PLoS ONE: Gene signaturer afledt af en c-MET-Driven leverkræft Mouse Model Forudsige overlevelse af patienter med hepatocellulært Carcinoma

Abstrakt

Biomarkører afledt af genekspression profilering af data kan have en høj falsk positiv rate og skal strengt valideret med uafhængige kliniske datasæt, som ikke altid er til rådighed. Selvom dyr modelsystemer kunne give alternative datasæt at formulere hypoteser og begrænser antallet af underskrifter, der skal testes i kliniske prøver, er den prædiktive effekt af en sådan tilgang endnu ikke bevist. Nærværende undersøgelse har til formål at analysere de molekylære underskrifter leverkræft i en c-MET-transgen musemodel og undersøge sin prognostisk relevans for human hepatocellulært carcinom (HCC). Vævsprøver blev opnået fra tumor (TU), der støder ikke-tumor (AN) og fjernt normal (DN) lever i Tet-operator reguleret (TRE) human c-MET transgene mus (n = 21) samt fra en kinesisk kohorte af 272 HBV og 9 HCV-associeret HCC patienter. Hele genomet microarray ekspression profilering blev gennemført i Affymetrix genekspressionssystemer chips, og prognostiske betydninger af genekspression signaturer blev evalueret på tværs af de to arter. Vore data viser paralleller mellem mus og humane lever tumorer, herunder nedregulering af metaboliske veje og opregulering af cellecyklus processer. De musetumorer var mest ligner en undergruppe af patientprøver karakteriseret ved aktivering af Wnt-vejen, men karakteristisk i p53 pathway signaler. Af potentielle kliniske anvendelighed, identificerede vi et sæt af gener, blev nedreguleret i både mus tumorer og menneskelige HCC har betydelig forudsigelseskraft på den samlede og sygdomsfri overlevelse, som var stærkt beriget for metaboliske funktioner. I konklusioner, denne undersøgelse giver belæg for, at en sygdom model kan tjene som en mulig platform til at generere hypoteser, der skal testes i humane væv og fremhæver en effektiv metode til at generere biomarkør underskrifter før omfattende kliniske forsøg er blevet indledt.

Henvisning : Ivanovska I, Zhang C, Liu AM, Wong KF, Lee NP, Lewis P, et al. (2011) Gene Underskrifter afledt af en c-MET-Driven leverkræft Mouse Model Forudsige overlevelse af patienter med hepatocellulært carcinom. PLoS ONE 6 (9): e24582. doi: 10,1371 /journal.pone.0024582

Redaktør: Wanjin Hong, Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore

Modtaget: May 9, 2011; Accepteret: 14. august 2011; Udgivet: 16 September, 2011

Copyright: © 2011 Ivanovska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. II, CZ, PL, OP, DB, CB, MS, mM, MAC, og HD engageret i dette arbejde som ansatte i Merck Co., Inc., en førende medicinalvirksomhed; bortset fra, at alle andre forfattere afslører ingen konkurrerende interesser. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige malignitet på verdensplan, med over 300.000 nye tilfælde om året i Kina og med en stigende forekomst i de vestlige lande [1]. Kirurgisk resektion eller levertransplantation er de primære behandlingsmuligheder for HCC patienter, der har en 5-års overlevelse på 50-60 [2]%. Desværre er omkring 80% af patienterne diagnosticeret i fremskredne stadier ved præsentation og er i det væsentlige ubrugelige og refraktære til de fleste af de konventionelle kemoterapi [3]. Som sådan er der et presserende behov for at identificere prognostiske markører af HCC [4], [5], [6], [7], [8], [9] og til at udvikle målrettede behandlinger gennem traditionelle lille molekyle hæmmere og /eller RNAi terapi [10], [11], [12], [13], [14].

