PLoS ONE: Ensemble of Gene Signatures Identificerer Novel Biomarkører i kolorektal cancer Aktiveret gennem PPARy og TNF Signaling

Abstrakt

Vi beskriver en ny bioinformatisk og translationel patologi tilgang, gen Signature Finder Algorithm (gSFA) for at identificere biomarkører forbundet med kolorektal cancer (CRC) overlevelse. Her et robust sæt CRC markører er valgt af et ensemble metode. Ved anvendelse af et datasæt af 232 genekspressionsprofiler, gSFA opdager 16 højsignifikante små gen signaturer. Analyse af dikotomier genereret ved underskrift resulterer i et sæt af 133 prøver stabilt klassificeret i god prognose gruppe og 56 prøver i dårlig prognose gruppe, mens 43 stadig unreliably klassificeret.

AKAP12

,

DCBLD2

,

NT5E

og

SPON1

er særligt repræsenteret i underskrifterne og udvalgt til validering

in vivo

på to uafhængige patienter kohorter omfatter 140 tumorvæv og 60 matchede normale væv. Deres udtryk og lovgivningsmæssige programmer undersøges

in vitro

. Vi viser, at den koblede udtryk for

NT5E

og

DCBLD2

håndfast stratifierer vores patienter i to grupper (hvoraf den ene med 100% overlevelse ved fem år). Vi viser, at

NT5E

er et mål af TNF-α signalering

In vitro

; tumor suppressor PPARy fungerer som en roman

NT5E

antagonist, positivt og samtidig regulerer

DCBLD2

i en kræftcelle kontekst-afhængig måde

Henvisning:. Pagnotta SM, Laudanna C , Pancione M, Sabatino L, Votino C, Remo A, et al. (2013) Ensemble of Gene Signatures Identificerer Novel Biomarkører i kolorektal cancer Aktiveret gennem PPARy og TNF-signalering. PLoS ONE 8 (8): e72638. doi: 10,1371 /journal.pone.0072638

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: April 18, 2013; Accepteret: 11. juli, 2013; Udgivet: 19 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Pagnotta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministero dell’Università e della Ricerca under tilskud (PRIN2008-20085CH22F) og Associazione italiana per la lotta ai linfomi e leucemie. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal Cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige malignitet på verdensplan og en udbredt årsag til sygelighed og dødelighed. CRC overlevelse er tæt forbundet med den kliniske og patologiske stadium af sygdommen på diagnosetidspunktet; over en tredjedel af CRC patienter dør inden for fem år fra den første diagnose, og de fleste af dødelig udgang skyldes levermetastaser [1].

På trods af den nylige indførelse af mere effektive terapeutiske midler, der er kun få validerede prognostiske biomarkører at vurdere aggressivitet af sygdommen og sandsynligheden for fornyet eller død efter operation. Nylige undersøgelser foreslår små gen signaturer som kendetegnende for tumor stadie [1,2]. Op til dato integrative studier opdagede amplifikationer af

ERBB2

IGF2

og gener betydeligt muteret i CRC såsom

APC, TP53, Smad4, PIK3CA

KRAS

som potentielle terapeutiske mål [3]. Således vil identificere præcise prædiktive og prognostiske markører kombineret med den voksende arsenal af terapeutiske midler give mere effektive behandlinger relateret til patientens molekylære profil minimere livstruende toksicitet [4].

Vi har udviklet en ny beregningsmæssige tilgang , gen Signature Finder Algorithm (gSFA) til at generere flere små gen-sæt, som stratificere patienterne i form af overlevelse. Vores strategi gør brug af tilgængeligheden af ​​store genekspression datasæt til at vælge kandidater, der kan derefter valideres i selvstændige biblioteker af væv. Vi nærmede problemet med udvinding egnede funktioner fra den globale genekspression, der bedst korrelerer med de kliniske oplysninger til at oprette prognostiske signaturer. De fleste af de nuværende procedurer er baseret på ekspertviden for at vælge blandt tusinder af gener, molekylære markører, der kan være forbundet med prognosen [5]. For nylig, nye metoder, jordede på data mining, maskine læring [6] og statistisk regression [7] for “Signatur læring« er blevet foreslået. Dette er et interessant emne i Computational Biologi og kan modelleres som et problem med optimal funktion udvælgelse [8]. Her har vi vedtaget som optimalitet kriteriet betydningen af ​​log-rank test mellem overlevelseskurverne for de grupper, fremkaldt af de udvalgte funktioner og brugte en roman procedure, der integrerer flere signaturer, der genereres af en grundlæggende grådige algoritme. Underskrift gener derefter rangeret på baggrund af nogle score målinger, der måler bidraget af genet til underskrifterne det tilhører.

