PLoS ONE: Vækst hæmmende virkning af polyumættede fedtsyrer (PUFA) om Colon Cancer Cells via deres væksthæmmende metabolitter og Fedtsyresammensætning Ændrer

Abstrakt

Baggrund

Tyktarmskræft er fælles. Polyumættede fedtsyrer (PUFA) udøver vækstinhiberende og pro-apoptotiske virkninger på colon cancerceller. Metabolitter af PUFA’er såsom prostaglandiner (PG), leukotriener (LTS) og lipoxiner (LXS) spiller en væsentlig rolle i tyktarmskræft.

Metoder

Menneskelig tyktarmskræft LoVo og RKO celler dyrket med forskellige koncentrationer af PUFA og 5-fluorouracil (5-FU)

in vitro

. Cell morfologiske ændringer, fedtsyresammensætning, dannelse af PGE2, LTB4 og LXA4 og ekspression af COX-2, ALOX5, PGD syntase (PGDS), blev mikrosomalt prostaglandin E syntase (mPGES) vurderede i LoVo og RKO-celler, når de suppleres med PUFA’er og 5 -FU.

Resultater

flerumættede fedtsyrer og 5-FU hæmmede væksten af ​​LoVo og RKO celler i samme omfang ved de anvendte doser og produceret signifikante ændringer i deres form. Som forventet blev højere koncentrationer af suppleret PUFA’ere noteret i cellerne i forhold til at styre. LA, GLA, AA, ALA og EPA tilskud til LoVo celler undertrykt produktion af PGE

2, LTB

4, og ALOX5, mPGES udtryk, men forbedret den af ​​LXA

4; mens DHA forbedret PGE

2 og LXA

4 syntese, men faldt LTB

4 dannelse og COX-2, ALOX5, mPGES udtryk. Derimod 5-FU forstærket skabelse af PGE

2, LTB

4 og mPGES ekspression, men undertrykte LXA

4 syntese og COX-2-ekspression. PGE

2, LTB

4 syntese og ALOX5 ekspression blev undertrykt af LA, GLA, ALA og DHA; mens AA, EPA og 5-FU forbedret PGE

2, men paradoksalt nok AA faldt og EPA og 5-FU forbedret LTB4 syntese i RKO celler. Alle PUFA’erne testede forstærket, mens 5-FU faldt LXA

4-dannelse i RKO-celler; mens GLA, AA, og 5-FU augmented mens LA, ALA, EPA og DHA forbedret COX-2-ekspression i RKO celler.

Konklusioner

tumoricidal virkning af PUFA på kolorektal LoVo og RKO kræft celler

in vitro

var forbundet med øget dannelse af LXA

4, nedsat syntese af PGE

2 og LTB

4 og undertrykt udtryk for COX-2, ALOX5, mPGES, mens 5- FU produceret kontrasterende handlinger på disse indeks

Henvisning:. Zhang C, Yu H, Ni X, Shen S, Das FN (2015) vækst hæmmende virkning af polyumættede fedtsyrer (PUFA) om Colon Cancer Cells via deres vækst hæmmende metabolitter og fedtsyresammensætningen ændringer. PLoS ONE 10 (4): e0123256. doi: 10,1371 /journal.pone.0123256

Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Juli 29, 2014 Accepteret: 21 februar 2015; Udgivet: 17 April, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. UND oppebærer Ramalingaswami fællesskab af Institut for Bioteknologi, New Delhi under uopsigelighed af denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Institut for Bioteknologi (DBT nr BT /PR11627 /MED /30/157/2010), Institut for Videnskab og Teknologi (nr IR /SO /LU /03/2008 /1) under Intensivering af forskning i højt prioriterede områder (IRPHA) til UND. Forfatter UND er præsident og CEO for UND Life Sciences uden nogen form for økonomisk kompensation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. UND er præsident og CEO for UND Life Sciences uden nogen form for økonomisk kompensation. UND Life Sciences forsker inden for essentielle fedtsyrer og deres metabolitter og deres rolle i forskellige fysiologiske og patologiske processer. UND Life Sciences har ingen produkter på markedet, der vedrører arbejde rapporteret i den foreliggende håndskrift. Andre forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De specifikke roller denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« sektion.