Flere indviklede transgene musemodeller af human cancer er blevet foreslået til præcist at efterligne patofysiologi og molekylære funktioner i menneskelige maligniteter [15], men på tværs af arter gen-ekspression sammenligninger af dyremodeller og sygdom hos mennesker er ikke tilgængelige for validering [16]. HCC udvikler hos mennesker som progressiv sygdom fra en skrumpelever prædisposition forårsaget af hepatitis B eller C virus infektion, kronisk alkoholisme eller aflatoksin eksponering. Som følge heraf er human HCC tumorvæv omgivet af præmaligne cirrotisk væv [17]. En transgen musemodel for HCC er udviklet af Bishop og kolleger, hvor tumorer er induceret af lever-specifik, tetracyclin-reguleret (TRE) ekspression af et humant c-MET kinase transgen, en genetisk læsion ofte forbundet med humane levertumorer [18 ]. De tumorer, der opstår på grund af c-MET over-ekspression i muse ligne menneskelige HCC på niveauet for histologi [19]. Aktiverende mutationer i β-catenin, der fører til opregulering af Wnt signalvejen, en anden fælles træk ved human HCC, blev ofte observeret i disse tumorer. Alligevel oplysninger om tumorsuppressorgen TP53, som er almindeligt muteret i human HCC [20], og andre potentielle genmål i dette modelsystem er ikke tilgængelige. Endvidere er den molekylære karakter af den tilstødende ikke-malignt væv, der omgiver tumorerne ikke godt undersøgt og karakteriseret [21]. En bedre forståelse af, hvordan musemodel sammenligner med human sygdom på molekylært niveau er derfor afgørende for udformningen og fortolkningen af ​​effektivitetsundersøgelser for behandlinger.

Biomarkører afledt af microarray udtryk profilering data kan være underlagt høj FALSE- positiv sats på grund af multipel hypotese test uløseligt forbundet med at arbejde med et stort antal af gener og genprodukter kombinationer. En prædiktiv biomarkør signatur eller gen sæt bestemmes ud fra et givet sæt af prøver (træningssættet) skal valideres med data fra uafhængige prøver (prøve /validering sæt) [22], [23]. Møde dette mål kan være en udfordring som selvstændige datasæt, især dem fra kliniske prøver behandlet på en lignende måde, er sparsomme eller kræve betydelige tid investering at akkumulere. En work-around til denne begrænsning er at formulere og afprøve hypoteser ved hjælp af data fra en model-system.

I denne undersøgelse har vi udført molekylær profilering af normale leveren og i tumorvæv fra c-MET drevet musemodel, til forstå de molekylære ændringer i disse mus. Vi bestemt, hvor godt modellen tilnærmer human sygdom og bekræftede ekspression af specifikke cancertargets. Vi anvendte de data fra c-MET model til at generere signaturer adskiller tumor (TU) fra tilstødende ikke-tumor (AN) og vildtype (WT) normale væv, og testet den prognostiske effekt af disse underskrifter i et datasæt fra menneskelige HCC.

Metoder

Etik

Institutional Review Board fra University of Hong Kong /Hospital Myndighed Hongkong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) godkendte denne undersøgelse , og hver patient gav hans /hendes skriftligt informeret samtykke om anvendelsen af ​​de kliniske prøver til forskning. Alle undersøgelser med dyr var fuldt godkendt af Merck Boston Institutional Animal Care og brug Udvalg (protokol numre: # 07-08-044 og # 08-08-041) og blev udført i overensstemmelse med de institutionelle dyreetiske retningslinjer

c-met-muse HCC model

musene anvendt i denne undersøgelse er blevet beskrevet (tabel 1) [18], [24]. Alle mus var på en FVB genetiske baggrund. Mus overudtrykker human c-MET gennemføres én kopi af LAP-tTA-transgen (leveren-specifikke LAP promotor, der driver Tet-VP16 transaktivator) og én kopi af TRE-c-MET transgen (Tet-operator reguleret humant c-MET-gen ). Tilstedeværelsen af ​​begge transgener resulterer i ekspression af det humane c-MET-gen specifikt i og i hele leveren (omtalt herefter som TRE-c-MET-stamme). Syv mus af hver stamme blev aflivet på seks (TRE-c-MET), syv (LAP-tTA) eller 14 (TRE-c-MET) uger gamle. Normal lever eller lever tumorvæv (to pr mus) blev indsamlet og behandlet for genekspression profilering på Rosetta Gene Expression Laboratory. Desuden blev tilstødende levervæv opsamlet fra den ikke-involverede væv ved siden af ​​grænsen af ​​tumoren i tumorbærende leverlap. Distant levervæv var fra en ikke-tumorbærende lap eller fra områder med mindst 1 cm væk fra tumoren. Animal værker blev udført i AALAC-akkrediteret laboratorium i overensstemmelse med de institutionelle dyreetiske retningslinjer.

