PLoS ONE: Angiopreventive Effekt af Pure Flavonolignans fra Milk Thistle Uddrag mod prostatakræft: Målretning VEGF-VEGFR Signaling

Abstrakt

rolle neo-angiogenese i prostatacancer (PSA) vækst og metastase er veletableret, men udviklingen af ​​effektive og ikke-toksiske farmakologiske hæmmere af angiogenese fortsat et uforrettet mål. I den forbindelse kunne målrette afvigende angiogenese gennem ikke-giftige fytokemikalier være en attraktiv angiopreventive strategi mod PCA. Begrundelsen for denne undersøgelse var at sammenligne den antiangiogene potentiale fire rene diastereoisomere flavonolignans, nemlig silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B, som vi tidligere har etableret som biologisk aktive bestanddele i Milk Thistle ekstrakt. Resultaterne viste, at oral indgift af disse flavonolignans (50 og 100 mg /kg legemsvægt) effektivt at hæmme væksten af ​​avancerede humane PCA DU145 xenotransplantater. Immunohistokemiske analyser afslørede, at disse flavonolignans hæmmer tumor angiogenese biomarkører (CD31 og nestin) og signalmolekyler regulerer angiogenese (VEGF, VEGFR1, VEGFR2, phospho-Akt og HIF-1α) påføres fartøjets-count i normale væv (lever, lunge, og nyre) af tumorbærende mus. Disse flavonolignans inhiberede også mikrokar spiring fra muse dorsale aorta

ex vivo

, og VEGF-induceret celleproliferation, kapillær-lignende rør-dannelse og invasivitet af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC)

in vitro

. Yderligere undersøgelser i HUVEC viste, at disse diastereoisomerer målrette cellecyklus, apoptose og VEGF-induceret signaleringskaskade. Tredimensionel vækst assay samt invasion co-kultur og

in vitro

angiogenese undersøgelser (med HUVEC og DU145 celler) foreslog den differentielle effektivitet diastereoisomererne mod PCA og endotelceller. Samlet set har disse undersøgelser belyst den sammenlignende antiangiogene effekt af rene flavonolignans fra Milk Thistle og foreslå deres anvendelighed i PCA angioprevention

Henvisning:. Deep G, Gangar SC, Rajamanickam S, Raina K, Gu M, Agarwal C et al. (2012) Angiopreventive Effekt af Pure Flavonolignans fra Milk Thistle Uddrag mod prostatakræft: Målretning VEGF-VEGFR Signaling. PLoS ONE 7 (4): e34630. doi: 10,1371 /journal.pone.0034630

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: December 23, 2011; Accepteret: 2. marts, 2012; Udgivet: 13 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Deep et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NCI R01 tilskud CA102514 og CA104286. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede non-kutant malignitet blandt mænd i USA, og er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Klinisk og eksperimentel evidens har foreslået, at humane tumorer kunne vare ved i år som mikroskopiske læsioner i en hviletilstand og deres videre vækst er kritisk afhængig af opnå en “angiogen fænotype” [2], [3], [4], [5] . “Angiogene switches ‘involverer høje VEGF og VEGF receptor (VEGFR) niveauer er blevet identificeret og betragtet ansvarlig for PCA progression fra lav PIN bedømmelse (prostata intraepithelial neoplasi) etape til høj PIN kvalitet og yderligere til mere aggressive, dårligt differentieret, og androgen- uafhængige maligne stadier [6]. Endvidere har angiogenese niveau i PCA blevet korreleret direkte med Gleason score, tumor stadie, progression, metastase og overlevelse [6], [7], [8]. Derfor har rettet mod angiogenese været genstand for flere kliniske undersøgelser for at forbedre livskvaliteten for kræftpatienter [9], [10], [11]. Desuden forhindrer udbrud af angiogenese i indolente tumorer (benævnt »angioprevention«) er blevet foreslået som en ny og rationale tilgang til kontrol PCA vækst, ondartet progression og metastaser til sekundære sites.

