PLoS ONE: Fysisk Status for human papillomavirus Integration i livmoderhalskræft er forbundet med behandling Resultatet af patienterne behandlet med Radiotherapy

Abstrakt

Integration af humant papillomvirus (HPV) DNA i værtsgenomet er en kritisk ætiologisk begivenhed i progressionen fra normal cervix til intraepithelial neoplasma, og endelig til invasiv kræft i livmoderhalsen. Imidlertid har der været lidt arbejde på, hvordan HPV integration status vedrører behandlingsresultatet for celleforandringer i livmoderhalsen carcinomer. I den aktuelle undersøgelse blev HPV-E2 og E6 gen kopiantal målt i 111 livmoderhalskræft væv ved hjælp af real-time qPCR. Integration mønstre blev inddelt i fire grupper: enkelt kopi-integreret med episomale komponenter (gruppe 1), enkelt kopi integreret uden episomale komponenter (gruppe 2), multikopi tandem gentagelse integreret (gruppe 3) og lav HPV (gruppe 4) grupper . En tilbagefald-forudsigelse model blev konstrueret ved hjælp af multivariable Cox proportional hazard model til at klassificere patienter i forskellige risikogrupper for sygdomsfri overlevelse (DFS). Modellen blev internt valideret ved hjælp af bootstrap resampling. Oligonukleotid microarray analyse blev udført for at vurdere genekspressionsmønstre i forhold til de forskellige integrations- grupper. DFS sats var ringere i den rækkefølge af patienterne i gruppe 4, gruppe 2/3, og gruppe 1. Multivariate analyse viste, at histologisk kvalitet, scene gruppe klinisk, og integration mønster var væsentlige prognostiske faktorer for dårlig DFS. Den nuværende prognostisk model forudsiges nøjagtigt risikoen for tilbagefald, med et areal under modtageren opererer karakteristik kurven (AUC) på 0,74 (Bootstrap korrigeret, 0,71). Som konklusion antyder disse data, at HPV-integration mønster er en potent prognostisk faktor for skræddersyet behandling af livmoderhalskræft

Henvisning:. Shin HJ, Joo J, Yoon JH, Yoo CW, Kim JY (2014) Fysisk status humant papillomvirus Integration i livmoderhalskræft er forbundet med behandling Resultatet af patienterne behandlet med strålebehandling. PLoS ONE 9 (1): e78995. doi: 10,1371 /journal.pone.0078995

Redaktør: Anthony W. I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: August 12, 2013; Accepteret: September 25, 2013; Udgivet: 10. januar, 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer center, Goyang, Sydkorea (Grant 1.310.300 og 1.110.033). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Integration af humant papillomvirus (HPV) DNA er blevet betragtet som en kritisk hændelse i processen med cervikal carcinogenese. HPV-DNA er fundet at være til stede i integrerede former i værtsceller med stigende hyppighed fra normal cervikal epitel til intraepitel neoplasier og invasiv cancer i cervix [1], [2], [3]. Men der er rapporter, der viser, at episomal HPV-DNA er til stede i en væsentlig del af invasive livmoderhalskræft, hvilket tyder integrationen ikke altid påkrævet for ondartet udvikling [4], [5]. Enkelt kopi HPV integration resulterer i afbrydelse af E1 eller E2 åbne læseramme (ORF) [2], [4],. Som et alternativ, kan integrering af flere kopier af HPV forekomme som hoved-til-hale tandemgentagelser [6], [7]. Når dette sker, er det kun den virale kopi flankerende det cellulære DNA forstyrret i E1 eller E2-regionen, mens de interne kopier har intakte E1 og E2 åbne læserammer (ORF’er). Henviser tab af E2 ORF kan deregulere transskription af E6 og E7, er det muligt, at intakte E2 ORF’er, som findes med multikopi tandem HPV integrerede genomer, kan udtrykke og bekræfte transkriptionel kontrol på E6 /E7. I den aktuelle undersøgelse, vi evaluerede den prognostiske betydning af forskellige HPV integrationsmønstre for DFS fra livmoderhalskræft. Microarray analyse blev derefter brugt til at sammenligne forskelle i total genekspression mellem disse forskellige integrationsmønstre.