Introduktion

Tyktarmskræft er almindelig både hos mænd og kvinder, med den højeste forekomst i Australien og New Zealand, Europa og Nordamerika [1]. Vestlig kost er rig på mættet fedt og indeholder utilstrækkelige mængder af total polyumættede fedtsyrer (PUFA) med forholdet mellem n-3 og n-6 væsen ~ 1: 20, som anses for at fremme udviklingen af ​​colorektal cancer. Vi har tidligere og andre viste, at PUFA’er (LA, GLA, AA, ALA, EPA og DHA) har inhiberende virkning på væksten af ​​tumorceller med ringe eller ingen cytotoksisk virkning på normale celler [2-5].

LA (linolsyre = 9-cis, 12-cis-octadecadiensyre; 18: 2 n-6) og ALA (α-linolensyre = 9-cis, 12-cis, 15-cis-octadecatriensyre; 18: 3 n-3) er essentielle fedtsyrer (EFA’er), der udgør forstadier til deres respektive langkædede metabolitter nemlig γ-linolensyre (GLA; 18: 3 n-6), dihomo-γ-linolensyre (DGLA; 20: 3 n- 6) og arachidonsyre (AA, 20: 4 n-6) og eicosapentaensyre (EPA, 20% n-3) og docosahexaensyre (DHA, 22: 6 n-3) hhv. Det menes, at Δ

6 og Δ

5 desaturaser og respektive elongaser konvertere LA og ALA til deres respektive langkædede metabolitter [6]. Tumorceller vides at være mangelfuld i PUFA’er, især i AA, EPA og DHA på grund af nedsat aktivitet af enzymer Δ

6 og Δ

5 desaturaser [7]. Det kan bemærkes, at DGLA, AA og EPA danner forstadier til forskellige prostaglandiner (PG’er), thromboxaner (TXS) og leukotriener (LTS), hvorimod AA, EPA og DHA danner forstadier til lipoxiner (LXS) (fra AA), resolvins (blandt EPA og DHA) og protectins og maresins (fra DHA), som spiller en væsentlig rolle i inflammation og kræft [8]. Generelt PG’er, TXS, og LT’er er pro-inflammatorisk karakter, producere immunosuppression og fremme tumorcelleproliferation. LXS, resolvins, protectins og maresins har potente antiinflammatoriske virkninger [9, 10], men deres nøjagtige rolle i proliferationen af ​​tumorceller er ikke veldokumenterede, men nogle undersøgelser gjorde antyder, at LXS kan undertrykke deres vækst [6-8]. Selv om det menes, at en øget dannelse af forskellige PG’er, kunne LTs og TXS fra forskellige PUFA’er være ansvarlig for den cytotoksiske virkning af PUFA, er der ingen generel enighed om dette på grund af kontroversielle resultater rapporteret [6-8]. I modsætning til de cytotoksiske virkninger af PUFA’er på tumorceller, nogle af disse fedtsyrer, især GLA, PGE

1 og BGB

2 er blevet vist at besidde cytobeskyttende og genoprotective aktioner [11-13]. På den anden side, overekspression af cyclooxygenase-2 (COX-2), hvilket fører til dannelsen af ​​overskud af PGE

2, er blevet forbundet med proinflammatoriske hændelser og højere forekomst af kolorektal cancer [14-16]. Disse beviser indikerer, at COX-2 er et potentielt mål for anti-cancerbehandling. Dette understøttes af den iagttagelse, at n-3 PUFA’er: DHA og EPA i kombination med strålebehandling undertrykt væksten af ​​HT29 colon cancerceller, der blev forbundet med nedsat COX-2-ekspression [17]. Desuden er den mikrosomale PGE2 syntase (mPGES) funktionelt forbundet med COX-2, som medierer det definitive reguleringsindgreb trin med PGE

2 biosyntese og overeksprimeres i forskellige cancerformer [18, 19].

nærværende undersøgelse, vi evaluerede effekten af ​​forskellige PUFA’er (LA, GLA, AA af n-6-serien og ALA, EPA, DHA n-3-serien) på væksten af ​​tyktarmskræft LoVo og RKO celler

in vitro

og sammenlignet disse resultater med det kendte anticancerlægemiddel 5-fluorouracil (5-FU). Derudover undersøgte vi virkningen af ​​forskellige PUFA’er og 5-FU på ændringer i fedtsyresammensætningen, dannelsen af ​​PGE

2, LTB

4 og LXA

4 og ekspressionen af ​​COX-2, der har ikke tidligere blevet rapporteret.