DU145 xenotransplantater blev igangsat og mus blev administreret enten vehikel (CMC) eller 50 og 100 mg /kg legemsvægt doser af hver diastereoisomer. (A) Tumorvolumen blev målt og afbildet som en funktion af tid (dage). Hver værdi i kurverne er middelværdi ± SEM på 10-12 mus. (B-D) xenograft væv blev analyseret for PCNA, TUNEL og spaltes caspase-3 (CC3) ved IHC. Den vises i bar diagrammer data er middelværdien ± SEM af 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

DU145 xenograft væv blev analyseret for CD31, nestin, VEGF og VEGFR2 ved IHC. Kvantitative analyser blev udført ved hjælp af Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og fotografierne blev oprindeligt fanget (ved 400x) med et Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Den vises i bar diagrammer data er middelværdien ± SEM af 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

DU145 xenograft væv blev analyseret for VEGFR1, HIF-1α, phosphoryleret Akt

Ser473 og totale Akt niveauer ved IHC. Kvantitative analyser blev udført ved hjælp af Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og fotografierne blev oprindeligt fanget (ved 400x) med et Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Den vises i bar diagrammer data er middelværdien ± SEM af 4-5 prøver. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

Om fire årtier siden, Juda Folkman først forudsagde den potentielle rolle for anti-angiogene inhibitorer mod solide kræftformer, og til dato har flere angiogenese-hæmmere blevet testet mod mange maligniteter [ ,,,0],12], [13], [14], [15]. Mange af disse inhibitorer er allerede godkendt af FDA til deres anvendelse enten alene eller i kombination med cancer kemoterapeutiske lægemidler [13], [15], [16]. For eksempel blev humaniseret VEGF antistof godkendt mod colorectal, hjerne, lunge, og renale cancere [16]. Ligeledes har den tyrosinkinasehæmmere sorafenib og sunitinib, som er målrettet VEGFR aktivitet, er godkendt til brug mod fremskredent renalcellecarcinom [16]. Selvom hæmme angiogenese i kræft i princippet er en god forebyggende /terapeutisk strategi, den nuværende tilgang målrette et enkelt molekyle, såsom VEGF eller VEGFR er behæftet med fejl, som kræftceller udvikler resistens gennem omgå disse molekyler og fortsætte med at sprede vaskulære netværk [17 ]. Ved siden af ​​deres begrænsede effekt i form af forbedring i patientens overlevelse, disse behandlingsmuligheder er ekstremt dyre og har vist uacceptable niveauer af toksicitet [18], [19]. Derfor vi rationaliseret behovet for at identificere ikke-giftige naturlige stoffer med bredspektret antiangiogen effekt; og i den forbindelse, i nærværende undersøgelse har vi fokuseret på den antiangiogene effekt af fire rene diastereoisomerer fra Milk Thistle (

Silybum marianum

) ekstrakt, nemlig silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B. Disse diastereoisomerer er flavonolignans med en identisk flavonoid-del og adskiller sig kun i deres konfigurationer om lignan-delen, og deres kemiske og biologiske egenskaber er blevet beskrevet tidligere [20], [21], [22], [23], [24]. Her for første gang, vi analyserede angiopreventive effekten af ​​disse flavonolignans i PCA xenograftmodel og forskellige

ex vivo

,

in vivo

in vitro

angiogenese analyser.

(A-B) lunger, lever og nyrer fra hver mus blev opsamlet og analyseret for CD31 immunoreaktivitet såvel som for histopatologiske analyser. Kvantitative analyser blev udført ved hjælp af Zeiss Axioscope 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og fotografierne blev oprindeligt fanget (ved 400x) med et Carl Zeiss AxioCam MRC5 kamera med Axiovision Rel 4.5 software. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, Iso B: isosilybin B.

(A) Flavonolignans hæmme angiogenese

ex vivo

. Mus aorta blev udpladet på Matrigel og behandles med flavonolignans. Pilene i billedet markerer de nye skibe fra aorta. (B) Flavonolignans inhiberer VEGF-induceret rør-dannelse i HUVEC. HUVEC blev udpladet på matrigel og virkning af diastereoisomerer behandling på VEGF-induceret rør-dannelse blev analyseret. Repræsentative rørformet net mikrofotografier er vist ved 100x (øverste felt). Tube længde blev kvantificeret som beskrevet i “Methods” (nederste panel). Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001.

