemme cancer-specificiteten af ​​genet modulet. Et enzym-kodende metaboliske netværk af 860 gener blev konstrueret som i [13]. Deres relationer blev fastsat på grundlag af enzymatiske reaktioner, dvs., hvis produktet af en metabolisk reaktion katalyseret af et givet enzym var substratet af en anden reaktion katalyseret af et andet enzym, så var der en forbindelse mellem de to enzym-kodende gener. Endelig Met-udtrykkelig inkorporeret både kræft-specificitet oplysninger af co-ekspression modul, og berigelse af graden af ​​metaboliske links i et gen inden i modulet, at tildele en betydning score for hvert enzym-kodende gen. Gener med en betydning score over medianen blev forudsagt at være vigtige enzym-kodende gener. Met-express blev påført på lunge-, bryst- og leverkræft, og dens forudsigelser blev valideret med både litteratur og eksperimentere bevismateriale [13]. Her har vi anvendt Met-express til at forudsige vigtige enzym-kodning gener i hver af tre pancreas cancer datasæt.

Funktionel berigelse analyse

GO [19] annotation fil blev opnået den 23. nov 2014. Den vej anmærkninger var fra MSigDB [20]. Funktionel berigelse blev udført ved anvendelse af Fishers test med R. p-værdien blev justeret ved FDR og tærsklen signifikans blev sat til 0,1.

Cellekultur og MTT-assay Salg

“Menneskelige pancreas cancercellelinier (PANC-1, BxPC-3) blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og holdt som ATCC foreslået. Cellekulturmediet indeholdt 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Virkningerne af testforbindelserne på cellelevedygtigheden blev bestemt ved anvendelse af MTT (3- (4,5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-di-phenytetrazoliumromide) assay. Kort fortalt blev de eksponentielle celler eksponeret for trypsin (Amresco, 0457) til at dissociere adhærente celler, og fortyndet til 1-10 x 104 /ml celler suspension. Suspensionen celler blev dyrket i 96-brønds plader med 1 x 104 celler per brønd ved 37 ° C med 5% carbondioxid i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med forbindelsen Biotin, Finasteride og progesteron eller DMSO-vehikel som kontrol for 48hr ved den tilsvarende koncentration, 1 × 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 og 1 mg /ml, med tre gentagelser i hver koncentration. Efter at 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml; Amresco Inc, 0793-1G) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C for at reagere med aktive celler danner formazankrystaller. Efter fjernelse af supernatanten blev de formazankrystaller opløses i 150 pi DMSO, og absorbansen (OD) ved 570 nm blev registreret under anvendelse mikropladelæseren (Rayto, Rt2100c). Medikamentet inhibering på celler blev derefter beregnet som: 1 –(OD

compound−OD

blank)/(OD

DMSO−OD

blank).

Results

Identification af lægemidler, hvis induceret-gen rang lister i C-Map negativt korreleret med DE gener i bugspytkirtelkræft

C-Map database indeholder tusindvis af klassificeret gen lister for dyrkede cellelinjer som reaktion på lægemiddelbehandlinger. I hver liste, er gener bestilles i henhold til deres DE-værdier mellem lægemiddelbehandlede og kontrol cellelinjer. Op- og ned-regulerede gener er placeret øverst og nederst på listen, hhv. Når en liste over DE gener i en bugspytkirtelkræft datasæt er blevet identificeret, kan sammenhængen mellem DE generne og hver af de lægemiddelinducerede gen rang lister (Fig 1A) beregnes. Hvis korrelationen er negativ og statistisk signifikant, så er det sandsynligt, at dette stof har potentiale til at vende genekspression mønster af bugspytkirtelkræftceller, og følgelig kan være nyttige til behandling af denne sygdom.