Med udgangspunkt i en offentlig datasæt af to hundrede og toogtredive CRC genekspressionsprofiler, vores algoritme valgt blandt andre overlevelse-relaterede biomarkører såsom

AKAP12, DCBLD2, NT5E

, og nye CRC-specifikke markører såsom

SPON1

. Vi screenede de kandidatgener på to uafhængige kohorter af 140 patienter med primær sporadisk CRC ved hjælp immunhistokemi på Tissue microarrays (TMAS). Variationerne i genekspression blev efterfølgende testet i en

in vitro

celle system, der bekræftede de

in vivo

data. Kollektivt, vores data giver en ny metode til at identificere nye og robuste biomarkører som et værdifuldt skridt hen imod en bedre prognostisk lagdeling og behandling af patienter.

Materiale og metoder

Microarray Datasæt

Vi anvender

gSFA

(beskrevet nedenfor) til offentlige datasæt til at identificere et sæt af biomarkører. De data, der tages i betragtning, er dem fra samlingerne rapporteret i [9] og tilgængelig som GSE17536 og GSE17537 datasæt i Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Begge datasæt er genekspressionsprofilering opnået ved hjælp af Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. GSE17536 tæller 177 prøver på 54613 gen-sonder, mens GSE17537 har 55 prøver på samme sonder. De 232 rå celle filer blev hentet fra begge samlinger, så baggrund korrektion, fraktil normalisering og sammendrag blev anvendt.

tumorprøver

Vi analyserede CRC prøver fra to uafhængige patienters kohorter omfatter en test serie og en validering serie (I og II) henholdsvis. Kohorte I omfatter halvfems-otte CRC sager og 60 parret tilsyneladende normal slimhinde fjernes under samme operation. Dette datasæt omfatter både paraffin indlejret og flydende nitrogen frosne prøver, som rapporteret [10,11]. Kohorte II består af 42 tilfælde af sporadisk CRC indsamlet på Patologisk Institut og onkologi, Legnago Hospital Verona, Italien i perioden 2005-2007. Tumorer blev klassificeret og klassificeres efter kriterierne i TNM og tumor stadier I-IV klassifikationssystemer; den gennemsnitlige alder af patienterne var 71,2 ± 18,21. Ingen af ​​patienterne havde en familiær historie med intestinal dysfunktion eller CRC, havde modtaget kemoterapi eller strålebehandling før resektion eller havde taget non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler på regelmæssig basis. Konventionelle postoperative behandlinger blev givet til alle patienter, afhængigt af alvorligheden af ​​sygdommen. Samlet længde af overlevelse blev beregnet fra den første operation. Patienterne blev fulgt i en median på 55 måneder eller indtil døden.

immunhistokemisk analyse og evaluering af farvning

For immunhistokemisk analyse blev vævssnit afparaffineret, hydreret i gradueret alkohol, og mikrobølgeovn behandlet for 20 min ved 750 W. Heat epitopgenfinding blev udført ved opvarmning af TMA objektglassene nedsænket i hentning buffer citrat (pH 6,0). Snittene blev inkuberet med 3% hydrogenperoxid i 20 minutter ved stuetemperatur og efterfølgende med de specifikke antistoffer: AKAP12 (fortynding 1: 500; WH0009590M1, muse monoklonalt, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Spondin1 (fortynding 1: 250, AB40797, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK)); NT5E (fortynding 1:50; AB115289, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK); og DCBLD2 (fortynding 1: 100; AB115451, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK) alle antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Sekundære antistoffer, efterfulgt af streptavidin-peberrod-systemet blev inkuberet i 30 minutter hver, ved anvendelse af streptavidin-biotin peroxidase-farvning kit (LSAB + System HRP; Dako Cytomation, Glostrup, Danmark). Immunreaktivitet blev afsløret ved inkubering i 3,3-diaminobenzidin (DAB) substrat i 5 minutter. Efterfølgende blev snittene modfarvet med hematoxylin, de-hydreret, og cover-sled. Primære antistoffer blev udeladt i negative kontroller.