(A) HUVEC induceret med VEGF og behandlet med hver flavonolignan i 0,5% serum medie, og det samlede celleantal blev analyseret efter 24 timer. (B) HUVEC blev udpladet i det øvre kammer med DMSO eller individuel diastereoisomer, mens VEGF blev tilsat i det nedre kammer og HUVEC invasion blev undersøgt. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

(A-B) HUVEC blev behandlet med DMSO eller individuel flavonolignan og analyseret for total celleantal og cellecyklusfordeling. (C) HUVEC blev behandlet med flavonolignans, og 24 timer senere blev totale cellelysater fremstillet og analyseret for cellecyklus regulatorer. De densitometridata værdier præsenteres nedenfor bands er “fold ændring” i forhold til kontrol efter lastning kontrol (α-tubulin) normalisering. (D) HUVEC blev behandlet med flavonolignans (ved 30 pM dosis) i 36 timer og analyseret for morfologi (repræsentative mikrofotografier er vist ved 100x), niveauer af cPARP, spaltet caspase 3 og 9, og procentvise apoptotiske celler. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01; $, P ≤ 0,05.

HUVEC var serum sultet i 22 timer, behandlet med diastereoisomerer i 2 timer og stimuleret med VEGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Totale cellelysater blev fremstillet og analyseret for nævnte signaleringsmolekyler. De densitometridata værdier præsenteres nedenfor bands er ‘fold ændring “i forhold til kontrol efter lastning kontrol (β-actin) normalisering.

(A) Effekt af flavonolignans (ved 90 uM dosis) på den tredimensionelle væksten af ​​DU145 celler blev undersøgt som beskrevet i ‘Materialer og metoder “. Repræsentative sfæroider mikrofotografier er vist ved 100x og 400x. (B) I Transwell invasion assay, enten DU145 celler (udpladet i det nedre kammer) eller HUVEC (udpladet i det øverste kammer) blev behandlet med individuelle diastereoisomerer (ved 30 pM dosis), og HUVEC invasionsevne blev målt. (C) DU145-celler blev behandlet med individuelle diastereoisomerer (ved 30 pM dosis) og konditioneret medium blev opsamlet. HUVEC blev udpladet på matrigel sammen med 0,5% FBS eller konditionerede medier fra forskellige behandlingsgrupper; og dannelse rør blev analyseret. Repræsentative mikrofotografier af rørformet net er vist ved 100x. Forkortelser: Sil A: silybin A; Sil B: silybin B; Iso A: isosilybin A, iso B: isosilybin B; CM: Konditionerede medier; *, P ≤ 0,001; #, P ≤ 0,01.

silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B target angiogenese i prostatatumorer ved at målrette signalmolekyler i PCA celler såvel som i endotelceller, den vigtige komponent af PCA mikromiljø.

Metoder

Cell line og reagenser

Menneskelig PCA DU145 celler fra ATCC (Manassas, VA) og dyrket som tidligere beskrevet [25]. HUVEC var fra Lonza (Walkersville, MD) og blev dyrket i EBM2 medier med EGM-2 SingleQots kosttilskud. Matrigel og invasion kammer var fra BD Biosciences (New Bedford, MA). TUNEL assaykit var fra Promega (Madison, WI). Carboxymethylcellulose (CMC), Harris hematoxylin og β-actin-antistof var fra Sigma (St. Louis, MO). DAB kit var fra Vector Laboratories (Burlingame, CA). Streptavidin og PCNA-antistof var fra Dako (Carpinteria, CA). Antistoffer til CD31, VEGF og nestin var fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoffer til VEGFR1, VEGFR2, og HIF-1α [anvendes til immunhistokemi (IHC) analyse] samt antistoffer for Cdk2, Cdk4, Cdc2, cyclin D1, cyclin D3, cyclin B1, p21, p27, Skp 2, Cdc25A og Cdc25C og normalt gedeserum var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). p27 antistof var fra NeoMarkers (Fremont, CA) og p21 antistof var fra Upstate (Charlottesville, VA). Antistoffer, der genkender de phosphorylerede og /eller totale proteinniveauer af VEGFR1, VEGFR2, Src, ERK1 /2, Akt, Bad, mTOR, p70S6K, kløvet caspase 3, spaltet caspase 9, og gede-anti-kanin HRP-konjugeret sekundære antistoffer var fra Cell signalering (Beverly, MA). ECL detection system og anti-muse HRP-konjugeret sekundært antistof var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). VEGF var fra R D (Minneapolis, MN). Silybin A, silybin B, isosilybin A og isosilybin B blev isoleret (renhed 97%) fra pulveriseret ekstrakt af frugterne af

