PLoS ONE: ADH IB Expression, men ikke ADH III, reduceres i Human Lung Cancer

Abstrakt

Endogen S-nitrosothioler, herunder S-nitrosoglutathion (GSNO), mægle nitrogenoxid (NO) -baseret signalering , inflammatoriske reaktioner, og glat muskel-funktion. Reducerede GSNO niveauer har været impliceret i flere luftvejssygdomme, og inhibering af GSNO reduktase, (GSNOR) det primære enzym, der nedbryder GSNO, repræsenterer en ny tilgang til behandling af inflammatoriske lungesygdomme. For nylig, en sammenhæng mellem nedsat GSNOR udtryk og menneskelige risiko for lungekræft blev foreslået delvist baseret på immunhistokemisk farvning hjælp af en polyklonalt GSNOR antistof. GSNOR er en isozym af alkoholen (ADH) familie, og vi vise, at antistof, der anvendes i disse undersøgelser krydsreagerer væsentligt med andre ADH-proteiner og er muligvis ikke en passende reagens. Vi evaluerede human lungekræft vævsarrays anvendelse af monoklonale antistoffer stærkt specifikke for humant GSNOR med minimal krydsreaktivitet med andre ADH-proteiner. Vi kontrolleret tilstedeværelsen af ​​GSNOR i ≥85% af prøver undersøgt, og omfattende analyse af disse prøver viste ingen forskel i GSNOR proteinekspression mellem kræft og normale lungevæv. Derudover blev GSNOR og andre ADH mRNA-niveauer evalueret kvantitativt i lungekræft cDNA arrays af qPCR. Overensstemmelse med vores immunhistokemiske resultater blev der GSNOR mRNA-niveauer ikke ændret i lungekræft væv, men ekspressionsniveauerne af andre ADH gener blev nedsat. ADH IB mRNA niveauer blev reduceret ( 10-fold) i 65% af lungekræft cDNA prøver. Vi konkluderer, at de tidligere rapporterede resultater viste en forkert sammenslutning af GSNOR og menneskelig risikoen for lungekræft, og et fald i ADH IB, snarere end GSNOR, korrelerer med human lungecancer

Henvisning:. Mutka SC, Green LH, Verderber EL, Richards JP, Looker DL, Chlipala EA, et al. (2012) ADH IB Expression, men ikke ADH III, reduceres i Human Lung Cancer. PLoS ONE 7 (12): e52995. doi: 10,1371 /journal.pone.0052995

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: 23. oktober 2012; Accepteret: November 27, 2012; Udgivet: December 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Mutka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. N30 Pharmaceuticals , Inc er en privatejet virksomhed. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere undtagen Elizabeth Chlipala er eller var medarbejdere i N30 Pharmaceuticals, at bidragyder af denne studere. Elizabeth Chlipala (Premier Laboratory) blev betalt for at udføre det immunhistokemi arbejde rapporteret i dette manuskript. N30 Pharma udvikler en ny klasse af sygdom modificerende behandlinger, der bevarer intracellulær GSNO (Snitrosoglutathione), en central regulator af orgel reparation, regeneration, og healing. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter er relevante for dette papir at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

S-nitrosoglutathion (GSNO) er en endogent nitrogenoxid-donor, der tjener som et depot for nitrogenoxid (NO) i kroppen og spiller en integrerende rolle i formidlingen NO-medieret signalering funktioner. Nedsatte niveauer af GSNO er ​​blevet korreleret til en række sygdomme og restaureringen er blevet foreslået som en terapeutisk fremgangsmåde til cystisk fibrose [1] og astma [2], [3]. Oxidoreduktasen, S-nitrosoglutathion reduktase (GSNOR), er det primære enzym involveret i katabolismen af ​​intracellulær GSNO, og dens farmakologiske inhibering tilvejebringer en terapeutisk mekanisme til konservering intracellulære GSNO niveauer. Høj potens GSNOR inhibitorer er i øjeblikket under klinisk udvikling [4] -. [7]