A. Workflow. B. Venn Diagram til puds identificeret for hver af de tre bugspytkirtelkræft datasæt.

Fra C-Map-database blev 6.100 klassificeret gen lister opnået, svarende til behandling af fem dyrkede humane cellelinjer med 1.309 lægemidler. Vi indsamlede også tre pancreas genekspression datasæt, og identificeret de respektive DE gener i hvert datasæt. Vi beregnede derefter sammenhængen mellem DE gener i hvert datasæt, og hver af de lægemiddelinducerede gen rang lister. Disse sammenhænge blev brugt til at identificere alle lægemidler, hvis induceret gen rang lister viste en statistisk signifikant negativ korrelation med DE gener (justeret p 0,1). Fordi hvert lægemiddel kan være blevet anvendt til behandling af flere cellelinjer, blev et lægemiddel for at være potentielt anvendelige bugspytkirtelkræft hvis den inducerede gen rang lister i mere end halvdelen af ​​de dyrkede celler viste en signifikant negativ korrelation med DE gener af at kræft datasæt. I alt blev 359 lægemidler fundet at være signifikant til mindst én af de bugspytkirtelkræft datasæt. Ud af disse lægemidler, 139 og 13 var signifikant til mindst to og alle tre bugspytkirtelkræft datasæt, (fig 1B). Begge tal var signifikant sammenlignet med det tilfælde, hvor vi tilfældigt udvalgt det samme antal lægemidler signifikant til en pancreascancer datasæt, og derefter inspiceret, hvor mange af dem var signifikant til to eller alle tre væsentlige datasæt (randomisering blev gentaget 1000 gange, og begge p-værdier 0,001). De 126 stoffer, der var signifikant i mindst to bugspytkirtelkræft datasæt blev anset potentielt nyttige lægemidler (puds) til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Anvendelse af Met-express til at forudsige vigtige enzym-kodende gener i bugspytkirtelkræftceller

de dyrkede humane cellelinjer behandlet med lægemidler i C-Map-database blev ikke stammer fra pancreas væv. Det var derfor vanskeligt at fortolke den mekanisme af de negative korrelationer mellem de lægemiddelinducerede gen rang lister og DE gener i pancreascancer. Således kan mange PUDs være falske positiver. For at løse dette problem, vi anvendte Met-express [13] for at forudsige KPC enzym-kodning gener. Vores rationale er, at hvis målet for en pud er en KPC enzym, er så chancerne for, at dette lægemiddel vil ændre genekspressionsprofilerne af kræft i bugspytkirtlen steget markant. Desuden, hvis en PUD er substratet eller produktet af en enzymatisk reaktion katalyseret af en KPC enzym, så chancerne for, at det ville forstyrrer cancer metabolisme er også steget. Derfor er PUDs med en af ​​de to ovennævnte egenskaber betragtes lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Met-express blev påført hver af de tre bugspytkirtelkræft datasæt. I alt 33 nøgleenzym kodende gener forudsagt i alle tre datasæt blev anset KPC enzymer (Fig 2A, S1 tabel). Før du bruger disse KPC enzymer til at vælge lægemiddelkandidater fra PUDs, vi valideret forudsigelserne fra begge funktionelle berigelse analyser og litteratur anmeldelser. De 33 KPC enzymer blev beriget med 66 GO biologisk proces vilkår og 11 MSigDB veje. Den øverste beriget MSigDB veje var relateret til O-glycan biosyntese veje, mens de øverste beriget GO vilkår blev funktioner relateret til miljøfremmede stimuli, fedtsyrer beta-oxidation, narkotika metaboliske processer og mere (Fig 2B, S2 tabel).

A. Venn-diagram for de forudsagte nøgleenzym-kodende gener for hver af de tre bugspytkirtelkræft datasæt. B. berigede veje og biologiske processer for KPC-enzymer forudsagt i alle tre kræft datasæt.

Unormal udtryk for glycoproteiner på overfladen af ​​kræftceller er blevet rapporteret [21]. Forøget ekspression af enzymer i glycan-relaterede biologiske processer fremmes Cellefrigørelse og invasion, og enzymer i disse veje blev foreslået at være hidtil ukendte mål for kræftbehandling [22]. Desuden blev aerobe glycolyse ofte aktiveres i pancreas tumorceller [23]. Den reducerede aktivitet af enzymer involveret i miljøfremmede stofskifte er forbundet med modtagelighed i bugspytkirtlen til carcinogenese [24]. Flere risikofaktorer, såsom diabetes og højt fedtindhold fødevarer, er også relateret til kræft i bugspytkirtlen [25,26]. Disse litteraturen rapporter viser, at de forudsagte KPC-enzymer er stærkt forbundet med udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen.