Patient kohorter og kliniske prøver

Alle patienter, der blev indskrevet i denne undersøgelse gennemgik en helbredende hepatektomi for HCC på Queen Mary Hospital, Pokfulam, Hongkong mellem 1993 og 2007 [3], [25]. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board for menneskelig etik og hver patient gav hans /hendes skriftligt informeret samtykke om brugen af ​​de kliniske prøver til forskning. Levervæv, der blev opnået fra patienter på tidspunktet for den kurative kirurgi blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Microarray og analyse

Totalt RNA blev ekstraheret og oprenset fra de kliniske liver prøver (n = 272 HBV-HCC tumor (TU), 257 HBV-HCC tumor-tilstødende normale (AN), 9 HCV-HCC tumor (TU).

9 HCV HCC tumor-tilstødende normale (AN)) under anvendelse af SV96 Total RNA Isolation System (Promega) i overensstemmelse med en tilpasset automatiseret protokol. Den ekstraherede RNA blev kvantificeret ved hjælp RiboGreen RNA Kvantificering Reagent (Invitrogen) og dens kvalitet blev vurderet ved hjælp af Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA) i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Kun de prøver passerer minimumsgrænser for mængden og kvaliteten (RIN 6), blev forstærket og mærket ved hjælp af Ovation WB-protokollen (NuGEN Technologies, San Carlos, CA), i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev 50 ng af total RNA amplificeret under anvendelse af Ribo-SPIA teknologi (NuGEN Technologies), fragmenteret og mærket med biotin under anvendelse af FL-Ovation cDNA Biotin Modul V2 (NuGEN Technologies). De resulterende amplificerede cRNA’er blev hybridiseret til Affymetrix genekspression chips (Humant Rosetta Tilpasset Affymetrix 1.0, Affymetrix, Santa Clara, CA) [26]. Billederne blev analyseret under anvendelse af standard pakke af Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS) (www.affymetrix.com/products/software/specific/gcos.affx) og var yderligere normaliseret og for at udlede det sekvens-baserede intensiteter ved hjælp af RMA-algoritmen som gennemført i Affymetrix Elværktøj (https://www.affymetrix.com/support/developer/powertools). Data anvendt til denne analyse passerede to niveauer af kvalitetskontrol (QC’er) (array-niveau ved hjælp af Affymetrix anbefalede parametre, og projektniveau om at udelukke afvigende arrays og arrays med store mønstre forbundet med kendte procesparametre). Log10 (ratio) af hvert gen i hver prøve blev beregnet ved at fratrække middelværdien af ​​log10 (Intensitet) af dette gen på tværs af alle tilstødende ikke-tumor prøver, for at gøre dem sammenlignelige med c-MET mus modeldata hvor referencerne er puljen af vildtype mus levervæv. Rå genekspression profilering data blev deponeret til GEO med følgende numre tiltrædelse: GSE25142 (afledt af c-Met musemodel) og GSE25097 (afledt af human HCC)

Tumor signatur fra mus profiler

Vi brugte envejs ANOVA til at definere tumor signatur i mus c-MET eksperiment, siger, for en sammenligning mellem WT Vs. tumor, vi identificeret 6277 mus probesets med ANOVA P-værdi 0,001. Den falske opdagelse sats (FDR) her anslås til 0,62% fra 1000 permutationer. Blandt disse signatur probesets, 3114 viste tumor ned- og 3163 tumor up-regler sammenlignet med WT. Musen tumor signatur blev derefter kortlagt menneskelige probesets i Affymetrix menneskelige chip. Vi identificerede også mus tumor signatur fra sammenligninger af tilstødende ikke-tumor vs. tumor og fjern ikke-tumor vs. tumor ved ANOVA-analyse.