Materialer og metoder

Materialer

de kolorektale cancer cellelinjer, LoVo (udifferentieret) og RKO (semi-differentieret) blev opnået fra Institut for Biokemi og Cellebiologi Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. ALA, EPA, DHA, LA, GLA, AA og 5-FU blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). RPMI1640 medium blev købt fra GIBCO (Grand Island, NY, USA).

Cellekultur

LoVo og RKO-celler blev dyrket i RPMI Medium1640 (GIBCO) suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 U /ml) og dyrket i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Stamopløsningerne af ALA, EPA, DHA, LA, GLA, og AA blev fremstillet som tidligere [20] beskrevne. Imidlertid blev 5-FU opløst i vand med høj renhed som stamopløsning med koncentrationen af ​​50 mM. Stamopløsningerne af fedtsyrer og 5-FU var filtersteriliseret og frisk fortyndet med celledyrkningsmedier, når de anvendes. I alle undersøgelser, doserne af fedtsyrer og 5-FU anvendes til LoVo var som følger: 5-FU 10 uM ALA 150 um /ml, DHA 150 um /ml, EPA 150 um /ml, LA 150 um /ml, AA 150 pM /ml og GLA 300 pM /ml og celledensiteten anvendte: 1 × 10

5 celler /ml; mens densiteten af ​​RKO var 5 × 10

4 celler /ml og dosis af 5-FU, ALA, DHA, EPA, LA, AA og GLA anvendes var 0.4μM, 140μM /ml, 120μM /ml, 120μM /ml, 120μM /ml, 120μM /ml, 200 uM /ml henholdsvis

MTT assay og cellemorfologi bestemmelse

MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl). – 2,5-diphenylte-trazolium bromid (Sigma, USA)) blev anvendt til at bestemme virkningen af ​​ALA, EPA, DHA, LA, GLA, AA og 5-FU på proliferationen af ​​LoVo og RKO-celler. MTT-assayet blev udført som tidligere beskrevet [21].

LoVo-celler blev podet i 24-brønds plader med et volumen på 1 ml med en densitet på 1 x 10

5 celler /ml, mens densiteten af RKO var 5 × 10

4 celler /ml. 24 timer efter podning blev cellerne suppleret med forskellige doser af forskellige fedtsyrer og 5-FU i 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev observeret celle morfologiske ændringer under anvendelse af et inverteret lysmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan).

Fedtsyre analyse af cellernes

LoVo og RKO-celler podet i 50 ml celle dyrkningskolber suppleret med forskellige PUFA’er og 5-FU i 48 timer blev derefter høstet under anvendelse af trypsin. Efterfølgende blev cellerne vasket to gange med PBS, resuspenderet i 0,5 ml vand med høj renhed. Fedtsyrerne blev esterificeret som anbefalet af Seppänen-Laakso T [22], og det cellulære indhold af fedtsyrer blev målt ved gaskromatografi som beskrevet i detaljer tidligere [20]. Toppene blev identificeret ved at sammenligne retentionstiderne med kendt methyl ester standarder (FAME Mix, Supelco) og fedtsyrerne blev kvantificeret ved en ekstern standard metode.

LTB

4, PGE

2 og LXA

4 måling

til bestemmelse af LTB

4, PGE

2, og LXA

4 niveauer i LoVo og RKO dyrkningsmedium, celler blev podet i en 6-brønds plade natten over og behandles med forudbestemte doser af PUFA’er og 5-FU i 48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev mediet høstet ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 minutter til fjernelse flydende celler. Efterfølgende blev supernatanten opsamlet og undersøgt under anvendelse af LTB

4, PGE

2, og LXA

4 ELISA kits ifølge producentens instruktioner (WESTANG Bio-tech, Shanghai, Kina). Resultaterne blev korrigeret af proteinniveauet før ekspression i procent af kontrollen.