Silybum marianum

(L.) Gaertn. [Opnået fra Euromed, S.A. (Barcelona, ​​Spanien)]. De hybride kromatografiske /precipitative teknikker og procedurer for gram skala oprensning af disse flavonolignans er allerede rapporteret tidligere [26].

In Vivo

tumor xenograft Study

athymiske (

nu /nu

) mandlige nøgne mus var fra NCI (Frederick, MD). Protokollen behandling blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Colorado Denver. Ca. 3 × 10

6 DU145 celler blev suspenderet i 50 pi serumfrit medium, blandet med 50 pi matrigel og injiceret s.c. i den højre flanke af hver mus. Dagen efter xenotransplantat implantation blev musene tilfældigt inddelt i ni grupper, og alle behandlinger blev udført ved oral sondeernæring som: gruppe I-mus (vehikelkontrolgruppe) med 200 pi 0,5% CMC (vægt /volumen) i sterilt vand; Gruppe II og III mus med 50 og 100 mg /kg legemsvægt dosis af silybin A; Grupper IV og V mus med 50 og 100 mg /kg legemsvægt dosis af silybin B; Gruppe VI og VII mus med 50 og 100 mg /kg legemsvægt dosis af isosilybin A; og grupper VIII og IX mus med 50 og 100 mg /kg legemsvægt dosis af isosilybin B, hhv. Alle disse behandlinger (5 dage /uge) blev givet i 200 pi 0,5% CMC. Som alle fire forbindelser har samme molekylvægt (482,1), hver dosis-niveau var ækvimolær tværs af disse midler. Når tumor xenograft vækst påbegyndt, blev tumorstørrelser målt to gange ugentligt ved hjælp af digital skydelære og tumorvolumen blev beregnet ved formlen: 0,5236 L

1 (L

2)

2, hvor L

1 er lang diameter, og L

2 er kort diameter.

IHC Analyser

Tumor prøver blev behandlet og immuno-farvet efter offentliggjorte metoder [27], [28], [29]. Procentdel af PCNA, TUNEL, blev spaltet caspase 3 og HIF-1α positive celler beregnet ved at tælle antallet af positive farvede celler (brun farvet) og det samlede antal celler på fem vilkårligt udvalgte felter fra hver tumor ved 400x forstørrelse. Mikrokar farvet med CD31 og nestin blev kvantificeret i 5 tilfældige mikroskopiske (400x forstørrelse) felter pr tumor. VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Pakt

Ser473, og Akt immunreaktivitet blev analyseret i 5 tilfældige områder for hver tumor væv og blev scoret som 0+ (ingen farvning), 1+ (svag farvning), 2+ (moderat farvning), 3+ (stærk farvning), 4+ (meget stærk farvning).

Ex Vivo

Kapillær Formation Assay

Aortas isoleret fra mus blev renset, skåret i små stykker og placeret på Matrigel-dækket brønde og dækket med en anden 100 pi matrigel. Efter disse aorta blev dyrket i 24 timer blev mediet (komplet HUVEC medier) erstattes med eller uden flavonolignans (30 og 60 uM). Behandlinger blev udskiftet efter 48 timer. Efter 6 dage med total inkubation blev fartøjer spiring fra aorta fotograferet ved hjælp af Cannon Power Shot A640 kamera på Zeiss inverteret mikroskop.