En semikvantitativ metode blev anvendt til at evaluere immunoreaktivitet under hensyntagen til antallet af positive celler og farvning fordeling af farvning i subcellulært afsnit (cytosol og /eller membran). For hver prøve blev hele stykke mikro væv undersøges gennem lysmikroskopi ved 20x forstørrelse. Procentdelen af ​​kræftceller, identificeret ved immunoreaktivitet for hver markør, blev estimeret for alle prøver i TMA. Repræsentative områder (5 højstyrkefelt) indeholdende den højeste andel af cancerceller blev anvendt til tælling tumorcellerne per sektion. Fraktionen (procentdel af immunoreaktive tumorceller, i tredobbelte prøver) udtrykt som antallet af positive celler for Fields (FKF), blev derefter beregnet.

etiske retningslinjer

Denne undersøgelse blev udført ifølge til principperne i Helsinki-deklarationen og godkendt af Institutional Review Board of “Fatebenefratelli” Hospital i Benevento og Legnago Hospital, Verona, Italien. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse

Statistisk analyse:. Gen Underskrift Finder Algorithm (gSFA)

Vores gen udvælgelsesprocedure anvender en effektiv wrapper metoden [8] baseret på uovervåget klyngedannelse, med en forstyrrelse ordning genererer flere gen-sæt med forskellige startbetingelser at starte gen valg. De indledende betingelser svarer til frø gener, der udviser nogle egenskaber såsom at være en god indledende hypotese. Den resulterende Algoritmen er defineret

geneSignatureFinder

(gSFA) implementeret i en R-pakke og tilgængelig CRAN (https://cran.r-project.org/web/packages/geneSignatureFinder/index.html) i en open source til download. gSFA, der er en generalisering af den modificerede stejleste Descent foreslået af Boutros et al. [6], består af fire vigtigste trin (Figur 1):

gen Signature Finder Algoritme

består af 4 separate trin: (1) finde kandidat frø gener; (2) generere en signatur ud fra hvert frø genet; (3) beskære underskrifterne ved statistisk inferens; (4) integrere underskrifter ved gen-ranking

Trin 1:.

Frø Finder

første skridt i vores algoritme er rettet mod at vælge et sæt af gener, der kan være en pålidelig start frø til at udvide signaturen. Vi anvendte et sæt af gener ifølge to betingelser: (a) en bimodal fordeling af ekspressionsniveauerne, (b) evne til at adskille datasæt i to grupper på basis af overlevelse analyse test. Især for hvert gen

i

anser sekvensen g

i

= {

x

ij

,

jeg

= 1 …,

M

}, hvor

x

ij

er ekspressionsniveauet af gen

jeg

i prøve

j

. Bayesian Information Criterion (BIC) [12] er derefter bruges til at kontrollere bimodalitet hypotese for sekvensen g

jeg

. Sekvensen g

jeg

er grupperet i to undersæt S

1 og S

2 ved hjælp af en

k

-median algoritme (

k

= 2), og afstanden mellem overlevelseskurverne for prøverne i S

1 og S

2 beregnes derefter. Seed gener er dem, manifesterer bimodalitet og adskillelse mellem kurverne under et udvalgt betydning tærskel (i alle vores eksperimenter 0,05)

Trin 2:.