Biologisk annotation og geneset berigelse test

Vi kompileret mange databaser omfatter gen sæt med kendte biologiske funktioner eller egenskaber fra en række offentlige (GO cellulære komponenter, molekylær funktion, biologiske processer, Kegg veje, SwissProt Keywoards, etc.), licenseret (GeneGo, opfindsomhed NextBio biosets, etc.), og proprietære kilder (intern forbindelse, siRNA, krop atlas profilering, etc.). Disse kommenterede gensæt blev anvendt i berigelse testen. De berigelse P-værdier (chancen sandsynligheden for at observere overlappende gener mellem input geneset og geneset i databasen) beregnes ved hjælp af den hypergeometriske fordeling [27].

Prognostisk magt underskrifter

for at estimere den prognostiske effekt af hver af muse signaturer, blev signaturen kortlagt til humant probesets og derefter behandlet som en metagene [28], [29]. Blev nemlig ekspressionsniveauet for metagene i humane HCC prøver beregnes ved at midle log (ratio) af alle generne kortlægges fra musen op- eller nedreguleret signaturer. De humane HCC prøver blev sorteret efter udtrykket niveau metagene og derefter delt i to lige store grupper af medianværdien (for at undgå over-fitting, har vi ikke optimere tærskel). De log-rank p-værdier mellem disse to grupper blev beregnet ved log-rank test med tid af den samlede overlevelse og sygdomsfri overlevelse hhv.

Resultater

Globale genekspression ændringer i mus og human HCC

til bestemmelse tumorspecifik genekspression i c-MET musemodel for HCC sammenlignede vi væv fra tumorbærende mus af flere kontrolsystemer væv, herunder tilstødende og fjernt normalt levervæv fra tumorbærende mus, vilde -typen levervæv og levervæv fra to enkelt transgen parentale linier (tabel S1). Vi brugte vildtype levervæv (virtuel pulje fra 7 mus) som en baseline og udførte ukontrollerede gruppering af differentielt udtrykte gener. Vi fandt, at tumorerne havde en særskilt ekspressionsmønster (figur 1A). For at karakterisere den molekylære karakter af de differentielt udtrykte gener, vi udførte Gene ontologi biologisk annotation [30] (se også supplerende oplysninger) på hvert gen sæt og fandt, at de ned-regulerede gener blev beriget for metaboliske processer, mens de up-regulerede gener blev beriget for cellecyklus og cytoskeleton-relaterede termer (tabel S2). Genekspression ændringer i human HCC viste lignende GO anmærkninger (tabel S3), hvilket indikerer, at på globalt genekspression niveau, c-MET musemodel tilnærmer human HCC.

(A) Global genekspression analyse afslørede tumor- specifik genekspression ændringer karakteriseret ved gener nedreguleret i tumorer, der blev beriget med metaboliske processer (hvid boks) og gener opreguleret i tumorer, der blev beriget med cellecyklus og aktincytoskelettet (gul). Ikke-tumorvæv støder op til eller fjernt fra tumorerne viste lignende ekspressionsmønstre er blevet afbrudt i varmen kort genereres af uovervåget klyngedannelse, med prøver fra samme dyr klyngedannelse sammen. De lodrette søjler til højre for hvert heat map repræsenterer farvekodning af prøverne, der svarer til den legende i hvert panel. (FVB-WT, lilla) Lever væv fra kontroldyr; (LAP-tTA, mørkeblå og TRE-c-MET, orange) levervæv fra enkelt transgene forældrenes stammer; (C-MET TU, grøn) tumorvæv fra dobbelt transgen, tumor bærende dyr; (C-MET AN, lyseblå) ikke-tumor levervæv fra dobbelt transgen, tumorbærende dyr støder op til tumor; (C-MET DN, rød) ikke-tumor levervæv fra dobbelt transgen tumorbærende dyr fjernt fra tumoren. Varmen kort repræsenterer uovervåget gruppering af differentielt udtrykte gener (fold ændring ≥1.25, s 0,01, Cluster Algoritme: agglomerative, Lighed Mål: cosinus korrelation). (B) flertallet af lever-beriget gener blev nedreguleret i c-met-tumorer, i overensstemmelse med tab af leverfunktion. Til denne analyse, valgte vi de 400 gener med den største fold-ændring fra leveren-berigede gener identificeret af Su og kolleger [18]. En lille delmængde af gener, der opreguleret (gule kasser) kan indeholde nyttige biomarkører for tumor tilstedeværelse. Color legende -0,5 log