Tube Dannelse Assay

HUVEC (4 × 10

4) blev dyrket i 1 ml EBM2 (suppleret med 0,5% FBS og 4 ng /ml VEGF) med forskellige diastereoisomerer (5-30 uM) på Matrigel coatede plader. Efter 9 timers inkubation blev rørformede struktur dannelse kvantificeres ved at beregne rørets længde (ved 100x) med Zeiss inverteret mikroskop under anvendelse Cannon Power Shot A640 kamera og AxioVision Rel.4.7 software. I et beslægtet eksperiment blev DU145-celler behandlet med 30 pM dosis af hver flavonolignan i 72 timer, og frisk medium (0,5% FBS) tilsattes, og opsamlet efter 12 timer (materiale, konditionerede medier). De konditionerede medier blandet med 0,5% FBS suppleret EBM2 medier (75:25 forhold) blev derefter tilsat til HUVEC og dannelse rør blev undersøgt som beskrevet ovenfor.

Cell Levedygtighed Assay

HUVEC blev behandlet med eller uden VEGF (10 ng /ml) og forskellige koncentrationer af flavonolignans (5-30 uM). Efter den ønskede behandling blev totalt celleantal bestemt ved anvendelse af et hæmocytometer.

Transwell Invasion Assay

I dette assay blev de nederste kamre i Transwell fyldt med EBM2 medier indeholdende 0,5% FBS suppleret med 4 ng /ml VEGF, og i de øverste kamre HUVEC (4 × 10

4) blev podet i 500 pi EBM2 (0,5% FBS) plus 30 pM dosis af hver flavonolignan. Efter 10 timer blev invasive celler kvantificeret som tidligere beskrevet [30], [31]. Lignende assay blev også udført med DU145 celler udpladet i bundkammeret (RPMI-medium med 0,5% serum) og HUVEC (EBM2 medier med 0,5% serum) i det øvre kammer. I to separate eksperimenter blev flavonolignans tilsættes enten i de øvre kamre eller i de nedre kamre og invasionsevne af HUVEC blev undersøgt i hvert enkelt tilfælde.

Cell Cycle Distribution og Apoptose

Cell cyklus distribution (saponin /PI-farvning) og apoptose (Annexin-PI-farvning) blev analyseret ved FACS [32], [33].

immunblotting

HUVEC blev behandlet med 30 pM dosis af hver flavonolignan med eller uden VEGF stimulering blev lysater fremstillet og analyseret ved standard immunoblotting som beskrevet tidligere [33], [34]. α-tubulin og β-actin blev anvendt for at bekræfte ens protein loading.

Tre Dimensional Sfæroide Formation Assay

I plader med 24 brønde blev 100 pi matrigel tilsat. Derefter 100 pi RPMI-1640 og matrigel blanding (50:50) indeholdende ~ 1 x 10

3 DU145 celler blev tilsat. Efter 15 min, 1 ml RPMI-1640-medium med 10% FBS indeholdende DMSO-vehikel eller 90 uM koncentration af hver flavonolignan blev tilsat i brønden; behandlinger blev erstattet hver 48. time i 2 uger. Ved slutningen af ​​forsøget, blev kugleformet dannelse talt under Zeiss inverteret mikroskop ved 100x.

Statistiske Analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Sigma Stat softwareversion 2,03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA ). Den statistiske signifikans af forskelle mellem kontrol og behandlede-grupper blev bestemt ved Students t-test og p 0,05 værdi blev betragtet som signifikant. Envejs-ANOVA efterfulgt af Tukey test blev anvendt til multiple sammenligninger. Autoradiogrammerne /bands blev scannet, og betyde tæthed af bånd (hvor nævnt) blev bestemt ved hjælp af Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems, San Jose, CA).