Bestemmelse af COX-2 og ALOX5 aktivitet

LoVo og RKO-celler blev dyrket i 6-brønds plader og behandlet med forskellige PUFA’er og 5-FU i 48 timer, ved udgangen af ​​hvilken den kulturelle supernatant opsamlet ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 min blev anvendt til COX-2 og ALOX5 niveauer analyse ved kompetitiv enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) indkøbt fra Xitang (Shanghai, Kina) og CUSABIO (Wuhan, Kina), hhv. Resultaterne blev korrigeret af proteinniveauet inden de udtrykker de værdier som en procentdel af kontrol.

mRNA analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede LoVo og RKO-celler suppleret med forskellige PUFA’er og 5-FU for 48 timer med 500 pi TRIzol reagens (Haogene Biotech, Hangzhou, Kina). cDNA blev syntetiseret ved en revers transkriptionsreaktion med 1st-Strand cDNA Synthesis Kit (Haogene Biotech, Hangzhou, Kina) fra 500 ng totalt RNA ifølge producentens anvisninger. Real-time kvantitativ PCR (RT-PCR) blev udført under anvendelse Power SYBR Master Mix (Invitrogen). For hver reaktion, 12,5 ul of Power SYBR Master Mix, 0,5 pi af hver PCR-primer, 1 pi DNA-skabelon, 10.5μl destilleret vand blev tilsat. Human18S rRNA blev valgt som reference for genekspression analyse, og yderligere analyseret i henhold til 2

-ΔΔCT metode

Primere (Sangon Biotech), der anvendes var:. Humane 18s (F; GACTCAACACGGG-AAACCTCAC, R , CCAGACAAATCGCTCCACCAAC), human PGDS (F; CCTGCCCCAAACCGATAAGTG, R; GCTCGGGGAAGGAACAGAGCAG), Menneskelige mPGES (F; CCCCAGTATTGCAGGAGCGAC, R;. GCATCCAGGCGACA-AAAGGGTTAG)

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev gentaget mindst tre gange, og de opnåede data blev analyseret med SAS 8.0-software og SPSS softwareversion 16,0. Resultaterne er udtrykt som middel ± SD. Alle data blev analyseret ved hjælp af ANOVA proceduren med signifikans analyse på

s

0,05 niveau.

Resultater

PUFA’ere inducerede morfologiske ændringer i LoVo og RKO celler

De morfologiske ændringer i LoVo og RKO celler som reaktion på forskellige doser af PUFA og 5-FU behandling blev analyseret under lysmikroskopi, og resultaterne er vist i fig 1 og 2. resultaterne viste, at ubehandlede celler voksede godt med en normal form, som kunne findes ved deres ensartede fordeling med intensive forbindelser og konfluens. Men sammenlignet med kontrolgruppen, PUFA og 5-FU behandling af LoVo og RKO celler faldt deres antal, og celle form blev fordrejet med oprunding, hvilket antyder, at flerumættede fedtsyrer og 5-FU hæmmede udbredelsen af ​​disse celler.

Virkning af PUFA’er på sammensætning af fedtsyrer coloncancerceller

i den foreliggende undersøgelse, analyserede vi fedtsyreindhold LoVo og RKO-celler som respons på tilskud med forskellige PUFA’er og 5-FU i 48 timer og er vist i tabel 1 og figurerne 3 og 4. forholdet mellem umættede fedtsyrer /mættede fedtsyrer (S /U), og forholdet mellem n-6 PUFA’er /n-3 PUFA’er (n-6 /n-3) blev også beregnet. Disse resultater viste, at når de suppleres med PUFA’er, fedtsyreestere profiler af LoVo og RKO-celler var signifikant forskellige i forhold til kontrolgruppen. Som vist i tabel 1, er det bemærkelsesværdigt, at niveauer af suppleret fedtsyrer blev signifikant forøget i LoVo og RKO-celler. For eksempel LoVo celler suppleret med ALA, DHA, EPA, LA, AA, viste GLA en 54,9-fold, 12,32-fold, 16,6-fold, 13,95-fold, 3,17 gange og 39,88 gange højere koncentrationer sammenlignet med kontrollen . På den anden side, RKO celler behandlet med ALA, DHA, EPA, LA, AA, viste GLA et 14,09-fold, 54,81-fold, 225,95 gange, 31,71-fold, 44.46 gange og 18.41-fold stigning i koncentrationerne af disse fedtsyrer hhv. Det er bemærkelsesværdigt, at både i LoVo og RKO celler viste en betydelig stigning i EPA og DHA niveauer, når suppleret med EPA tyder på, at EPA omdannes til dets langkædede metabolit DHA. Desuden tilskud af AA forøgede indhold af AA og EPA i både LoVo og RKO-celler. Overraskende, LoVo celler suppleret med GLA resulterede i ikke kun en betydelig forøgelse af deres GLA-indhold, men også en stigning i ALA, EPA, DHA, LA og AA. I modsætning hertil RKO celler suppleret med GLA viste et fald i ALA, EPA, DHA og LA indhold i forhold til kontrol. Vejviser