10 (ratio) 0,5. (C) Sammenligning af muse-c-MET og menneskelige HCC tumor profiler. Menneskelig og mus tumorprøver co-grupperet indikerer lignende genekspressionsmønstre (rød boks). De differentielt udtrykte gener kan opdeles i tre grupper på grundlag af deres særlige regulering mønstre (gule kasser) og GO annotation. (HCC Adj) Humant hosliggende ikke-tumor; (HCC TU) human tumor; (C-MET TU) mus tumor; (C-MET Adj /DIS) mus tilstødende og fjernt normal. Varmen kort repræsenterer uovervåget gruppering af differentielt udtrykte gener (fold ændring ≥1.25, p 0,01, Cluster Algoritme: agglomerative, Lighed Mål: cosinus korrelation).

Vi udførte ukontrollerede klyngedannelse og fandt, at udtryk profiler af tilgrænsende og fjerntliggende normale vævsprøver blev afbrudt, adskilt af dyret, hvorfra de blev taget, og adskiller sig fra de tumor-profiler (figur 1A). Dette resultat indikerer, tumor nærhed ikke væsentligt ændrer genekspression i normalt levervæv. Imidlertid kan eksistere fine forskelle mellem hosliggende og fjerne prøver.

Selvom både HCV og HBV-infektion er blevet vist at forårsage HCC, HBV infektioner var fremherskende i denne kohorte (272 HBV-HCC tumorer og 9 HCV -HCC tumorer). At identificere potentielle molekylære forskelle mellem HCV og HBV-inficerede HCC analyserede vi alle tilgængelige HCV prøver i denne kohorte (ni) og sammenlignede dem med et lige antal tilfældigt udvalgte HBV prøver (ni). HBV prøver blev tilfældigt fordelt i en ikke-overvåget klynge af alle tumorprøver (data ikke vist), hvilket indikerer, at de ikke blev skæv mod en bestemt molekylær profil. Vi har ikke observere nogen konsekvent molekylær forskel blandt disse prøver (data ikke vist).

For at bestemme om paralleller mellem mennesker og mus HCC findes på genniveau, udførte vi direkte sammenligning af musen og menneskelige HCC profiler. Musen prøver blev normaliseret mod vildtype levervæv (virtuel pulje fra 7 mus), og de humane prøver blev normaliseret mod et gennemsnit af alle hosliggende ikke-tumorprøver. Unsupervised gruppering af de humane og muse prøver viste, at de molekylære profiler af de to tumor sæt blev nærmere beslægtet med hinanden end til deres beslægtede tilstødende ikke-tumorvæv (figur 1B, røde felt), afslører et tumorspecifikt molekylære signatur.

Blandt generne udtrykkes forskelligt i de fleste mus og humane tumorer, vi identificeret tre gen delmængder med særlige karakteristika (figur 1B, gule kasser). To grupper viste lignende ekspressionsmønstre i begge tumortyper: gener nedreguleret i begge tumortyper blev beriget for metaboliske processer, hvorimod gener opreguleret i begge tumortyper blev beriget for cellecyklus processer. Gener nedreguleret specifikt i humane tumorer blev beriget for immunrespons processer, hvilket afspejler en molekylær forskel, der kan pege på forskelle i tumor progression mekanismer. Sammenfattende sammenligning af de molekylære profiler af mennesker og mus HCC afslørede omfattende paralleller på genekspressionsniveauet. Imidlertid blev hvert sæt af tumorer også præget af specifik genekspression mønstre.