GSNOR, også kendt som alkoholdehydrogenase III enzym (ADH III) og formaldehyd dehydrogenase, er evolutionært det ældste medlem af ADH proteinfamilie, og alle andre ADH’er menes at stamme fra GSNOR ved genduplikation [8], [9]. Hos mennesker ADH isozymer er homologe og vise op til 60% aminosyresekvensidentitet. De er også stærkt konserveret mellem arter. Denne høje aminosyresekvens identitet skaber udfordringer i at udvikle specifikke antistoffer til GSNOR. Polyklonale antistoffer er blevet anvendt i adskillige publikationer [3], [10] – [13], og de eneste kommercielt tilgængelige antistoffer for GSNOR er polyklonale. F.eks Marozkina og kolleger brugte kommercielt tilgængelige polyklonale antistoffer mod human GSNOR til at nedsat GSNOR aktivitet fra et terapeutisk GSNOR inhibitor kunne forlade lungen sårbare over for onkogene virkninger fra nitrosative stress [12]. Vi viser, at disse polyklonale antistoffer ikke har tilstrækkelig specificitet til at konkludere, at det observerede signal skyldtes GSNOR snarere end andre ADH isozymer. Vi har udviklet flere stærkt specifikke monoklonale antistoffer mod human GSNOR og anvendt disse antistoffer til at screene arrays af forskellige cancerceller og normale lunge vævsprøver. Foruden immunhistokemi, vi kvantitativt målt mRNA-niveauer af GSNOR og andre ADH isozymer. Vi viser, at den tidligere rapporterede signal observeret af Marozkina et al. var mere tilbøjelige ADH IB og ikke GSNOR. Monoklonale antistoffer til GSNOR give et mere passende redskab til at karakterisere GSNOR proteinekspression.

Materialer og metoder

Antistoffer og oprensede proteiner

ADH IA protein blev købt fra Abnova (Taipei City , Taiwan, # H00000124-Q01), men nogle nedbrydning blev bemærket i dette præparat. Andre proteiner anvendt i denne undersøgelse var forberedt på os ved Emerald BIOSTRUCTURES (Bainbridge Island, WA) som tidligere [14] beskrevet. Kort fortalt GSNOR, ADH IB, ADH II, og ADH IV blev udtrykt med en N-terminal 6 × -histidin affinitetsmærke og et SMT-fusion sekvensen, som blev fjernet ved ULP-1 spaltning efter Ni-affinitetskromatografi til fremstilling af fuld-længde rekombinante proteiner. De omtrentlige molekylvægte for ADH-proteiner før og efter fjernelse af His-SMT-tag er: ADH IB (51 kDa, 40 kDa), ADH II (51 kDa, 40 kDa), og ADH IV (53 kDa, 41 kDa) . His-SMT-GSNOR fusionsproteinet er ca. 50 kDa. De GSNOR proteinpræparater der anvendes til antistoffrembringelse blev bekræftet ved Emerald BIOSTRUCTURES at være i fuld længde ved massespektrometri [4] med en molekylvægt på 39,6 kDa. Vi og andre [15] har vist, at GSNOR, hvad enten oprenset eller fra humane cellelysater, konsekvent migrerer lidt hurtigere end dens forudsagte molekylvægt på SDS-PAGE. Et polyklonalt antistof blev genereret fra serum fra rotter immuniseret med oprenset, rekombinant, humane fuldlængde GSNOR protein ved Biomodels (Watertown, MA) for N30 Pharmaceuticals. Tre forskellige monoklonale antistoffer mod human GSNOR (N30-C3 rotte anti-GSNOR, N30-F6 muse-anti-GSNOR, og N30-G11 muse-anti-GSNOR) blev genereret ved immunisering af mus eller rotter med renset, rekombinant, fuld længde menneskelige GSNOR protein på ProMab Biotechnologies (Richmond, CA) for N30 Pharmaceuticals. Serumtiter blev evalueret ved ELISA før selektion for hybridisering. Hybridoma fusion med myelomceller (ProMab Biotechnologies, Richmond, CA) blev udført med splenocytterne fra mus eller rotte med den bedste titer. Supernatanter fra hybridomcellelinjen brønde blev screenet ved ELISA for positiv reaktivitet for GSNOR. Supernatanter blev også screenet ved ELISA for negative reaktivitet for ADH IB, ADH II og ADH IV. Supernatant fra 10 kloner blev derefter screenet ved N30 Pharmaceuticals ved Western blot for specificitet for GSNOR isozymet og minimal ikke-specifik proteinbinding. To af de 10 kloner for både mus og rotter blev udvalgt og derefter subklonet ved ProMab ved begrænsende fortynding. For muse-monoklonale antistoffer, blev en forsyning af antistof fremstillet ved ascites produktion i 10 mus, og antistoffet blev høstet og oprenset ved IgG kromatografi. For det monoklonale rotte-antistof, blev antistof produceret in vitro ved celledyrkning og IgG oprenset. Kanin polyklonale anti-GSNOR blev købt fra Proteintech (Chicago, IL; # 11.051-1-AP).