Signatur formering

Givet et sæt af

K

frø gener valgt som det forrige trin, vi udvidet aa lille gen signatur startende fra hvert frø gen. En grådig strategi vedtages ved at vælge som næste signatur gen genet maksimere forøgelsen af ​​afstanden mellem overlevelseskurverne for de to sæt S

1 og S

2 opnås ved klyngedannelse det todimensionale datasæt (indeholdende den frø-genet og den næste kandidat signatur genet). Algoritmen fortsætter tilføjer gener til hver signatur på denne måde, indtil der ikke yderligere forbedring af afstanden mellem overlevelseskurver opnås

Trin 3:.

Signatur analyse og beskæring

En

betydning indeks

beregnes for hvert gen af ​​de

K

underskrifter, det er et mål for, hvor meget et enkelt gen bidrager til at forbedre afstanden mellem overlevelseskurverne i forhold til afstanden baseret på alle gener i en signatur. Det er defineret som 1 minus forholdet mellem afstandene fra overlevelseskurverne opnået, når det udvalgte gen er fjernet fra signaturen (detaljer i den medfølgende fil Supplerende gSFA procedure). Så hver signatur beskæres af de gener, der ikke bidrager betydeligt til at adskillelsen af ​​dikotomien genereret af signaturen

Trin 4:.

Gene Ranking

Fra ensemble af genet i

K

underskrifter, kan vi få forskellige scores for at vælge kandidatgener, der er potentielt forbundet med de prognostiske grupper. Vi scorer generne på grundlag af det antal underskrifter, hvor de forekommer, og deres gennemsnitlige betydning indeks

De ledsagende Materialer Metoder S1 (Supplerende gSFA procedure) indeholder alle detaljerne i algoritmen og kommandoer til at replikere hele analysen med R ved hjælp af gSFA pakken.

Resultater

gen Signature Finder Algorithm (gSFA) afslører mange underskrifter i forbindelse med celleadhæsion og ekstracellulær matrix organisation

Vi anvendte gSFA til et datasæt af to hundrede og toogtredive CRC prøver og identificeret 16 frø-gener, der viser en signifikant (

s

0,05 efter korrektion) univariat adskillelse af overlevelseskurverne mellem gode og dårlige prognose grupper og er bi-modal samtidig (ca. 1/3 af sonderne viser bimodalitet). Fra hver af de frø-gener vi opnået underskrifter, der er angivet i tabel 1; de tilsvarende overlevelseskurver er illustreret i fig S1. I de fleste tilfælde er

s

-værdi er ikke beregnelige da

t

-værdien er ud over maskinens præcision. Selvom de udvalgte gen undersæt kan være anderledes, overlevelseskurverne synes ofte ens (figur S1), så vi spurgte forskellen mellem adskillelsen fremkaldt af hver signatur. Vi beregnede afstanden mellem klyngedannelse opnået ved hver af de 16 underskrifter og få dendrogram rapporteret i figur 2a: vi konstatere, at andet gen signatur til sidst kan generere lignende dikotomier. Denne dendrogram tillader opnåelse en robust klassifikation af prøverne i to grupper efter det antal gange en given prøve falder i en af ​​grupperne. Især

stabil god prognose gruppe

omfatter prøver at der i mindst 80% af dikotomier falder i god prognose gruppen, analogt til

stabil dårlig prognose gruppe

. Således blev 133 og 56 prøver klassificeres i stalden godt eller dårlig prognose gruppe, henholdsvis, mens 43 forblev unreliably klassificeres og defineres usikre prøver. De tilsvarende overlevelses kurver er rapporteret i figur 2b, log-rank test mellem de tre kurver giver en

s

-værdi 10

-16. 1609 differentielt udtrykte gener (fold ændre 1.5 og korrigeres

s

-værdi 0,05) mellem de to stabile prognostiske grupper genereret clustering Heatmap i figur 2c. Prøverne blev opdelt i to hovedgrupper: den første består 113 ud af 133 (85%) af stabilt klassificeret som god prognose gruppe; den anden 55 ud af 56 (98%) af dårlig prognose gruppe. De tilsvarende overlevelses kurver er rapporteret i figur 2d, log-rank test mellem de to kurver giver

s

= 6,6 · 10

-6. Silhuetten af ​​klyngen adskillelse er også rapporteret i den medfølgende fil Supplerende gSFA procedure.