nedregulering af gener involveret i metaboliske processer i tumorerne tyder på, at leveren funktioner er formindsket eller forringet. At udforske lever identitet i disse tumorer yderligere undersøgte vi ekspressionen af ​​lever-beriget gener [31], [32], [33] og fandt, at de var nedreguleret i tumor prøver (figur 1C), konsistent med tab af liver identitet og funktion med tumor progression.

aktivitet af onkologi veje i HCC

for at få en bedre forståelse af aktiviteten af ​​signalveje relevante for onkologi i c-MET model af HCC, vi udføres målrettet analyse af udtrykket ændringer ved hjælp pathway signaturer tidligere definerede. Wnt /β-catenin signatur består af gener op- og ned-reguleres ved β-catenin siRNA’er i DLD-1 colon carcinomceller [34]. Vi fandt forhøjet Wnt pathway aktivitet (figur 2A), i overensstemmelse med de aktiverende mutationer af β-catenin ofte påvist i disse tumorer og aktivering af Wnt-vejen i en tredjedel af HCCs [35]. Unsupervised klyngedannelse af mus og humane prøver viste et forhold mellem en undergruppe af humane HCC-profiler og muse tumorprøver (figur 2B), hvilket indikerer, at c-MET mus kan være en nyttig model til undersøgelse af HCC patienter med aktiveret Wnt signalering. Interessant nok blev genom-dækkende profiler af muse tumorer og den delmængde af humane HCC med opreguleret Wnt pathway ekspression ikke korreleret (korrelation = 0,07). Dette er i modsætning til den signifikante korrelation observeret for den fokuserede Wnt signalvejen gensæt, hvilket indikerer, at lighederne er begrænset til bestemte veje.

(A) The Wnt /β-catenin pathway blev opreguleret i musetumorer målt ved Wnt /β-catenin-gen signatur [34]. Generne i hver signatur er angivet øverst i hver varme kort. Prøverne på Y-aksen og deres væv oprindelseslandet er angivet i den lodrette farvekodede bar til højre for hvert zonekort. Farvekodning forklaringen for panel A og C er mellem panelerne. Alle forkortelser er som i figur 1. (B) The Wnt /β-catenin pathway var opreguleret i en undergruppe af humane HCC-patienter som illustreret ved de tre humane prøver (HCC TU, lilla), der co-klynge med musen HCC prøver (c-MET TU, gul). Farve-kodning legende til paneler B og D er mellem panelerne. (C) Den TP53 vej var opreguleret i musetumorer (c-MET TU, grøn). (D) Up-regulering af TP53 vej var specifikke for musemodel (c-MET TU, gul) og blev ikke observeret i menneskelig HCC (HCC TU, lilla).

p53 pathway aktivitet i musen HCC modellen er af interesse som

TP53

mutationer er almindelige (i ~27% af tilfældene) i human HCC [20]. Vi anvendte en p53 pathway signatur [36] og observeres opregulering af p53 pathway i muse HCC tumorer, hvilket viser en forskel fra human HCC (figur 2C). I modsætning hertil humane HCC prøverne ikke viser p53 pathway opregulering (figur 2D), formentlig på grund af mutationer eller andre p53-inaktiverende mekanismer. Disse resultater viser, at selv om muse c-MET-modellen kan replikere en delmængde af humane HCCs i flere aspekter, har molekylære forskelle og bør tages i betragtning, når data fra denne model analyseres, især for mål i p53 pathway. Dette skyldes hovedsageligt status vildtypen af ​​p53-genet i musemodellen. Derfor bør særlig opmærksomhed og overvejelse betales, når man sammenligner på tværs af arter human sygdom model. Wnt signalvejen og p53 pathway er alle meget almindelige i udvikling af cancer. Genekspression underskrifter fra begge veje i muse tumor model og menneskelige HCC blev præsenteret i figur S2.