GSNOR immunoblotting

Renset ADH proteiner (22,5 ng /brønd) blev analyseret ved SDS- PAGE og immunoblotting under anvendelse af det polyklonale antistof (Proteintech; fortynding 1:50 til slutkoncentration på 1,4 ug /ml) eller monoklonale antistoffer (rotte-anti-GSNOR N30-C3, 2,4 ug /ml; muse-anti-GSNOR N30-F6 og N30- G11 10 ng /ml). HRP konjugerede sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev anvendt til detektion.

GSNOR immunhistokemi

immunhistokemisk analyse for GSNOR blev udført ved hjælp af formalin-fikseret, paraffinindstøbt menneskelige lungevæv microarrays (Folio Bioscience, Columbus, OH; # ARY-HH0178, # ARY-HH0176). Objektglas blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret til vand gennem en række alkohol gradienter. Objektglassene blev forbehandlet i en 95 ° C citrat pH 6,1 antigene Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). Efter at have ladet objektglassene at afkøle til stuetemperatur blev en 3,0% hydrogenperoxidopløsning (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) tilsat for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Objektglas blev præinkuberet med serum frit protein Block (Dako), efterfulgt af inkubation med et GSNOR antistof eller det passende ikke-specifik immunoglobulin kontrol: rotte IgG-kontrol (ABD Serotec, Raleigh, NC), muse-IgG2b (Dako), eller kanin Ig-fraktionen (Dako). Slides mærket med N30-C3-antistof blev derefter inkuberet med kanin-anti rotte immunglobulin (Dako), og alle objektglas blev derefter mærket med et gede anti-kanin eller anti muse polymer (Dako). DAB + (Dako) blev anvendt til påvisning, og slides blev tæller farvet med hematoxylin (Dako).

Analyse af mRNA-niveauer i lungevæv

cDNA arrays fremstillet af 23 matchede par af normal og kræft lungevæv blev købt fra Origene (Rockville, MD; # HLRT504, vare # 0411). Parrene inkluderet lungekræft væv, der dækker Stage IA (n = 4), IB (n = 4), IIA (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), og IIIB (n = 2) hver parret med tilstødende normalt væv. IV vævsprøve One Stage blev ikke parret med en normal prøve, og blev ikke medtaget i analysen. Gen-ekspression af GSNOR (ADH III gen navn

ADH5

), ADH IB (gen

ADHIB

), ADH II (gen

ADH4

), ADH IV (gen

ADH7

), og beta-actin blev kvantificeret ved qPCR hjælp TaqMan primer probesæt (Applied Biosystems, Carlsbad, CA): Humant B-actin (Hs00357333_g1), human GSNOR (Hs00605185_m1), human ADH IB (Hs00605175_m1) , human ADH II (Hs00923466_m1), og human ADH IV (Hs00609447_m1). Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført med et ABI 7300 RT PCR instrument (Applied Biosystems) under anvendelse Perfecta qPCR fastmix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD) ifølge producentens instruktioner. Prøver blev underkastet 1 cyklus ved 95 ° C i 3 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 minut. Til analyse af data, komparative tærskel cyklus værdier (C

t) for beta-actin blev brugt til at normalisere lastning variationer og beregne ΔC

t-værdier. ΔΔC

t-værdier blev beregnet ved at fratrække ΔC

t-værdi for kontrollen (normal) væv fra ΔC

t-værdien for den matchede tumorvæv. ΔΔC

t-værdier blev konverteret til at folde forskelle ved hjælp af formlen 2

-ΔΔCt.