Mens vurdere forholdet mellem umættede fedtsyrer /mættet fedtsyrer (U /S), blev det bemærket, at både LoVo og RKO celler viste et højere forhold mellem U /S i alle PUFA’er behandlinger sammenlignet med kontrollen, som er tydeligt for resultaterne vist i tabel 1 og figurerne 3 og 4. LoVo celler suppleret med n-6 ​​PUFA (LA, AA og GLA) resulterede i en 17,52, 10.09 og 29.68% stigninger for summen af ​​n-6 PUFA og 1.13, 0,1, 1,46% fald for summen af ​​n-3 PUFA i forhold til kontrol. Ligeledes tilskud af n-3 PUFA (ALA, DHA og EPA) til LoVo celler resulterede i en 34.52, 17.22, 16.83% stigninger i den samlede mængde af n-3 PUFA og 14.78, 14.73, 12.12% fald for summen af ​​n -6 PUFA i sammenligning med kontrol. RKO celler, som blev suppleret med LA, AA og GLA viste en 30,69, 53,33 og 35,84% stigning i koncentrationerne af n-6 PUFA’er i sammenligning med kontrolgruppen henholdsvis. På den anden side, RKO celler, som blev suppleret med ALA, DHA og EPA viste en stigning i niveauet af disse n-3 fedtsyrer ved 49,21, 35,83 og 15,18% i forhold til kontrollen.

Supplering af 5-FU til LoVo og RKO celler produceret langt få ændringer i sammensætningen af ​​n-6 PUFA’er og n-3 PUFA’er i sammenligning med kontrollen. På den anden side viste LoVo-celler en markant stigning i indholdet n-9 PUFA’er og nedsat indhold af mættede fedtsyrer. I modsætning hertil tilskud af 5FU frembragte en signifikant stigning i den mættede fedtsyreindhold og et signifikant fald i dens N-9-PUFA’er i RKO-celler.

Virkninger af PUFA’er på PGE

2, LTB

4 og LXA

4 niveau

PGE

2 og LTB

4 har vist sig at besidde pro-inflammatoriske virkninger, fremme tumorcelleinvasion, forbedre deres metastaser, opregulere VEGF-ekspression, inhiberer tumorcelle apoptose og undertrykke immunforsvaret [13, 23]. Således kan både PGE

2 og LTB

4 kan virke som anti-apoptotiske molekyler og forbedre tumorvækst. I modsætning hertil lipoxin A

4 er en potent anti-inflammatorisk molekyle og modsætter handlinger PGE

2 og således kunne undertrykke tumorcelleproliferation, invasionsevne og metastase [13]. I lyset af dette, vi bestemt udskillelsen af ​​PGE

2, LTB

4 og LXA

4 af LoVo og RKO celler efter tilskud med forskellige flerumættede fedtsyrer og 5-FU i 48 timer.

som det fremgår af disse resultater vist i figur 5, når PGE

2 sekretion med LoVo-celler suppleret med LA, GLA, AA, ALA, EPA og 5-FU blev undertrykt, mens DHA forbedret dets sekretion sammenlignet med kontrollen. På den anden side, LA, GLA, AA, ALA, EPA og DHA (alle testede PUFA’er) faldt LTB

4-sekretion i væsentlig grad af LoVo celler, mens 5-FU forstærkede den samme. Resultater, der er vist i figur 6 viste, at RKO celler suppleret med LA, GLA, DHA og ALA produceret faldt mængder af PGE

2, mens AA, EPA og 5-FU inducerede en betydelig stigning i produktionen. I modsætning hertil viste RKO celler nedsat produktion af LTB

4, når suppleret med LA, GLA, AA, ALA og DHA og viste øget produktion som reaktion på EPA og 5-FU udfordring.

Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05).

Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05).

til sammenligning disse resultater alle testede PUFA’er øget produktion af LXA

4 af LoVo og RKO celler, mens 5-FU behandling inhiberede LXA sekretion

4 i begge disse celler som vist i fig 6 og 7.

Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05).