Mus-afledte gen signaturer har forudsigelseskraft for overlevelse af humane HCC patienter

Vi identificerede gen signaturer i musetumorer ved at sammenligne tumorens genekspression mønster til de tre ikke-tumorvæv angivet i tabel S1 (vildtype (WT), der støder op nontumor (AN) og fjernt normal (DN) lever). Vi anvendte det tilstødende vs. tumor signatur, fordi det er mest analog med sammenligningen af ​​de kliniske prøver i vores undersøgelse. Den fjerne vs tumor signatur indeholder yderligere oplysninger om eventuelle effekter, tumor nærhed kan udøve på tilstødende væv. Endelig, eftersom både den tilstødende og de fjerne væv udtrykker også c-met-transgen, vi medtaget vildtypen vs. tumor signatur for at identificere eventuelle c-MET-drevne genekspression ændringer.

For hvert par -kloge væv sammenligning identificerede vi sæt af gener, der var ned- eller opreguleres i tumoren og genererede varme kort ved hjælp af disse gener og muse c-MET tumor og FVB-WT vildtype prøver vist i figur 3A og figur S1 . Vi derefter projiceret disse underskrifter til de humane HCC data og bestemt deres overlevelse prognoser, og deres udtryk mønster. Hele kohorte af patienter blev anvendt i denne analyse og de humane prøver blev inddelt i to grupper baseret på den gennemsnitlige log (forholdet) af alle gener i signaturen som beskrevet i Materialer og Metoder.

(A) musetumor genekspression signaturer. Heat kort viser ekspressionen af ​​gener, der var differentielt udtrykte mellem tumorvæv og vildtype eller tilgrænsende normale væv i mus. (B) Den muse tumor underskrifter blev opdelt i opreguleret og nedreguleret sæt og Kaplan-Meier-kurver blev genereret for hvert gen sat til at teste forudsigelseskraft for den samlede patient overlevelse.

Interessant, fandt vi, at for alle sammenligninger, generne nedreguleret i tumorerne havde yderst prædiktive strøm til patient overlevelse (tabel 1) og sygdomsfri overlevelse (tabel S4). Som tidligere vist, blev disse gener beriget for metaboliske processer både hos mennesker og mus. I modsætning hertil opreguleret signatur, beriget med cellecyklus processer, havde ikke meget høj forudsigelseskraft for overlevelse (tabel 1) eller sygdomsfri overlevelse (tabel S4). Figur 3B og figur S1 viser Kaplan-Meier-kurver for disse data. Vi foreslår, at de op-regulerede cellecyklus processer mangler forudsigende magt, fordi de repræsenterer generelle tumor begivenheder, mens tab af metaboliske egenskaber betyder konkret tab af funktionelle egenskaber af leverceller, der kan være til skade for patienten overlevelse.

Til afgøre, om den prædiktive effekt af muse-afledte signaturer er specifik for c-MET model, analyserede vi den prædiktive effekt af en signatur afledt af uafhængige musemodeller [37] og fandt, at en betydelig del af generne havde forudsigelseskraft (figur S3). Disse resultater indikerer, at den prædiktive effekt af muse-afledte gener kommer fra tumor egenskaber af muse prøver og foreslår en generel anvendelighed af musetumormodeller til identifikation af gen signaturer til forudsigelse af resultatet i humane tumorer.

Næste analyserede vi ekspressionsmønsteret for musegenet signaturer i de humane prøver og fandt, at generne identificeret i musemodellen viste signifikante udtryk ændringer i humane tumorer (repræsentative varme kort i figur 4.) at bestemme om udtrykket ændringer var i den samme retning i mus og menneske, vi beregnet den gennemsnitlige ekspression for hvert gen i de humane tumorer sammenlignet med tilstødende ikke-tumor. Vi fandt, at hver af de seks mus signaturer indeholdt gener, hvis ekspression ændret sig i de humane tumorer begge i samme og i den modsatte retning. For eksempel blandt de gener nedreguleret i musetumorer vs. WT væv (Figur 4A-B), en delmængde blev også nedreguleret i humane tumorer (Figur 4a) en delmængde blev opreguleret i humane tumorer sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv (figur 4B). Ligeledes blandt de gener, der var opreguleret i musetumorer vs WT væv, en undergruppe af gener var nedreguleret i humane tumorer og en delmængde blev opreguleret (data ikke vist).