Materialer og metoder

Patient karakteristika

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af National Cancer center, Korea, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. 111 konsekutive patienter blev rekrutteret fra juli 2003 til juli 2008 diagnosticeret med HPV 16, 18, eller 58 positive skællede, adeno, eller adenosquamøst celle karcinom i livmoderhalsen. De kliniske karakteristika for disse patienter er vist i tabel 1. Diagnostiske arbejde-ups inkluderet rectosigmoidoscopy hos alle patienter, magnetisk resonans imaging (MRI) af bækkenet ± maven i 110 patienter, og enten positronemissionstomografi (PET) scanning eller PET /CT (computertomografi) scanning i 93 patienter. Alle blev behandlet med strålebehandling, som består af strålebehandling ved ekstern bestråling (EBRT) og højdosis-rate brachyterapi. Under EBRT, samtidig ugentlige cisplatin 40 mg /m

2 blev givet til alle patienter med undtagelse af 9 patienter, der havde en dårlig præstation skala. Efter afslutningen af ​​den primære behandling, blev patienterne fulgt op hver 3. måned i de første 2 år, hver 4. måned i løbet af tredje år, og hver 6. måned derefter. Nærmere oplysninger om strålebehandling er blevet beskrevet tidligere [8].

Real-time polymerase kædereaktion af HPV E6- og E2-generne

ekstraktion, amplifikation og genotypebestemmelse af DNA blev udført som tidligere rapporteret [8]. Real-time PCR blev udført med ABI Prism 7900HT System og TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, CA). Primerne og proberne blev konstrueret til specifik amplifikation af E2 hængselsregioner som vides at blive forstyrret hyppigst under processen med viral integration [2]. Sekvensen information af hver anvendte primere er tilgængelige i tabel S1. Halvtreds ng mål-DNA fra hver biopsiprøve blev anvendt pr reaktion og Standardkurver blev fremstillet ved amplifikation af en fortyndingsrække af 10

6 -10

3 kopier af en klon af HPV-DNA i pBR322. Mindst tre kontrol uden template reaktionsblandinger blev inkluderet i hvert forsøg, og alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Klassificering af cervikale tumorer med fysiske status for HPV-genomer

På grundlag af den relative kopiantal af E2 og E6, blev patienterne klassificeret i 4 grupper; Enkelt kopi-integreret med episomale komponenter (gruppe 1) og uden episomale komponenter (gruppe 2), multikopi tandem gentagelse integreret (gruppe 3), og lav HPV (gruppe 4) grupper. Gruppe 1 tumorer stadig indeholde episomalt HPV med forstærkning af både E6 og E2 selvom niveauer af E2 reduceres. Gruppe 2-tumorer har ingen E2 amplifikation. Gruppe 3 tumorer har lige niveauer af E2 og E6 hvilket indikerer multikopi tandem gentagne HPV integration. Gruppe 4 tumorer har ingen E2 og E6 amplifikationer. Disse fire grupper blev til sidst re-klassificeret i tre grupper baseret på deres forskellige kliniske resultater (gruppe 1 versus gruppe 2/3 vs. gruppe 4).

microarray analyse

blev udført microarray analyse for 39 patienter fra hvem kunne opnås frisk frosne tumorprøver. Kun patienter med HPV16-infektion blev inkluderet i microarray eksperiment for at undgå heterogenitet skyldes forskellige HPV-genotyper. Som et resultat, 14, 9, 12, og 4 prøver fra integration groups1 til 4, henholdsvis blev analyseret under anvendelse hele den menneskelige genekspression microarray 44K v.1.0 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Alle numeriske data blev normaliseret med pr-stedet og pr-chip normalisering (intensitet afhængig normalisering), og pr-gen normalisering (til median) ved hjælp GeneSpring 7.3.1. Rank-baserede lineær trend analyse blev anvendt til at teste den lineære trend i gen udtryk mellem forskellige integrationsmønstre bestilt af kliniske resultater. Permutation metode med 250.000 re-sampling blev udført for at evaluere den tilsvarende

s

-værdi. Ekspressionsniveauerne i log2 skala blev anvendt i analysen, og den falske opdagelse sats (FDR) [9] blev reguleret til 0,05. Microarray data er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) og er tilgængelige gennem Gene Expression Omnibus serienummer GSE49288.