Brug de forudsagte KPC enzymer til at vælge lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen

Brug de forudsagte KPC enzymerne identificeret gennem Met-express, betragtes vi en pud som en kandidat lægemiddel til kræft i bugspytkirtlen, hvis: 1) en af ​​sine mål var en forudsagt KPC enzym, eller 2) det var enten underlaget eller produkt af den enzymatiske reaktion katalyseret af en forudsagt KPC-enzym . De mål, som hver PUD, og ​​forbindelserne svarende til hver PUD, blev opnået fra DrugBank databasen [27]. Fire PUDs blev fundet, hvis mål var den forudsagte KPC-enzymet, og tre blev fundet, der var substratet eller produktet af de enzymatiske reaktioner katalyseret af seks KPC enzymer (tabel 2). Disse syv PUDs blev betragtet som lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen

Nocodazole (DrugBank ID: DB08313). Ikke har været anvendt til behandling af kræft i bugspytkirtlen, men var en af ​​de lægemiddelkandidater, hvis mål inkluderet forudsagt KPC-enzymer . Det er et antineoplastisk middel, der interfererer med polymerisationen af ​​mikrotubuli [28]. Nocodazol er blevet rapporteret, at det har nogle reversible virkninger beskæftiger sig med multiresistens i bugspytkirtelkræft celle [29]. Hertil kommer, som en af ​​de mitotiske spindel forstyrrelser midler, Nocodazole fører til en mitosestandsning og mangler et flertal af pancreascancer med aneuploidi forårsaget af kromosomal ustabilitet [30,31]. Ifølge DrugBank, Nocodazole har kun ét mål, der er et forudsagt KPC enzym, hæmatopoietisk prostaglandin D syntase (hPGDS) (Fig 3A). HPGDS er medlem af sigma klasse glutathion-S-transferase familie, som katalyserer omdannelsen af ​​PGH2 til PGD2. Dette enzym er involveret i den integrerede bugspytkirtelkræft vejen (Biosystem ID: 711.360)

De eksempler på udvalgte lægemidler er:. A. nocodazol; B. tretinoin og retinoate.

Tretinoin og Arachidonsyre er to eksempler på lægemiddelkandidater, som er substrater eller produkter af de forudsagte KPC enzymer. Tretinoin (DrugBank ID: DB00755), også kaldet retinoate, er et substrat for de enzymatiske reaktioner katalyseret af tre KPC enzymer: CYP2C18, CYP3A7, CYP3A5 og (Fig 3B). Arachidonsyre (DrugBank ID: DB04557) er substratet for to KPC enzymer, CYP2C9 og CYP2C18, og også et produkt af en KPC enzym, CYP2J2. Interessant, de fem KPC enzymer relateret til DB00755 og DB04557 er alle involveret i linolsyre metabolisme og biologiske oxidationer (Fig 3B).

Tretinoin er carboxylsyren form af vitamin A og er blevet anvendt til behandling af acne vulgaris og keratose pilaris. For nylig, Guo

et al

. viste, at behandling af humane pancreascancer cellelinie, PANC-1, med tretinoin kunne dosisafhængigt inhibere væksten af ​​disse celler [32]. Dette antydede, at antitumorvirkninger af tretinoin var forbundet med G2 /M-fase standsning. Andre forskere har rapporteret, at Arachidonsyre sinificantly kan reducerede væksten i nogle bugspytkirtelkræft cellelinjer såsom PANC-1, MIA PaCa-2 og CFPAC [33].

Der er også nogle lignende forbindelser til PUDs der er blevet brugt eller indberettet for kræft i bugspytkirtlen behandling. For eksempel vincristin og demecolcin er lignende forbindelser til Nocodazole, der virker på microtubulesand forstyrre cellecyklus [34,35]. Vincristin, sammen med 5-fluorouracil-baserede kombinationsregimer, har vist sig at være effektive i bugspytkirtelkræft patienternes overlevelse forlængelse sammenlignet med ingen kemoterapi [36]. Demecolcinearrests den tidlige mitose i begge pancreactic cellelinier PANC-1 og BxPC-3-celler [37]. Også, Retinol (Vitamin A) og Ergocalciferol (vitamin D