Gene signaturer genereret i muse væv blev projiceret op på menneskelige HKU HCC datasæt. Farveskalaen er som i figur 1 (-0,5 til 0,5). Mean ekspressionsniveauer plottes til højre for hvert heat kort at illustrere sammenhængen mellem ekspression og prognose. KM kurver er givet under hver zonekort.

For at forstå forskellen mellem de gener, der reguleres i samme eller i modsat retning i musen og humane tumorer, vi analyseret hver delmængde separat for deres magt at forudsige overlevelse (tabel 2), sygdomsfri overlevelse (tabel S5) og for berigelse for biologiske veje (tabel 2). Vi fandt, at generne nedreguleret i både murine og humane tumorer (Tabel S6) bevaret en højsignifikant forudsigelseskraft for overlevelse og berigelse for metaboliske processer. I modsætning hertil den delmængde af gener, der blev nedreguleret i musetumorer men opreguleret i humane tumorer ikke har prognoser, og signifikant berigelse for eventuelle biologiske processer. Blandt generne opreguleret i musetumorer, var dem, der blev nedreguleret i humane tumorer ikke har nogen forudsigelseskraft for overlevelse eller signifikant biologisk annotation (signifikant berigelse af biologiske veje, som målt ved hypergeometric P-værdi). Interessant, mens det samlede sæt af gener opreguleret i musetumorer ikke havde en forudsigelig effekt (se ovenfor, tabel 1 og tabel S4), den delmængde af gener, der var opreguleret i både mus og humane tumorer viste marginalt signifikant forudsigelseskraft (tabel 2, tabel S7). Dette resultat indikerer, at frafiltrere de discordantly regulerede gener gennem et modelsystem og kliniske prøver og fastholde kun dem, der er ligeledes reguleret i begge kan afsløre sæt med forudsigelseskraft, der ikke kan opdages, når enten de globale underskrifter fra begge systemer betragtes separat.

Da musen HCCs blev fremkaldt af c-MET, vi gentog ovennævnte analyse i menneskelig HCC ved at fokusere på de patienter med høj c-MET (patienter med HCC c-MET-ekspression median udtryk af befolkningen) at fastlægge de signaturer i samme eller modsat retning mellem mus og menneske. Svarende til fig 4 A B, vi identificeret 775 gener både nedreguleret i muse og human c-MET-høj HCC og 612 gener i den modsatte retning. Blandt disse, 749 overlappede med 800 samme retning gener ved hjælp af alle HCC prøver (96,7% overlap, hypergeometric P-værdien 0) og 562 overlappede med 587 modsatte retning gener ved hjælp af alle HCC prøver (95,7% overlap, hypergeometric P-værdien 0). Analoger til figur 4 og tabel 2, vi tjekkede også den prognostiske effekt af disse to underskrifter, de log-rank p-værdier for samlet overlevelse er 2,2 × 10-6 og 0,78 henholdsvis meget lignende forudsigende magt som det tilfælde, hvor det hele HCC patienter blev anvendt til at kortlægge de overlappende signaturer (tabel 2). Gene ontologi disse overlappende gener blev udført for at afsløre de biologiske veje, der er forbundet med forskellige gen-sæt, når man sammenligner de mus c-MET drevne levertumorer og humane c-MET-høj HCC (tabel S8).

Diskussion

den foreliggende undersøgelse viser, at musen c-MET tumor model har ligheder med den menneskelige HCC på det molekylære niveau, herunder nedregulering af metaboliske processer og opregulering af cellecyklus gener. Tumorspecifikke genprodukter signaturer afledt i musemodellen kan skelne tumor fra ikke-tumorvæv i human HCC. Generne nedreguleret i tumor sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv i både mus og humane prøver havde en betydelig forudsigelseskraft på samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse i HCC patienter.