Resultater

Effekt af Flavonolignans på PCA DU145 xenotransplantat vækst

med hensyn til anti-tumor effekt, den orale indgivelse af flavonolignans hæmmede effektivt væksten af ​​DU145 xenografter i nøgne mus, og dette var synlig fra den tredje uge og fremefter (fig. 1A). Ved slutningen af ​​forsøget (10 wks), silybin En behandling inhiberede tumorvolumen med 44 og 50% med 50 og 100 mg /kg legemsvægt doser (p 0,05) (. Figur 1A); mens silybin B inhiberede tumorvolumen med 38 og 47% ved samme doser (p 0,05) (figur 1A.). I isosilybin A behandlede mus blev tumorvolumen inhiberet af 44 og 50% (p 0,05) (. Figur 1A), mens i mus behandlet med isosilybin B tumorvolumenet blev inhiberet af 46 og 67% med 50 og 100 mg /kg kropsvægt doser (p 0,05) (fig 1A.). Samlet set isosilybin B var mest effektive til inhibering af DU145 xenograft vækst, efterfulgt af silybin A eller isosilybin A og silybin B. Selv disse forskelle i den biologiske virkning af hver diastereoisomer ikke opnåede statistisk signifikans; disse resultater var i overensstemmelse med tidligere rapporteret

in vitro

undersøgelser [21], [22].

På tidspunktet for obduktion, blev alle dyr undersøgt for grov patologi, og vi ikke observere nogen tegn på abnormitet i alle de vitale organer undersøgt. Desuden har administrationen af ​​disse forbindelser gennem oral sondeernæring ikke forårsage en væsentlig ændring i kosten forbrugsmønstret eller kropsvægt gevinst på mus (data ikke vist). Også, vi ikke observere nogen negativ effekt i form af generelle opførsel af dyr, hvilket tyder på en samlet sikker karakter af disse forbindelser.

Effekt af Flavonolignans om spredning og apoptose i DU145 Xenografter

IHC analyse af DU145 tumorprøver viste, at flavonolignans behandling signifikant inhiberer immunfarvning for PCNA (en biomarkør for celleproliferation) (fig. 1B), men øger TUNEL og spaltede-caspase 3 positive celler (biomarkører for apoptose) (fig. 1C og 1D ). Selvom statistisk signifikant, effekten af ​​flavonolignans på proliferation og apoptose relateret biomarkør var beskeden, og kunne ikke helt forklare den observerede langsommere xenograft vækst og tæt på 50% vækstinhibering med flavonolignan behandling (fig. 1A). Derfor næste vi analyserede tumorvæv for flavonolignans effekt på angiogenese, hvilket er absolut nødvendigt for tumorer at vokse ud over 1-2 mm størrelse [3].

Effekt af Flavonolignans på angiogenese i DU145 Xenografter

for at undersøge, om disse individuelle flavonolignans hæmmede xenograft vækst ved at undertrykke tumor angiogenese, farves vi tumor sektion med CD31 (en biomarkør for modnet mikrokar) og nestin (en biomarkør for umodne og nydannede mikrokar). Alle fire forbindelser inhiberede mikrokar tæthed, både modne og nydannede, men isosilybin B var relativt mere effektiv i sin inhiberende virkning på nestin-positive mikrokar (fig. 2). VEGF er en potent pro-angiogen faktor [17], [35], og IHC analyser af tumorsektioner klart viste, at behandling med disse diastereoisomerer nedsætter både VEGF og VEGFR2 ekspression i tumorvæv (fig. 2). Især undtagen silybin A, VEGFR1 ekspression blev også signifikant reduceret med disse midler (fig. 3). Samlet set isosilybin B var relativt mere potent i sin virkning på VEGF, VEGFR2 og VEGFR1 ekspression. HIF-1α er master transkriptionel faktor, er stabiliseret under hypoxiske betingelser i voksende tumorer og kontrol tumor metabolisme samt ekspression af pro-angiogene faktorer, såsom VEGF [36], [37], [38]. Selvom HIF-1α stabilisering forekommer under lavt iltindhold, er dets ekspression styres også af serin /threonin-kinase Akt [39]. Akt spiller også en vigtig rolle i flere cellulære processer, såsom celleoverlevelse, apoptose, migration og metabolisme [40], [41]. IHC analyser af tumorer viste, at alle fire flavonolignans falde kraftigt HIF-1α og Pakt