Seed Gene

t

-værdi

log (

s

-værdi)

Signature

PCSK5 (205560_at) 76,572 -16PCSK5, AKAP12, NPR3, AGPAT5, GMFB, C6orf141, 1569202_x_at, KCNH8FST (226847_at) 75,757 -16FST, AKAP12, ULBP2, SLC25A43, EI24, 1563467_at, CLDN8POSTN ( 214981_at) 74,023 -16POSTN, AKAP12, AGPAT5, ATL3, SLC44A2SUSD5 (214954_at) 71,842 -16AKAP12, 241867_at, ADAMTS5, APLP2, PITPNC1, 1556983_a_atKIAA1462 (231841_s_at) 67.624-15.654KIAA1462, DCBLD2, ADIPOQ, FAM217B, C17orf48DCBLD2 (230175_s_at ) 66.71-15.477DCBLD2, AKAP12, GUSBP11, CDR2L, MGC16703, METTL4NPR3 (219054_at) 66.457-15.477NPR3, DZIP1, 243820_at, 238109_at, 236795_at, DNAJC4, FOXA1, EMID2AKAP12 (227530_at) 65.522-15.256AKAP12, ISM1, C11orf9, 244026_at, ARHGAP9, NOL3, AP2A1PAPPA (201981_at) 65.024-15.109PAPPA, NT5E, DUSP7, 230711_at, CD96, ABI2ETV1 (221911_at) 61.631-14.386ETV1, LONRF3, NGEF, RAB2A, U2AF2, CPOKIAA1462 (213316_at) 60.733-14.184KIAA1462, AKAP12, UGGT2 , 231989_s_atSRGAP2P1 (1568955_at) 58.417-13.674SRGAP2P1, AKAP12, SNX16, NT5ELOC100132891 (228438_at) 58.037-13.589LOC100132891, DCBLD2, ADIPOQ, SLFN5DCBLD2 (224911_s_at) 50.106-11.837DCBLD2, ADCY7, EHD2CTGF (209101_at) 46.099-10.949CTGF, FERMT1, AKAP12 , CDK1EFHA2 (238458_at) 42.166-10.076EFHA2, ST18, ACACBTable 1. Underskrifter udviklet fra 16 frø-gener.

CSV Hent CSV

a. Dendrogram af dikotomier genereres af hver af de 16 gSFA signaturer (tabel 1 og figur S1); b. Overlevelse plot af de 133 prøver stabilt klassificeret i god prognose gruppen, 56 prøver i dårlig prognose gruppen og 43 usikre prøver (log-rank test giver

s

10

– 16); c. Heatmap af DEGS mellem de to stabile grupper, Rød indikerer overudtrykte gener (ekspressionsniveauerne over medianen) og grøn indikerer underexpressed gener (ekspressionsniveauerne under medianen); d. overlevelseskurver prøver i de to klynger af den Heatmap som i c. (

p

= 6,6 · 10

-6).

For at belyse de biologiske processer og funktioner, der er forbundet med de disse to klynger, vi identificerede 1394 differentielt udtrykte probesets svarende til 1024 forskellige gener (degs), 87% af, som er indeholdt i listen over DEGS mellem de stabile prognostiske grupper. DEGS liste beriget adskillige Gene ontologi (GO) kategorier. Vores gSFA procedure valgt, som relateret til den dårlig prognose gruppe, et sæt prøver med mesenkymale træk forbundet med af gener involveret i proliferation og celleadhæsion. Især GO analyse af gener opreguleret i den fattige gruppen viste, at

Cell Adhæsion

blev beriget med 123 degs (

s

10

-28),

ekstracellulære matrix Organisation

med 34 gener (

s

10

-15),

reaktion på Anskydning

med 95 degs (

s

10

-22),

Immunrespons

med 91 gener (

s

10

-14). Desuden er disse degs beriget Kegg Pathways

ECM-receptor interaktion

(

s

10

-10) og

Focal vedhæftning

(

p

10

-8). Når det lægges Ingenuity Pathway Analysis, vores liste over degs udarbejdet et sæt berigede kategorier, hvis

s

-værdi er angivet i figur S2a. Især blev andre kategorier relateret til væv udvikling og kræft betydeligt beriget; specielt dem, der vedrører kolorektal cancer blev beriget ved

s

10

-14.