Virkninger af PUFA på ekspressionen af ​​COX-2 og ALOX5

COX-2 spiller en vigtig rolle i både inflammation og colon carcinogenese og dermed er det blevet foreslået, at midler, der undertrykker dets ekspression kan være nyttige til inhibering af disse to processer [24]. På den anden side, voksende dokumentation indikerer, at arachidonat 5-lipoxygenase (ALOX5) er en afgørende regulator af inflammation og cancer patogenese [25]. I den foreliggende undersøgelse måles vi ekspressionen af ​​COX-2 efter tilskud af PUFA’er og 5-FU, som viste, at i almindelighed PUFA’er (bortset AA på LoVo og GLA og AA på RKO-celler) nedregulerede ekspressionen af COX-2 sammenlignet med kontrol som det fremgår af resultaterne vist i fig 6 og 7, mens PUFA’er (undtagen EPA på RKO-celler) nedregulerede ekspressionen af ​​ALOX5 sammenlignet med kontrol, som fremgår af resultaterne vist i fig 7 og 8 . på den anden side, 5-FU inhiberede ekspressionen af ​​COX-2 og ALOX5 i LoVo celler, men forstærket i RKO-celler Salg

Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05)..

Virkninger af PUFA på ekspressionen af ​​PGDS og mPGES

mikrosomale prostaglandin E syntase (mPGES) og PGD syntase (PGDS) mægle det definitive reguleringsindgreb trin i PGE

2 og prostaglandin D

2 biosyntese henholdsvis og har været impliceret i tumor patogenese [26, 27]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af ​​PGE syntase og PGD syntase ved hjælp af real-time PCR efter tilskud af PUFA’er og 5-FU. Resultaterne af denne undersøgelse er vist i tabel 2 indikerede, at PGE

2 syntase ekspression i LoVo blev øget sammenlignet med kontrolgruppen, mens PUFA’er (undtagen EPA og GLA på LoVo) opreguleret ekspression af PGD syntase sammenlignet med kontrol. Derudover hverken udtryk for PGE

2 syntase eller PGD syntase blev påvist i RKO celler på grund af deres lave udtryk i disse celler.

Diskussion

Der er tegn på at PUFA’er, især EPA og DHA har anti-cancer aktivitet både

in vitro

in vivo

. Tidligere rapporterede vi, at PUFA’er har betydelige cytotoksiske virkning på tumorceller ved at fremme dannelse af frie radikaler, lipidperoxidation, ændring membransammensætning og inducere mitokondriel dysfunktion [2, 3, 20, 28]. I forlængelse af denne undersøgelse, vi nu vurderet, om tilskud af PUFA kunne producere ændringer i dannelsen af ​​deres metabolitter, som kan have en rolle i at gennemføre deres vækst hæmmende virkning. Ændringerne i den morfologiske udseende, fedtsyresammensætning, PGE

2, LTB

4 og LXA

4-sekretion og COX-2, ALOX5, mPGES, PGDS ekspression bemærket i LoVo og RKO-celler som respons på tilskud forskellige PUFA’er indikerer, at der kan forekomme væsentlige ændringer i den måde, disse fedtsyrer der metaboliseres af celler kræft, der kunne tegne sig for deres tumordræbende handling. Det er bemærkelsesværdigt, at semi-opdelte coloncancer RKO-celler er mere følsomme for virkningerne af PUFA’er og 5-FU end udifferentierede colon LoVo cancerceller.

Tumorceller vides at være mangelfuld i aktiviteten af ​​Δ

6 og Δ

5 desaturaser [29, 30], og dermed kan indeholde væsentligt lavere mængder af GLA, AA, EPA og DHA sammenlignet med normale celler. Den nøjagtige årsag til den lave aktivitet af desaturaser i cancerceller er ikke kendt. Eftersom PUFA’er kan undergå peroxidation nemt og generere frie radikaler, som er giftige for celler [2, 3], er det sandsynligt, nedsat aktivitet af desaturaser er en forsvarsmekanisme vedtaget af tumorceller at beskytte sig mod disse giftige molekyler. Som forventet, suppleret fedtsyrer undertrykte spredning af LoVo og RKO celler på grund af deres inkorporering i til cellemembranen i væsentlig grad. Men, hvad der er overraskende er den iagttagelse, at tilskud af AA forbedret EPA-indhold i nævneværdigt omfang både i LoVo og RKO-celler antyder, at der eksisterer en tæt interaktion mellem n-3- og n-6 fedtsyrer [9, 20]. Tidligere beskrev ingen eksistensen af ​​en sådan interaktion mellem n-3 og n-6 PUFA påvirker dannelsen af ​​PG’er, LTs og andre metabolitter. Faktisk viste tidligere undersøgelser, at tilskud af EPA og DHA faldt AA-indhold i cellemembranen lipid pulje af tumorceller [14-16, 23].