Ser473 niveauer, med marginal effekt på den samlede Akt udtryk kun ved isosilybin A og isosilybin B (fig. 3).

effekt af flavonolignans på angiogenese i ikke-målorganer

for at bekræfte, at de anti-angiogene virkninger af disse flavonolignans er specifikke for tumorvæv, vi analyserede ikke-målorganer (lever, lunge, og nyre) til CD31 ekspression at bestemme mikrokar tæthed. Der var ingen forskel i mikrokar tæthed i lever, lunge og nyre mellem kontrol og mus fodret med rene flavonolignans (Fig. 4A, CD31 kvantificering data ikke vist). H & E-analyser viste også, at disse diastereoisomerer har nogen negativ indvirkning på histologi af normale organer (fig. 4B).

Effekt af Flavonolignans på angiogenese i

Ex Vivo

In vitro

Analyser

Vi undersøgt yderligere den antiangiogene aktivitet af flavonolignans i

ex vivo

kapillær dannelse under anvendelse mus dorsale aorta. Efter seks dages dyrkning på matrigel under angiogene betingelser, observerede vi en signifikant antal fartøjer spiring fra musen aorta (markeret med pile), som blev inhiberet på en dosis-afhængig måde ved flavonolignans behandling (fig. 5A).

en af ​​de vigtige skridt i løbet neo-angiogenese er dannelsen og sammenlægning af rør produceret af endotelceller danner et komplekst netværk af skibe og kapillærer [42], [43]. For at forstå virkningen af ​​flavonolignans på denne biologiske begivenhed, udførte vi kanaldannelse assay. Som vist i fig. 5B, bundpanel, alle fire forbindelser inhiberede signifikant VEGF-induceret rørlængde i HUVEC. Som vist i billederne (fig. 5B, øvre panel), VEGF behandling inducerede dannelsen af ​​rørformede net ved HUVEC, der blev sprængt ved flavonolignan behandlinger.

Virkning af Flavonolignans på VEGF-induceret proliferation og kemotaktisk motilitet

VEGF spiller en vigtig rolle under neo-angiogenese gennem dens mitogene og motogenic virkning på endotelceller [17], [35]. I vores undersøgelser, VEGF behandling inducerede HUVEC vækst, der var kraftigt inhiberet af flavonolignans behandling (fig. 6A). Sådanne behandlinger hæmmede også den kemotaktiske motilitet af HUVEC i retning VEGF i Transwell invasion assay (fig. 6B). Vigtigere, isosilybin B var den mindst effektive i forhold til de andre diastereoisomerer i form af hæmmende virkning på kemotaktiske motilitet af HUVEC.

Effekt af Flavonolignans på Levedygtighed, cellecyklusprogression og apoptose i HUVEC

for yderligere at belyse den biologiske virkning af disse flavonolignans på endotelceller, analyserede vi levedygtighed, cellecyklus og apoptose i HUVEC. Som vist i fig. 7A, de fire flavonolignans (5-30 uM) inhiberede HUVEC levedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde. Cellecyklus analyser viste, at alle diastereoisomererne induceret G1 standsning efter 24 timers behandling, men kun silybin A, silybin B og isosilybin A også forårsaget G2 /M arrest (fig. 7B). Efter 48 timers behandling, den mærkbar effekt af silybin A, silybin B og isosilybin A i HUVEC var induktionen af ​​G2 /M arrest, som manglede med isosilybin B behandling (fig. 7B). Isosilybin En behandling (ved 30 uM) signifikant induceret af S-fasen efter 48 timers behandling, som kunne være knyttet til stærk apoptotisk død induceret af isosilybin A (fig. 7B).