2) er lignende forbindelser med tretinoin, som er blevet foreslået, at indtagelse af D-vitamin, Retinol og andre multivitamin supplement kan reducere risikoen for kræft i bugspytkirtlen [38].

for at validere de identificerede PUDs i kræftceller, lykkedes det os at søge narkotika respons data i nogle database med kræftceller. De amerikanske National Cancer Institute 60 menneskelige kræftceller (NCI-60), som kan tilgås af CellMiner [39] (https://discover.nci.nih.gov/cellminer)includes 60 kræftceller repræsenterer ni menneskelige kræftformer: bryst , centralnervesystemet, colon, nyre, leukæmi, lunge, melanom, æggestok, og prostata, med tilladt hurtige data for udskrifter til 22,379 gener og 360 microRNA sammen med aktivitetsrapporter for 20,503 kemiske forbindelser, herunder 102 lægemidler godkendt af den amerikanske Food and Drug administration (FDA) [40]. Der var ingen data om bugspytkirtelkræft cellelinjer i NCI-60, hvilket gør det umuligt at direkte inspicere narkotikarelaterede lydhør data vore forudsagte PUDs på kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Imidlertid kunne narkotika reagerende data PUDs på andre kræft cellelinjer i NCI-60 indirekte hjælpe os med at udlede deres potentielle nytte på kræft i bugspytkirtlen cellelinjer.

Blandt syv PUDs vi har identificeret, tre af dem kan være fundet i narkotika zscore mønstre af NCI-60, herunder Nocodazole (NSC # 238.159), Progesteron (NSC # 9704) og tretinoin (NSC # 122.758). Det er blevet rapporteret, at forbindelser aktivitet -log

10GI50 (50% vækstinhiberende niveauer) større end 6 anses for aktive [41]. For op til 60 cancer cellelinjer, lykkedes det os at forespørge, om vores PUDs er aktiv for dem. Brug CellMiner NCI-60 Analysis Tool, vi søgte narkotika aktivitet mønstre på tværs 60 cellelinjer og fandt, at for Nocodazole og tretinoin, de har 55 og 2 cellelinjer, hvis aktivitet er større end 6, hhv. Den største aktivitet for Progesteron er 5.94. Dette har indikeret, at de tre PUDs findes i NCI-60 har også hæmning effekter til andre cancerceller mere eller mindre.

Eksperimentel validering for narkotika forudsigelse

Udover Nocodazole, Tretinoin og arachidonsyre med offentliggørelse beviser, tre af de andre fire PUDs: biotin, Finasteride og progesteron blev udvalgt til yderligere eksperimentel validering. Vi har udført MTT assay på pancreas cancer cellelinjer PANC-1 og BxPC-3 til at estimere kræftcellen levedygtighed behandles med medicin. Sammenlignet med PANC-1, BxPC-3 blev dyrket fra en patient med senere trin tumor der døde 6 måneder senere. Som begge fra pancreas kanalen, PANC-1 har en tendens til at vise færre duktale funktioner end BxPC-3 [42]. For celle migration, PANC-1 er bedre end BxPC-3. Mens BxPC-3 viste en høj angiogen potentiale, og PANC-1 viste variable resultater [42].

Resultater (fig 4, S3 tabel) viste, at når koncentrationen blev forøget til 0,1 mg /ml, tre af de to lægemidler, Finasteride og progesteron, har tydelige kræftcelle hæmning indvirkninger på PANC-1, mens inverse virkninger for biotin. Som for fremskreden kræft cellelinje BxPC-3, dødeligheden af ​​alle tre stoffer blev alvorligt med koncentrationen incereasing, ens for Finasteride og progesteron, og svagere for biotin. BxPC-3 viste en mere følsomhed over for medicinsk behandling end PANC-1, hvilket indikerede, at disse stoffer kan have en større indflydelse på thetumor angiogenese.

A. Pankreatisk cellelinie PANC-1. B. Pankreatisk cellelinie BxPC-3. X og Y-koordinater angiver koncentration og inhiberingsgraden af ​​de tre lægemidler, biotin, finasteride og progesteron. Korte linjestykker om de punkter betegner variationen af ​​tre gentagelser.