Statistisk analyse

demografiske og kliniske karakteristika er præsenteret som tæller og procentsatser for kategoriske variable og median og interval for kontinuerlige variabler. De fordelingsmæssige forskelle mellem grupper blev vurderet ved hjælp af Pearson Chi-square test eller Fishers eksakte test. Spearman rang korrelation blev opnået at måle sammenhængen mellem HPV virusmængde og kopiere numre. Forskellene i kopiantal mellem grupper blev testet ved hjælp af Kruskal-Wallis test. Den multivariable Cox proportionel risiko model blev anvendt til at forudsige DFS efter justering virkningerne af andre potentielle forstyrrende faktorer som alder, scene gruppe, nodal status, histologiske kvalitet, og histologiske type. Den endelige model blev valgt baseret på resultatet af univariable analyse samt hensyntagen til den kliniske eller biologiske betydning af variablerne. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SAS-version 9.1 (Cary, NC) og R statistisk software version 2.12. Alle indberettede

p

-værdier er tosidet.

Validering af forudsigelsen model ved hjælp af bootstrap resampling

diskrimination evne til multivariable Cox model til forudsigelse to år sygdomsfri overlevelse blev vurderet ved hjælp af C statistik, en konkordans foranstaltning analog til arealet under receiver opererer karakteristik (ROC) kurve. Kalibreringen af ​​modellen blev vurderet ved anvendelse Hosmer-Lemeshow typen chi-square test ved at sammenligne forskellen mellem de observerede og forudsagte 2 års overlevelsesrater ved den udviklede model for patienter i hver kvintil. Baseret på den forudsagte overlevelsesraten blev tre grupper dannet ved at opdele patienterne i tertiles. Forskellen i overlevelse fordelinger af disse tre grupper blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Den prædiktive model blev valideret ved hjælp 1000 bootstrap prøver som en intern validering for at korrigere den opadgående skævhed i estimering C statistik grund til at re-erstatning af data.

Resultater

E6 og E2 gen kopiantal og integrationsmønster

Klassifikation af patienterne baseret på den relative mængde af E2 og E6 kopiantal resulterede i 31, 24, 37, og 14 patienter i gruppe 1 til 4 hhv. Tærsklen cyklus (CT) forhold af E2 /E6 fra patienter i hver gruppe er angivet ved en scatter plot (fig. 1). 5 patienter havde klassificerbare mønstre. E6 og E2 kopiantal viste en positiv korrelation i group3 (r = 0,83,

s

0,0001) og med GROUP1 (r = 0,43,

p = 0,02

), men ikke i GROUP2 ( r = 0,008,

s

= 0,97) eller i gruppe 4 (r = 0,26,

p = 0,37

).

E2 /E6 Ct forhold af patienterne i hver gruppe er afbildet som prikker på scatter plot. De vandrette bjælker repræsenterer medianværdien med interkvartile område.

Univariable og multivariable analyse af resultatet behandling

Under opfølgningen, 33 patienter (29,7%) udviklede sygdomsprogression, herunder 25 fjerne metastaser eller 10 lokale recidiver. Blandt disse patienter, tre havde begge. Tretten patienter døde og dødsårsag for 2 patienter blandt dem var hjertekarsygdomme og ukendte, henholdsvis. De blev censureret på dødsdagen. Patienterne blev fulgt i median 29 måneder (interval, 2-67 måneder). Medianen periode med opfølgning for patienter uden tilbagefald var 36 måneder (i intervallet 6-67 måneder). Når de fire grupper blev re-klassificeret i tre grupper, DFS rate af patienterne i gruppe 1 var det højeste, efterfulgt af grupper 2/3 og gruppe 4 i en faldende orden. De hazard ratio (HR) og konfidensinterval var 1,90, konfidensinterval (CI) 0,70-5,15,