For at forstå de centrale regulatorer involveret i adskillelsen i de to prognostiske grupper, blev udført en berigelse analyse af opstrøms regulatorer. Interessant, transformerende vækstfaktor beta 1 (TGFp1) var opreguleret i dårlig prognose klynge [13]. Desuden kunne netværket af de 20 regulatorer afbildet i figur S2b forklare adfærd 177 af de udvalgte gener. De øverste regulatorer af netværket også omfattede andre opløselige vækstfaktorer, såsom medlemmer af fibroblastvækstfaktor (FGF) og tumornekrosefaktor (TNF) familier. De valgte gener er involveret hovedsageligt i TGFp1 signalering, som 109 molekyler (

s

10

-51) er dens annoterede mål i IPA videnbase. Receptor medieret signalering som reaktion på disse ligander udløser aktivering af intracellulære effektor molekyler, såsom de små GTPase familiemedlemmer RAS, medlemmer af SRC tyrosin-kinase familie eller transkriptionsfaktorer herunder, SMAD, RUNX2, STAT3, NFKB, p53 og β- catenin. Disse effektorer har en central rolle i CRC progression og metastatisk invasion fremmer dannelsen af ​​en tumor-associerede mikromiljø.

TMA validering af biomarkører identificeret af ensemblet signaturer

For at identificere robuste biomarkører i forbindelse med CRC prognose, der kan valideres i vores to biblioteker af væv, brugte vi rangeringen rapporteret i det tredje trin af gSFA og de resulterende gener er vist i tabel S1, hvor

AKAP12, DCBLD2, NT5E

var den mest almindelige gener udvalgt af algoritmen i de forskellige signaturer. Vi har også valideret SPON1 som uventet var blandt de mest differentielt udtrykt gener af de to grupper; dog har sin rolle i CRC ikke blevet behandlet endnu. Vi screenet ved immunhistokemi (IHC) TMA’erne af vores serie af 140 CRCs og en undergruppe af 60 normale matchede colon prøver at bestemme den prognostiske potentiale af de udvalgte gener. Markører ‘ekspressionsmønster blev registreret som andelen af ​​positive celler: en positiv farvning over 25% af tumorcellerne blev defineret høj ekspression. Figur 3a rapporterer repræsentative væv lysbilleder af TMA mærket med antistoffer mod AKAP12, DCBLD2, NTE5 og SPON1. Figur 3b rapporterer de overordnede procentdele af påvisning mellem tumor og normale prøver. I figur S3 yderligere farvning af DCBLD2 og NT5E ved en højere opløsning er illustreret.

a. “Kolonner fra venstre til højre” indikerer immunfarvning mønster i normale colon prøver og CRC kerner negative og positive for hver markør AKAP12, DCBLD2, NT5E, SPON1. Sorte pile angiver immunhistokemisk farvning mønster i normale eller maligne colon celler. Hvide pile angiver immunfarvning fordeling i det stromale rum (endotelceller, regulatoriske T-celler og makrofager) karakteristisk for NT5E ekspressionsmønster. Forstørrelse 10X; b. Antal positive tilfælde fundet på TMA validering serie bestående tumor prøver (TUM) og en undergruppe af matchet normal colon mucosa (NM). Fejl søjler indikerer standardafvigelsen fra middelværdien (

s

0,05); c. Fire repræsentative frosne CRC prøver (T) og matchet normal mucosa (N) blev identificeret i den samme kohorte af patienter og analyseret ved immunblot. Molekylvægt-markører er vist i kilodalton. β-tubulin blev anvendt som lastning kontrol for at normalisere band intensiteter.

I den normale colon mucosa, AKAP12 immunfarvning var altid positiv, lokaliseret til cytosolen og hovedsagelig fordelt i apikale krypt rum dvs i mere differentieret celler. I CRC prøver blev AKAP12 immunoreaktivitet bibeholdes i 55% og fraværende i ca. 45% af tilfældene.