Vi undersøgte dernæst virkningen af disse flavonolignans om forskellige cellecyklusregulerende molekyler, nemlig cycliner cDK’er og Cdk inhibitorer samt deres regulatorer Skp2 og fosfataser Cdc25. Som vist i fig. 7C, de fire flavonolignans faldt niveauerne af Cdk2 og Cdk4 med marginal effekt på Cdc2. Disse forbindelser også reducerede niveauer af cyclin D1, cyclin D3, cyclin A, og cyclin B1. Silybin A og isosilybin A moderat øget p27-ekspression, men det blev reduceret med isosilybin B (fig. 7C). Tværtimod blev p21-ekspression faldt med silybin A, silybin B og isosilybin A, men ikke af isosilybin B (fig. 7C). Men alle fire diastereoisomerer stærkt formindsket ekspression af Skp2 og Cdc25C med ingen eller moderat inhibitorisk virkning på Cdc25A plan (fig. 7C). Disse resultater tydede på, at disse fire diastereoisomerer har få lignende (men afviger i den grad) og få kontrasterende virkninger på ekspressionen af ​​cellecyklusregulerende molekyler.

Vi derefter undersøgte effekten af ​​de rene flavonolignans (ved 30 uM) på apoptose efter 36 timers behandling i HUVEC. Som vist i fig. 7D, isosilybin B var den mindst effektive med hensyn til at fremkalde apoptose relateret morfologiske træk (udstationering og afrunding), signalmolekyler involveret i apoptose (cPARP, kløvet caspase 3 og 9) og procentdelen af ​​apoptotisk celle population i HUVEC. Omvendt silybin A, silybin B og isosilybin Et stærkt induceret apoptotisk død i HUVEC (fig. 7D).

Effekt af Flavonolignans på VEGF-induceret signalering i HUVEC

Dernæst undersøgte vi flavonolignans effekt på VEGF-induceret signalering kaskade, der styrer proliferation, motilitet og rør-dannelse i endotelceller [35]. VEGF behandling kraftigt forøgede VEGFR2 fosforylering på Ser1175 site, en pålidelig markør for dets aktivitet, som blev hæmmet af forbehandling med flavonolignans (fig. 8). Tilsvarende VEGF øget phosphorylering af VEGFR1, Src, ERK1 /2, Akt, BAD, mTOR, og p70S6K. Som vist i fig. 8, bortset ERK1 /2 og mTOR, phosphorylering ved andre steder blev inhiberet af disse forbindelser end i forskelligt omfang. I forhold til dens andre diastereoisomerer, isosilybin B var den mindst effektive i forhold til effekt på VEGF-induceret signalmolekyler i HUVEC.

Differential følsomhed Flavonolignans Mod PCA og endotelceller

Tidligere resultater [ ,,,0],20], [21], [22], [24] og den nuværende undersøgelse foreslået, at der blandt de fire rene flavonolignans, isosilybin B er den mest effektive med hensyn til effektivitet mod PCA celler, men overraskende, det har den mindste effekt i form af dens virkning på HUVEC (hæmning af kemotaktisk motilitet eller apoptose induktion) (fig. 6 og 7). Derfor udførte vi en række eksperimenter for at belyse den relative effekt af disse fire diastereoisomerer mod PCA-celler vis-a-vis endotelceller. Først, vi analyserede deres effekt på den tredimensionelle vækst DU145 celler i matrigel. Behandling med disse forbindelser inhiberede kraftigt antallet og størrelsen af ​​sfæroide dannet ved DU145 celler med isosilybin B er mest effektive (Fig. 9A). Dernæst udførte vi co-kultur undersøgelser under anvendelse Transwell kamre. Vi belagte HUVEC i det øvre kammer, mens DU145-celler blev dyrket i det nedre kammer. I to separate eksperimenter blev HUVEC eller DU145 celler behandlet med rene flavonolignans, og derefter blev HUVEC invasion gennem matrigel undersøgt i hvert enkelt tilfælde. Som vist i fig. 9B, isosilybin B var den mest effektive i faldende HUVEC migration når DU145 celler blev behandlet, men var mindst effektiv, når HUVEC blev behandlet.

For at følge dette, vi behandlede DU145 celler med disse diastereoisomerer (30 um) og opsamles de konditionerede medier. Den pro-angiogene potentiale det konditionerede medium blev analyseret i en formation rør under anvendelse af HUVEC. Som vist i fig. 9C, konditionerede medier fra DU145-celler forøgede rørlængden samt rørformede netværk dannet af HUVEC.