AA, EPA og DHA danner forstadier ikke blot til side for at inflammatoriske molekyler PG, TXS og LT’er men også give anledning til potente anti-inflammatoriske molekyler LXS, resolvins, protectins, maresins og nitrolipids [9, 31, 32]. PGE

2 og PGF

2α og LTA

4 og LTB

4 er kendt for at blive produceret i signifikant højere mængder af tumorceller, som kan forbedre deres motilitet og invasive kapacitet [33]. I modsætning hertil LXA

4 kan fremme apoptose og inhibere væksten af ​​tumorer ved at undertrykke tumorangiogenese ved at hæmme produktionen af ​​VEGF [34]. Dette antyder, at balancen mellem pro-inflammatoriske PG’er, LTs og TXS og anti-inflammatoriske LXS, resolvins, protectins, maresins og nitrolipids (der er dannet på grund af reaktion mellem forskellige flerumættede fedtsyrer og nitrogenoxid, og disse forbindelser er anti-inflammatoriske aktioner) kan bestemme graden af ​​proliferation og invasive kapacitet af tumorceller [8]. Desuden PGD

2 kan også inhibere celleproliferation og inducerer apoptose i forskellige celletyper, herunder coloncancer-celler [35]. I den foreliggende undersøgelse blev ekspressionen af ​​PGD syntase (et hastighedsbegrænsende enzym, der regulerer syntesen af ​​prostaglandin D2) fundet at være opreguleret af PUFA’er (undtagen EPA og GLA) sammenlignet med kontrollen i LoVo. På den anden side blev det observeret, at størstedelen af ​​PUFA undtagen DHA inhiberede frigivelsen af ​​PGE

2, mens alle PUFA’erne inhiberede LTB

4-produktion, men forbedret syntesen og frigivelsen af ​​LXA

4 i LoVo-celler . Ligeledes alle PUFA undtagen AA og EPA hæmmede PGE

2 og LTB

4 (undtagen EPA), men øget produktion af LXA

4 i RKO-celler (se fig 5 og 6). Desuden er det bemærkelsesværdigt, at DHA, EPA og AA inducerede signifikant stigning i sekretionen af ​​LXA

4 sammenlignet med andre PUFA’er antyder, at anticancer handlinger disse tre PUFA’er kan på grund af deres evne til at forøge dannelsen af ​​LXA

4 ud over at undertrykke PGE

2 og LTB

4 syntese

. Dette fremgår af de data, der er vist i figur 9, hvor vi beregnede PGE

2 /LXA

4-forholdet. Alle PUFA reducerede dette forhold i LoVo celler sammenlignet med kontrol, undtagen 5-FU, mens AA, EPA (AA EPA) og 5-FU øgede dette forhold i RKO celler. Således i almindelighed alle PUFA’erne forbedret dannelsen af ​​LXA

4 og faldt syntesen af ​​PGE

2 og LTB

4 vippe balancen mere mod anti-inflammatorisk status. (Figur 9: Virkning af ALA, DHA, EPA, LA, AA, GLA og 5-FU på ekspressionen af ​​PGE

2 /LXA

4 i LoVo og RKO-celler in vitro, Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p 0,05). en sammenfatning af de data, der er opnået i den foreliggende undersøgelse, der viser de ændringer, der skete som følge af virkningen af ​​forskellige PUFA’er og 5-FU på udskillelsen af ​​PGE

2, LTB

4, LXA

4, ALOX5, COX-2, er PGDS og mPGES aktivitet i LoVo og RKO givet i tabel 3 for nem reference (tabel 3:. Sammenfatning af virkningen af ​​forskellige PUFA’er og 5-FU på udskillelsen af ​​PGE

2, LTB

4, LXA

4, ALOX5, COX-2, PGDS og mPGES aktivitet i LoVo og RKO celler

in vitro

. N /D = Nedenfor . påviselige grænser)

Værdier i samme kolonne med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p. 0,05)

COX-2 er nødvendig for syntesen af ​​PG’er, LT’er, TXS og LXS. Flere undersøgelser rapporteret, at COX-2-ekspression er forhøjet i kolorektale tumorer i forhold til normalt kolorektal væv [36]. Vores resultater rapporteret her viste, at alle PUFA’erne undtagen AA (i LoVo) og GLA og AA (i RKO) undertrykt ekspression af COX-2. Dette stemmer overens med de resultater, PGE