DCBLD2 var altid positiv i normale colon celler og jævnt lokaliseret på baso-lateral plasmamembraner. I CRC prøver blev immunfarvning påvist i ca. 52% af tilfældene. I nogle tumorsnit blev DCBLD2 immunopositivitet også lokaliseret til cytosoliske rum.

NT5E immunopositivitet blev hovedsagelig fundet i stromale celler (endotelceller eller regulatoriske T-celler) af den normale colon-mucosa, mens det var svagt positiv eller negativ i epiteliale colon celler. I overensstemmelse med denne konstatering, NT5E immunopositivitet markerede tumorassocierede stroma og var til stede i maligne celler i omkring 40% af tumorprøver. Interessant nok i de resterende 60%, NT5E farvning markerede også maligne epitelceller, ud over de stromale dem.

SPON1 immunoreaktivitet var positiv kun i ca. 20% af normale colon prøver. Bemærkelsesværdigt, SPON1 blev påvist hos ca. 70% af CRC prøver, med en membran eller cytosolisk lokalisering. Positivitet inden tumorer var signifikant korreleret med kollagen IV og vimentin udtryk, hvilket tyder på en rolle SPON1 i omlægning og ombygning af tumor ekstracellulær matrix (ECM) (data ikke vist).

Western blot analyse på Primary CRC

for at bekræfte IHC udtryk profil og til at have mere kvantitative data, tyve tilfældigt udvalgte CRC prøver og matchede normale slimhinderne fra samme kohorte af patienter blev analyseret ved western blot, ved hjælp af de samme antistoffer ansat i IHC. Denne analyse verificerede også specificiteten af ​​antistofferne. De opnåede bånd blev kvantificeret ved densitometri efter normalisering til p-tubulin for protein loading. AKAP12 og DCBLD2 blev ofte opdaget på lavere niveauer i tumor (T) end normale matchede væv (N). I modsætning hertil NT5E og SPON1 ekspression viste signifikant højere niveauer i tumorer end kontroller. Figur 3c rapporterer bånd svarende til fire repræsentative prøver, den kvantisering, der er rapporteret i figur S4A. Selvom oplysningerne kun er nævnt 20 sager, de bekræftede specificiteten af ​​resultaterne og styrket forskellene mellem normale og tumor prøver påvist ved IHC på TMAs.

Biomarkører Expression Profiler og klinisk-patologiske parametre

Vi udførte en multiple sammenligningstest evaluere IHC ekspression hyppigheden af ​​hver biomarkør og klinisk-patologiske parametre. Vi fandt ingen sammenhæng mellem AKAP12 eller SPON1 genekspression profil og patienternes alder, køn, tumor stadium, differentiering eller histologi, tilstedeværelse af nodal og levermetastaser. I modsætning hertil blev der tab af DCBLD2 korreleret med fremskredne stadier af sygdommen (

s

= 0,021). Faktisk 37,4% af de testede lavt for DCBLD2 ekspression prøver var hyppigere trin IV-tumorer sammenlignet med 15% af DCBLD2 højt udtrykkende dem. Selv tilfælde forbundet med fjernmetastaser havde signifikant lavere niveauer af DCBLD2 udtryk end dem uden levermetastaser (

s

= 5,71 · 10

-5). Især tumorer også udtrykker høje niveauer af NT5E viste en lignende modtagelighed for metastatiske tumorer (

s

= 6,62 · 10

-4). Foreningen mellem biomarkører og klinisk-patologiske parametre i vores CRC datasæt er illustreret i tabel S2.