Resultater

Commercial polyklonale GSNOR antistof krydsreagerer med andre ADH proteiner

Nyligt arbejde undersøger GSNOR i human lungecancer [12] anvendte immunhistokemisk farvning af humane lunge cancer prøver med et kommercielt tilgængeligt polyklonalt GSNOR antistof (se materialer og metoder). Fordi protein sekvens af GSNOR er stærkt bevaret med andre ADH isozymer, vi fastlagt sin specificitet for GSNOR sammenlignet med dets specificitet mod andre ADH’er. Krydsreaktivitet blev undersøgt ved immunoblotting under anvendelse af oprenset humant rekombinant GSNOR (ADH III), ADH IA, ADH IB, ADH II, og /eller ADH IV. Som vist i figur 1A, et almindeligt anvendt kommercielt polyklonalt antistof stærkt krydsreagerer med andre ADH-proteiner, især ADH IB, ADH II, og ADH IV. Vi testede andre kommercielt tilgængelige polyklonale antistoffer og en in-house fremstillet rotte polyklonalt GSNOR antistof og fandt alle polyklonale antistoffer testet også stærkt krydsreagerede med ADH-proteiner (data ikke vist og figur 1B). For at løse dette problem, blev monoklonale antistoffer specifikke for GSNOR udviklet ved immunisering af mus og rotter med oprenset, fuld længde, rekombinant humant GSNOR som beskrevet i fremgangsmåderne. Denne indsats omfattede også en tæller-screening skridt for at minimere krydsreaktivitet til andre ADH proteiner. Som vist i figur 2, har tre af de nye monoklonale antistoffer mod GSNOR enten stærkt reduceret eller ingen krydsreaktivitet med andre ADH-proteiner. Så vidt vi ved, er dette den første papir til at beskrive antistoffer med dette niveau af specificitet mod GSNOR.

22.5 ng oprensede rekombinante proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og immunblots blev udført for at bestemme antistofreaktivitet til GSNOR, ADH IA, ADH IB, ADH II, og ADH IV. Med undtagelse af ADH IA, blev de oprensede rekombinante proteiner frembragt med et fusionsprotein tag under kloning, og mærket blev fraspaltet under oprensning som beskrevet i Materialer og Metoder. Molekylvægtene af fusionsproteinerne er omtrent 50-51 kDa og de endelige, oprensede proteiner er 39-41 kDa. Human GSNOR konsekvent migrerer hurtigere end den beregnede molekylvægt. Som det ses af for tilstedeværelsen af ​​både 50 og 40 kDa båndene for ADH II, størstedelen af ​​proteinet i dette præparat indeholder stadig fusionsproteinet tag. Imidlertid blev oprenset GSNOR proteinet anvendt til immunisering bekræftet at være i fuld længde, og fri for yderligere tag-sekvens som beskrevet i Materialer og Metoder. A) Kommercielt tilgængeligt kanin-polyklonalt GSNOR antistof (Proteintech # 11.051-1-AP). B) In-house polyklonale antistof frembragt ved immunisering af rotter med renset, rekombinant, fuld længde menneske GSNOR protein ved Biomodels (Watertown, MA) for N30 Pharmaceuticals.

Rensede rekombinante proteiner blev adskilt ved SDS- PAGE og immunblots blev udført for at bestemme antistofreaktivitet til GSNOR, ADH IB, ADH II, og ADH IV. Tre uafhængige monoklonale antistoffer blev testet: A) N30-F6 muse-anti-GSNOR; B) N30-G11 muse-anti-GSNOR; C) N30-C3 rotte anti-GSNOR.

monoklonale GSNOR antistoffer påvise ekspression i en lang række humane lungekræft

Vi undersøgte GSNOR protein niveauer i forskellige lungekræft væv ved immunhistokemi under anvendelse af de ovenfor beskrevne tre GSNOR-specifikke monoklonale antistoffer og sammenlignet vævet farvningsmønster til det kommercielt tilgængelige polyklonale antistof anvendt i en tidligere publikation [12]. Vi sammenlignede også antistoffet signalet i normalt lungevæv. Ved hjælp af fire antistoffer, vi farves fire identiske menneskelige lungekræft væv microarrays hver indeholder humant væv kerner fra mere end 100 tilfælde af lungekræft på forskellige stadier i progression. GSNOR var stærkt detekteret i normalt humant lungevæv herunder bronkiale epitelceller, alveolære makrofager, og type 2 pneumocytter i alveolerne (figur 3). GSNOR blev også påvist i en lang række lungekræft væv, herunder adenocarcinom, pladecellecarcinom, papillær adenocarcinom, og storcellet carcinoma når væv blev farvet med de monoklonale GSNOR antistoffer (figur 4, N30-C3, N30-F6, N30-G11 ). Farvning i lungekræft væv var svagere, når det polyklonale antistof blev anvendt (Figur 4, 11.051-1-AP). Vævssnit blev scoret af tre undersøgere til GSNOR farvning for hvert antistof (tabel 1). Hjælp af de tre specifikke monoklonale antistoffer, GSNOR proteinniveauer var ikke forskellige i lungekræft prøver sammenlignet med normalt væv; henviser det polyklonale antistof med påvist ADH krydsreaktivitet foreslog, at GSNOR ekspression var højere i normalt lungevæv.

normal human lung tissue microarrays blev farvet med N30-C3 monoklonalt GSNOR antistof (1 ug /ml) efterfulgt af DAB detektion . Bronchieepithelceller celler, alveolære makrofager og type 2 pneumocytter i alveolerne er stærkt farvede.