s

= 0,207 for gruppe 2/3 mod gruppe 1, HR 3,52, CI 1,11-11,14,

p

= 0. 032 for gruppe 4 imod gruppe 1, henholdsvis (

s

= 0,083 ved log-rank test, fig. 2 og tabel 2) på univariable analyse. Andre væsentlige prognostiske parametre for DFS inkluderet fase gruppe, nodal metastase, histologiske kvalitet, histologiske type, og rygning ved univariable analyse. I multivariable analyse, integration mønster (samlet

s

= 0,014, for gruppe 2/3 vs. gruppe 1,

s

= 0,03, HR 3,15, CI 1,12 til 8,9, for gruppe 4 vs . gruppe 1,

s

= 0,004, HR 6,78, CI 1,86-24,79), histologiske kvalitet, klinisk fase gruppe og alder forblev signifikant (tabel 2)

gruppe 1.; Enkelt kopi HPV integration med episomale komponenter, gruppe 2; Enkelt kopi HPV integration uden episomale komponenter, Gruppe 3; Multikopi tandem gentagne integration, Group 4; lav HPV.

Udførelsen af ​​resultatbaserede forudsige modeller og intern validering

C-statistik af modellen til at forudsige to år overlevelse var 74% (95% CI , 65% -83%) og bootstrap valideret C-statistik var 71%. Den Hosmer-Lemeshow typen Chi-square test statistik var 9,02 med den tilsvarende

s

= 0,435 hvilket indikerer en god pasform. Den log-rank test resulterede i en signifikant forskel mellem overlevelse fordelinger af de tre grupper af patienter, defineret ved den forudsagte overlevelse (

s

0,0005). (. Figur 3 og tabel 3)

Microarray analyse af de 39 livmoderhalskræft prøver

654 gener blev udvalgt som viser markant forskellige udtryk blandt integration grupper klassificeret af den fysiske tilstand af HPV-DNA (gruppe 1 vs. gruppe 2 /3 vs. GROUP4). Fordi patienternes overlevelse satser tendens til at falde fra GROUP1 til 4 blev gener, som udviste en korrelative tendens i deres ekspressionsniveauer undersøgt. Som følge heraf blev de gennemsnitlige udtryk for 429 gener blandt dem vist sig at være i gradvis stigning (241) eller formindskelse (188) i størrelsesordenen GROUP1 til 4 (fig. 4). Efter en stringent udvælgelse baseret på familien kloge fejlprocent (Bonferroni korrektion) mindre end 5%, transmembrane modulatorer af celleadhæsion såsom claudin, occludin, og syndecan forblev som gener, der viser signifikante fald fra gruppe 1 til 4. Regulatorer af små GTPase medieret signaltransduktion, såsom celledeling kontrolprotein 42 (cdc42) effektor proteiner, Rho GTPase-aktiverende proteiner, og p21 (cdc42 /Rac) -aktiverede kinase 2 (Pak2) også signifikant nedsat. Disse gener vides at spille en vigtig rolle i reorganiseringen af ​​actin stress fibre, adhæsion af celle til celle, celle til ekstracellulær matrix. Blandt de gener med stigende tendens af ekspression fra GROUP1 til 4 var transskription regulatorer, såsom MYC-associeret faktor X (MAX) og tumornekrosefaktor (TNF). Der var også molekyler forbundet med chromatin remodeling såsom AT-rige interaktive domæne 1A (SWI-agtig), AT-rige interaktive domæne 4B (RBP1-lignende, BRCAA1), og chromodomain helicase DNA-bindende protein. Biologiske funktioner af disse gener blev undersøgt under anvendelse af DAVID Bioinformatik Resources udgave 6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Detaljeret information af generne og

s

-værdi på den lineære trend er anført i tabel S2. Gene ontologi analyse ved anvendelse af dette værktøj angiver, at niveauet af ekspression af gener relateret til keratinocyt og T-lymfocyt differentiation var meget lav i gruppe 4. Især, retinoid X receptor-alfa (NM_002957) blev signifikant reduceret i gruppe 4, mens det var mest stærkt udtrykt i gruppe 1 (data ikke vist). Dette understøtter observationen af ​​manglende epitelial differentiering i tumorer med lav HPV-DNA.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, den prognostiske værdi af den fysiske tilstand af HPV blev undersøgt i lokalt avancerede cervikale tumorer. Vores undersøgelse viser, at cervikale tumorer med episomale komponenter har overlegen post-stråleterapi overlevelse sammenlignet med dem med rent integreret HPV. Det blev også konstateret, at prognosen for livmoderhalskræft er faldet betydeligt i tumorer med ikke-detekterbart niveau af HPV-DNA.