At udforske, hvilke af de udvalgte gener også var en uafhængig prædiktor for patientens overlevelse i vores CRC validering serie, vi klassificerede tumorer så lavt eller højt udtrykkende hvert af de biomarkører, der undersøges. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at tabet af AKAP12 marginalt var forbundet med dårlig samlet overlevelse (OS) (

s

= 0,0758, Figur 4a). Bemærkelsesværdigt, lav membran-associeret udtryk for DCBLD2 og overekspression af NT5E i tumorceller var stærkt associeret med kortere overlevelse (

s

= 5.97 · 10

-7and

s

= 1.01 · 10

-5 henholdsvis figur 4c og 4d). Ingen signifikant sammenhæng med OS blev fundet under hensyntagen kun NT5E immunopositivitet i tumorassocierede-stroma (figur S5). SPON1 overekspression ikke var korreleret med patienternes prognose (data ikke vist).

a. Overlevelse kurver på vores CRC validering serie, kategoriseret som havende høj (rød kurve) og lav (grøn kurve) AKAP12, DCBLD2 og NT5E udtryk.

s

-værdi for nul-hypotesen om lige population overlevelseskurver leveres af log-rank test i hver graf; b. Overlevelse kurver estimeret kombinere udtrykket (

høj

lav

) af alle 3 markører (AKAP12, DLBLC2, NTE5). Rød kurve repræsenterer kombinationen

høj /høj

; den blå kurve repræsenterer kombinationen

høj /lav

; den sorte kurve repræsenterer kombinationen

lav /høj

; den grønne kurve repræsenterer kombinationen

lav /lav

.

Endelig har vi vurderet, om alle tre prædiktive markører (AKAP12, DCBLD2, NT5E) kunne udøve gensidige virkninger og forbedre prognostisk nøjagtighed. Sagerne blev klassificeret i 4 grupper efter deres ekspressionsniveauer (figur 4d, 4e, 4f). Især 100% af patienterne, som viser kombinationen DCBLD2

høj /NT5E

lav var i live efter 5 år efter diagnosen. I modsætning kun 30% af patienter, hvis tumorer udtrykker kombinationen DCBLD2

lav /NT5E

høj var i live. Denne overlevelse forskel var uafhængig af adjuverende kemoterapi eller stadium af sygdommen.

Angivelse af udvalgte biomarkører i CRC-cellelinjer

For at få yderligere indsigt i kandidatgener, vi vurderede deres protein udtryk profil i seks repræsentative humane CRC afledte cellelinier (figur S3B). AKAP12 protein blev påvist kun i HCT116 og DLD1 celler ifølge tidligere undersøgelser [14]. DCBLD2 blev udtrykt i meget lave niveauer i de fleste cellelinjer, mens NT5E blev højt udtrykt i HT29 og HCT116 sammenlignet med de andre cellelinjer. Endelig blev opdaget SPON1 i de fleste af de cellelinjer, med de højeste niveauer i DLD1.

Cross-talk mellem TNF-α og PPARy signalering regulerer NT5E og DCBLD2

i vivo Salg resultaterne antydede, at NT5E og DCBLD2 er involveret i tumorinvasion og metastase sandsynligt gennem et tumorinduceret immunosuppressive mekanisme. Således har vi fokuseret vores opmærksomhed på TNF-α, et cytokin, der regulerer et signalnet impliceret i inflammatoriske sygdomme og tumorigenese [15]. Ingenuity Pathway Analyse blev spurgt for at fremhæve effekten af ​​TNF-α og interagerende cytokiner. NFKB opstået som det vigtigste knudepunkt i netværket af opstrøms regulatorer af de valgte DEGS og til gengæld som et afgørende modulator af gener impliceret i inflammatoriske og immunrespons (fig S6A) [16]. Baseret på disse observationer, vi søgte efter cis-agerende regulatoriske DNA elementer i

NT5E

og

DCBLD2

initiativtagere (Figur S6B) og identificeret flere formodede NFKB websted-lignende elementer. For at kontrollere, om

NT5E

, og muligvis

DCBLD2

, kunne reguleres af den inflammatoriske kaskade, vi behandlede HEK 293T-celler med LPS, en kraftig pro-inflammatorisk NFKB inducer, og opnåede en betydelig tid -afhængige induktion af

NT5E

; Tilsvarende ektopisk ekspression af p65 /RelA NFKB subunit forårsagede en signifikant induktion yderligere styrket af LPS behandling. I modsætning hertil transfektion af den super suppressor kBa S32 /36 fuldt afskaffet LPS stimulerende virkning på

NT5E

(figur S6c og S6d). b. af tre uafhængige forsøg. b. en. b. c.