Normale menneskelig lungekræft væv mikroarrays blev farvet med monoklonale GSNOR antistoffer (N30-C3, N30-F6, N30-G11 ) eller et kommercielt tilgængeligt polyklonalt GSNOR antistof (11.051-1-AP) efterfulgt af DAB detektion. Forskellige menneskelig lungekræft væv er stærkt farvet af alle tre GSNOR monoklonale antistoffer, men farvningen er mindre fremtrædende, når den ikke-specifikke polyklonale GSNOR antistof.

GSNOR mRNA-niveauer er ikke faldet i menneskelig lungekræft væv versus tilstødende normale væv

på grund af potentialet for subjektivitet i sortering væv farvning blev GSNOR og ADH mRNA-niveauer evalueret kvantitativt i human lunge cancer cDNA arrays. Kommercielt tilgængelige cDNA-arrays (se materialer og metoder) blev anvendt, som indeholdt 23 matchede par af normale og ondartede lungevæv. Parrene inkluderet Stage IA (n = 4), IB (n = 4), IIA (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), og IIIB (n = 2) lungekræft væv hver parret med tilstødende normalt væv. GSNOR mRNA niveauer blev kvantificeret ved anvendelse af qPCR, og relative mængder af GSNOR i tumor versus tilstødende normale væv blev beregnet som beskrevet i de supplerende metoder. Ingen korrelation blev observeret mellem GSNOR mRNA-ekspression og lungekræft. I denne analyse 11 af 23 tumorprøver havde relativ tumor /normal udtryk nøgletal 1 og 12 ud af 23 prøver havde udtryk nøgletal 1. Desuden beviser for faldet drastisk, GSNOR udtryk var sjældne i de testede lungekræft prøver; kun 3 af tumorprøverne blev fundet med GSNOR ekspression faldt med mere end 3-fold (forhold 0,33, figur 5). Omvendt, når ekspressionen af ​​ADH IB, ADH II, og ADH IV blev analyseret, flere af prøverne viste større udtryk falder i tumorprøver forhold til GSNOR. Desuden har vi observeret betydelige fald i ADH IB udtryk i lungekræft væv, med 12 ud af 23 par med ≥10 gange fald i ADH IB udtryk i lungekræft prøver (relativ tumor /normal udtryk forholdet ≤0.1). Kun 3 af 23 par havde øget ekspression af ADH IB i lungekræft prøver sammenlignet med den tilstødende normale væv (figur 5).

GSNOR (gen navn

ADH5

), ADH IB (

ADHIB

), ADH II (

ADH4

), og ADH IV (

ADH7

) mRNA-niveauer blev evalueret af qPCR i humane lungekræft cDNA arrays (Origene, # HLRT504, parti # 0411, Rockville, MD) og normaliseret til p-actin niveauer. Arrays indeholdt 23 matchede par af normal og kræft lungevæv. Tumor-ekspression i forhold til den matchede normale prøve blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt metode. Relative mængder 1 repræsenterer faldet udtryk i tumorprøven. Lung cancer prøver inkluderet Stage IA (n = 4), IB (n = 4), IIA (n = 2), IIB (n = 8), IIIA (n = 3), og IIIB (n = 2) med hver prøve parret med tilstødende normalt væv. Ingen korrelation mellem GSNOR mRNA-niveauer og lungekræft blev observeret, mens ekspressionen af ​​ADH IB var stærkt reduceret i prøver lungecancer.

Diskussion

I lungen, endogene S-nitrosothioler herunder GSNO medierer NR-baserede signalering, inflammatoriske reaktioner, og glat muskel-funktion. Inhibering af GSNOR repræsenterer en hidtil ukendt tilgang til behandling af respiratoriske sygdomme via bevare endogen GSNO, og en hidtil ukendt GSNOR inhibitor er i klinisk udvikling til behandling af astma og cystisk fibrose [4].