Det er tidligere blevet vist, at invasive tumorer ikke altid består af celler med 100% integreret HPV-DNA. Der er ca. 17~20% af patienter med invasiv cancer med blandet episomale og integrerede former for HPV [4], [5] eller endda episomale former kun i 7% af patienterne [4]. Desuden har flere undersøgelser vist, at den fysiske tilstand af HPV i livmoderhalskræft er forbundet med behandlingsresultaterne [4], [10], [11]. Virale integrationsmønstre er blevet evalueret ved Southern blotting af E1 /E2 site [10] eller ved in situ virus-DNA-signal amplifikationsmetode [11] eller begge disse metoder [4].

relative mængder af E2 og E6 blev anvendt i denne undersøgelse, og overraskende nok blev det konstateret, at en tredjedel (37/111) af prøverne havde multikopi HPV integration. Tilstedeværelsen af ​​multikopi HPV tandemgentagelse genomer i tumorer vides at blive produceret af rolling circle-replikation fremgangsmåde til HPV [12]. Mens prognosen for patienter med både enkelt kopi HPV integration uden episomale komponenter og multikopi tandem gentagen integration var fattige i vores undersøgelse, har brug for den biologiske betydning af denne observation skal afklares.

På trods af HPV genotypebestemmelse og stringent real- time PCR, var der 14 patienter med upåviselig HPV E2 og E6 i deres tumorer, som viste den værste overlevelsesprocent blandt 4 integration grupper. Det er muligt, at tumorer uden HPV-DNA kan repræsentere dem med flere egenskaber ved cancerstamceller som mangler epitheldifferentiering hvor viral replikation er begrænset med mislykkede HPV replikation [13]. I overensstemmelse med denne hypotese viste microarray analyse lav ekspression af gener relateret til keratinocyt og T-lymfocyt differentiation. Desuden er baseret på disse data, er det også antages, at forskelle mellem grupperne i kromatin remodeling kan fremkalde den differentielle ekspression af de forskellige gener. Især kan molekylerne forbundet med Rho-GTPase signalering bidrage til udviklingen i metastatiske fænotype gennem svækkelse af celleadhæsion og morfologisk ændring som EMT (epithelial-mesenchymal overgang) i tumorerne med dårlige overlevelsesrater som foreslået i vores tidligere undersøgelse [14] . Flere undersøgelser skal gøres for at bevise denne idé

De aktuelle data er i overensstemmelse med vores tidligere arbejde, som beskrevet høj viral belastning. (HC2test; Digene Corp) var stærkt forbundet med en god prognose, mens patienter med lavere viral load klarede sig langt værre efter strålebehandling [8]. Sammenfattende har vi bestemt HPV integrationsmønstre ved hjælp af en ny kvantitativ PCR metode til at analysere støkiometrien af ​​HPV E2 og E6 og bestemt deres forhold til post-stråling kliniske resultat. Integrationsmønstre blev således fundet at være en stærk prognostisk faktor, der viser en god korrelation med andre kendte prognostiske faktorer, såsom fase, nodal status, histologiske type og differentiering status. vil være behov for yderligere undersøgelse med større prøvenumre og yderligere metoder til kontrol af HPV integration mønstre i livmoderhalskræft for at bekræfte disse resultater.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Primer og probe sekvenser for E2 og E6 genet realtids-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0078995.s001

(DOC)

tabel S2.

Gener, der viste stigende (a) og faldende (b) lineær tendens fra GROUP1 til GROUP4; Navnet, funktion, fold ændring (FC) af generne og p-værdi af den lineære trend vises under gen ontologi klassificering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0078995.s002

(DOC)