Vi gik videre gennem narkotika virkninger på andre kræftformer, og fandt, at Progesteron (FDA godkendt) er ansvarlig for embryo implantation, graviditet vedligeholdelse, og udvikling af brystvæv til mælkeproduktion, som udskilles af corpus luteum og placenta. Det hasbeen rapporteret som en beskyttende faktor for æggestokkene og livmoderkræft med lidt kendt af mekanismen [43]. I lægemidlet mønster database (https://discover.nci.nih.gov/cellminer/) NCI-60, Progesteron er særlig følsom over for lungekræft cellelinien LC: EKVX, leukæmi cellelinje LE: RPMI_8226, brystcancer celle- line BR: Hs578T, for 5,94, 5,49, og 5,48 som forbindelser aktivitet -log10GI50 henholdsvis

Samlet set beviser i litteraturen og eksperimentere tyder på, at mindst fem af vores forudsagte lægemiddelkandidater (Nocodazole, tretinoin, arachidonsyre. syre, progesteron, Finasteride), vil sandsynligvis være nyttige til behandling pancreascancer, mens de resterende to lægemidler er værdig til yderligere undersøgelse.

Discussion

i den aktuelle undersøgelse, beskriver vi udviklingen af en hidtil ukendt kombineret tilgang til forudsigelse lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen. I modsætning til tidligere stof repositionering tilgange, der fokuserer på at udnytte sammenhænge mellem genekspression og narkotika-induceret gen rang lister i C-Map, og DE generne under sygdomstilstande for at forudsige PUDs, vores tilgang identificeret PUDs for kræft i bugspytkirtlen gennem både genekspression korrelation analyser og en ekstra foranstaltning til valg lægemiddelkandidater fra listen over PUDs. Denne sidstnævnte udvælgelsesmetode anvendes en nylig udviklet algoritme, Met-express, at forudsige KPC enzym-kodende gener og derefter anvendes KPC enzymer til udvælgelse lægemiddelkandidater. Den kombinerede fremgangsmåde identificeret syv lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen, blandt hvilke tre blev støttet af litteratur beviser og yderligere to blev støttet af eksperiment. Dette understøttes nytten af ​​denne tilgang til at identificere lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Brugen af ​​KPC enzymer forudsagt af Met-express er en vigtig del af vores tilgang. Ifølge algoritme design af Met-express, bør de forudsagte vigtigste enzym-kodende gener deler følgende to egenskaber: 1) deres udtryk er væsentligt op eller nedreguleret i kræftceller, og 2) de er co-udtrykt med en markant højere antal enzym-kodende gener, der har delt metaboliske links. Således ændre udtryk af de vigtigste enzym-kodning gener vil sandsynligvis påvirke kræftcelle stofskifte. I mellemtiden, ændring af koncentrationerne af substraterne eller produkter af de metaboliske reaktioner katalyseret af de vigtigste enzym-kodende gener vil sandsynligvis have lignende virkninger. Faktisk Met-express forudsiger de vigtigste enzym-kodning gener som potentielle kræft drug mål, og deres substrater /produkter som potentielle lægemiddelstoffer. I den aktuelle undersøgelse, fordi PUD mål er kendte, er det muligt at kombinere de to typer af forudsigelser (KPC enzymer og PUDs) at vælge lægemiddelkandidater til behandling af kræft i bugspytkirtlen. Desuden denne tilgang giver mulighed for at hypotesen den molekylære mekanisme, hvormed de udvalgte lægemiddelkandidater kan arbejde mod kræft i bugspytkirtlen, enten ved at målrette en KPC enzym eller ved at interferere med vigtige enzymatiske reaktioner i kræftceller.

Selvom traditionelle screening tilgange kan identificere PUDs, forstå deres mekanismer er fortsat en udfordring. Fraværet af sådanne oplysninger kan forsinke kommercialiseringen af ​​PUDs, fremhæver fordelen ved at bruge vores kombinerede metode. Derudover, som en generel metode, vores kombinerede metode kan anvendes let til andre former for kræft og andre komplekse sygdomme, forbedre vores evne til at identificere lægemiddelkandidater.

Støtte Information

S1 Table. De forventede centrale enzym-kodning gener for hver af de tre bugspytkirtelkræft datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149896.s001

(XLSX)

S2 Table.