I denne undersøgelse viser vi konsekvente forskelle i ekspressionen af ​​GSNOR ved sammenligning lungekræft væv til normale lungevæv. Disse resultater modsiger tidligere offentliggjorte arbejde af Marozkina og kolleger [12], der rapporterede, at GSNOR ekspression blev reduceret i lungekræft væv. I deres analyse, bemærkede forfatterne, at 69% af de menneskelige lungekræft biopsier demonstrerede væsentligt reduceret GSNOR niveauer. I deres vurdering, GSNOR niveauer var signifikant lavere i sene fase tumorer i forhold til fase tumorer tidlige, og de konkluderede, at reduceret GSNOR aktivitet er korreleret med senere stadier af tumor vedligeholdelse. Det er sandsynligt, at en primær uoverensstemmelse mellem vores rapport og tidligere rapporter skyldes manglende specificitet af de polyklonale antistoffer, der anvendes i deres analyse. Vi viste, at det polyklonale antistof-stærkt krydsreagerer med andre nært beslægtede proteiner, herunder ADHIB, ADH II, og ADH IV. Faktisk har vi fundet, at hver polyklonalt antistof vi har testet lider af denne samme mangel på specificitet, og konklusioner om GSNOR ekspression og lokalisering trukket fra forsøg med polyklonale antistoffer har et stort potentiale til at blive misforstået. Manglende specificitet i polyklonale antistoffer er ikke overraskende i betragtning af den høje sekvensidentitet mellem GSNOR og andre ADH isozymer. Ved udvikling af et monoklonalt antistof til GSNOR, fandt vi det nødvendigt at imødegå-skærmen klonerne mod flere andre oprensede ADH proteiner for at opnå den krævede specificitet. Brug af GSNOR specifikke monoklonale antistoffer, fandt vi ingen forskel i farvning af kræft versus normal lungevæv.

Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​ikke blot GSNOR men også andre ADH’er i lungekræft væv under anvendelse mere definitive qPCR metoder. Der blev ikke observeret nogen ændring i GSNOR mRNA-ekspression mellem normale og ondartede lungevæv. Omvendt, når ekspressionen af ​​ADH IB, ADH II, og ADH IV blev analyseret, så vi mere og større udtryk falder i tumor prøver. Desuden har vi observeret betydelige fald i ADH IB udtryk i lungekræft væv med 12 ud af 23 par med ≥10 gange fald i ADH IB udtryk i lungekræft prøver (relativ tumor /normal udtryk forholdet ≤0.1).

Det ADH IB udtryk viser en vis forbindelse til lungekræft er ikke overraskende. ADH IB er integreret i en række veje med kendt indflydelse i lungecancer herunder fedtsyre, retinol og tyrosin metabolisme, samt i glykolyse og glukoneogenese [16]. I en metaanalyse af publicerede studier ser på forholdet mellem ADH IB i lungekræft, blev ADH IB udtryk faldt i lungekræft i et overvældende antal prøver og analyser [16], og klart polymorfier af ADH IB har vist sammenhænge til andre typer af cancer, herunder esophageal [17]. I modsætning til ADH IB hvor der har været en betydelig efterforskning i forhold til kræft, har GSNOR ekspressionsniveauerne nylig blevet foreslået at korrelere med hepatocellulært carcinom [13]. Disse undersøgelser i del påberåbt GSNOR knock-out mus, der har betydelige fænotypiske forskelle i forhold til kontroller vildtype, og de seneste undersøgelser fra vores laboratorium har vist dette enhver påstået sammenhæng mellem genetisk sletning af GSNOR og hepatocellulært carcinom ikke kan ses i en haplosufficient model (GRJ og D. Colagiovanni, manuskript under udarbejdelse, N30 Pharmaceuticals).

sammenfattende fremgår det, at et fald i ADH IB, snarere end GSNOR, korrelerer med human lungecancer, og tidligere rapporterede resultater viste en ukorrekt sammenslutning af GSNOR og human risiko for lungekræft. I yderligere støtte for denne konklusion, har offentliggjort undersøgelser af mus med homozygot genetiske sletning af GSNOR fundet nogen stigning i murine lungekræft i begge ubehandlede GSNOR

– /- mus eller GSNOR

– /- mus behandlet med kræftfremkaldende diethylnitrosamin [13]. Således GSNOR udtryk og hæmning synes ikke at være forbundet med risiko for menneskelig lungekræft.

Tak

Forfatterne takker Ross Benik til teknisk bistand med væv farvning.