2 og LTB

4-sekretion hæmmes af disse PUFA’er, der kan på sin side inhiberer tumorcelleproliferation. Det kan nævnes her, at COX-2 også er nødvendig for syntesen af ​​LXA

4, der kan forklare, hvorfor AA forbedret sin (COX-2) -aktivitet i LoVo og RKO celler, der svarede til den forøgede produktion af LXA

4 ses i disse celler. Det er bemærkelsesværdigt, at udskillelsen af ​​PGE

2 og LTB

4 svarede med aktiviteten af ​​mPGES og ALOX5, hvilket indikerer, at opreguleret aktivitet af mPGES og ALOX5 kunne være ansvarlig for den forøgede sekretion af PGE

2 og LTB

4 ses i LoVo og RKO celler.

for første gang viste vi, at væksten hæmmende virkning af PUFA skyldes en stigning i produktionen af ​​LXA

4 i tyktarmskræft celler. Tidligere viste flere undersøgelser, at EPA og DHA undertrykke proliferation af tumorceller ved at inhibere ekspressionen af ​​COX-2. I modsætning til disse studier, vi bemærkede i den foreliggende undersøgelse, at AA undertrykte væksten af ​​colon cancerceller og samtidig opreguleres den for COX-2-ekspression endnu forbedret produktion af LXA

4, der forklarer dens vækst undertrykkende virkning. Derfor foreslår vi, at faldet i produktionen af ​​PGE

2, leukotrien B

4 og en stigning i LXA

4 er mere afgørende for væksthæmmende virkninger af PUFA’er snarere end undertrykkelse af COX-2.

det er bemærkelsesværdigt, at selv om alle PUFA’erne testet og 5-FU induceret samme grad af vækstinhibering af både LoVo og RKO-celler, ændringer observeret i sekretionen af ​​PGE

2, LTB

4 og LXA

4 og COX-2-ekspression viste sig at være variabel. På trods af dette, visse generaliseringer er mulige. Lave mængder af AA, EPA og DHA i tumorceller, på grund af nedsat aktivitet af Δ

6 og Δ

5 desaturaser, kan udløse at øge PGE

2 syntese som en kompenserende mekanisme [37]. Dette understøttes af den observation, at plasma og /eller anden kropsvæske PGE

2 niveauer øges i inflammatoriske tilstande lupus, rheumatoid arthritis og dissemineret sklerose [38-40] (og cancer er også en inflammatorisk tilstand), hvor mangel på PUFA’er er blevet beskrevet [41, 42]. På den anden side viste oral indgivelse af AA og DHA til dyr med inflammatorisk colitis forbedret LXA

4 syntese med lille eller ingen ændring i PGE formation

2 i AA suppleret dyr, mens DHA faldt PGE

2 formation med ingen ændring i LXA

4 [43]. Disse resultater antyder, at når AA, EPA og DHA-niveauer er lave, administration af disse fedtsyrer forøger produktionen af ​​LXA

4 (og eventuelt for andre anti-inflammatoriske molekyler, såsom resolvins, protectins og maresins) med marginale ændringer i PGE

2 syntese. Desuden er LXA

4 kendt for at undertrykke PGE

2-syntese [44, 45]. Det er sandsynligt, at øget LXA

4-produktion opvejer ændringerne i PGE

2 niveauer, således at i sidste ende inflammatoriske proces undertrykkes. Da LXA

4 inhiberede væksten af ​​LoVo og RKO tumorceller [29, 46], forøgede produktion af LXA

4 om tilskud af AA, EPA og DHA og andre PUFA’er, er det sandsynligt, augmented dannelse af LXA

4 (ud over nedsat dannelse af PGE

2 og LTB

4) kunne være ansvarlig for den reducerede vækst af LoVo og RKO-celler bemærket i den foreliggende undersøgelse.

det kan konkluderes, vores resultater viser, at flerumættede fedtsyrer fremkalde toksicitet ved 48 timer af tyktarmskræft LoVo og RKO celler

in vitro

. Cytotoksiske virkning af PUFA kan være forbundet med fald i produktionen af ​​pro-inflammatoriske PGE

2 og LTB

4, COX-2, mPGES og ALOX5 udtryk og øget dannelse af anti-inflammatorisk LXA

4 (tabel 2).