PLoS ONE: Co-Evolution of Somatic Variation i Primary og metastatisk colorectal cancer Kan Udvid Biopsi Indikationer i Molecular Era

Abstrakt

Introduktion

Metastase menes at være en klonal begivenhed, hvorved et enkelt celle initierer udviklingen af ​​en ny tumor på et fjernt sted. Men i hvilken grad primære og metastatiske tumorer varierer på molekylært niveau er stadig uklar. For yderligere at evaluere disse begreber, brugte vi næste generation sekventering (NGS) for at vurdere den molekylære sammensætning af parrede primære og metastatiske kolorektal cancer vævsprøver.

Metoder

468 kolorektale tumorer prøver fra en stor personlig medicin initiativ blev vurderet ved målrettet gen sekventering af 1.321 individuelle gener. Atten patienter produceret genomiske profiler til 17 parrede primær: metastatisk (og 2 metastaserende: metastatiske). Prøver

Resultater

Et gennemsnit på 33,3 mutationer /tumor var overensstemmende (delt) mellem matchede prøver, herunder fælles kendte gener (APC, KRAS, TP53). Et gennemsnit på 2,3 mutationer /tumor var uharmonisk (udelt) blandt parrede sites. KRAS mutationsstatus var altid samstemmende. Den samlede konkordans sats for mutationer var 93,5%; imidlertid næsten alle (18/19 (94,7%)) parrede tumorer viste mindst én mutations uoverensstemmelse. Mutationer blev set i:

TTN

, den største genet (5 uharmoniske par),

ADAMTS20

,

APC

,

MACF1

,

RASA1

,

TP53

, og

WNT2 Hotel (2 uharmoniske par),

SMAD2

,

SMAD3

,

Smad4

,

FBXW7

, og 66 andre (1 uharmonisk par).

konklusioner

de primære og metastatiske tumorer viste lidt varians samlet, co-evolution produceret trinvise mutationer i begge. Disse resultater antyder, at medens biopsi af den primære tumor alene vil sandsynligvis tilstrækkelig i kemoterapi-naive patient, kan yderligere biopsier af primær eller metastatisk sygdom være nødvendigt at netop skræddersy behandling efter kemoterapi resistens eller ufølsomhed for på tilstrækkelig højde for tumor evolution.

Henvisning: Kim R, Schell MJ, Teer JK, Greenawalt DM, Yang M, Yeatman TJ (2015) Co-Evolution of Somatic variation i Primary og metastatisk colorectal cancer Kan Udvid Biopsi Indikationer i Molecular Era. PLoS ONE 10 (5): e0126670. doi: 10,1371 /journal.pone.0126670

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: Oktober 27, 2014 Accepteret: April 6, 2015; Udgivet: May 14, 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er indenfor papiret og dets støtte Information filer

Finansiering:. undersøgelsen blev støttet af National Institutes of Health (NIH) nih.gov U01CA157960 (TJY). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Merck 80% tumor var til stede i prøven, der undergik sekvensanalyse (hvilket muliggør sensitiv mutation detektion). Normal væv, nekrotisk væv og overdreven stromale væv blev dissekeret væk fra enheden, på frosne sektion kontrol. DNA blev derefter ekstraheret fra 468 CRC prøver, efterfulgt af målrettet sekventering ved hjælp af en specialdesignet Agilent Sure Vælg Capture, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA. 1.321 cancer-associerede gener blev udvalgt af et fælles udvalg (Merck Co., Inc. Moffitt Cancer Center) for hybrid-opsamling og sekventering. Capture prober til de 1.321 gener var baseret på Agilent 50MB Sure Vælg capture (se tabel A i S1-fil til listen over gener).

sekventering og analyse

Variant data.

Et gennemsnit på 1,4 GB af målgenet sekventeringsdata (1.321 gener dækker 3,8 MB) blev genereret for hver tumor prøve ved anvendelse parret-end 90bp sekventering-by-syntese teknologi (GAIIx, Illumina, Inc., San Diego, CA) ved BGI (Shenzhen, Kina). Burrows-Wheeler aligner (BWA [12]) blev anvendt til at tilpasse sekvenser for menneskers henvisning hg19. Genome Analysis Toolkit (GATK [13]) blev anvendt til indsættelse /sletning udretning, kvalitet score rekalibrering, og variant identifikation. ANNOVAR [14] blev anvendt til at kommentere mutationer. Selvom matchede normale prøver ikke var tilgængelige for de 19 tumor-metastatisk individer, vi beriget for somatiske mutationer ved at fjerne varianter med en global mindre allel frekvens 1% i 1000 genomer projektet datasæt. Derudover blev data fra 523 normale vævs- eller blodprøver fra TCGA bryst datasæt downloades fra dbGAP og analyseret ved hjælp af den samme BWA /GATK rørledning som vores sekventerede prøver. I alt 21,179 ikke-tavse varianter, der blev identificeret i de normale væv blev også brugt til filtrering forudsagte germline varianter, yderligere berigende for somatiske mutationer. Filtrering med uovertruffen normale datasæt også reduceret antallet af analytiske artefakter (mutationer observeret hyppigt i en normal datasæt analyseres med de samme metoder, men ikke i 1000 genomer, vil sandsynligvis være artefakter). Mutation tællinger er baseret på filtrerede data. Mutationer i matchede prøver blev direkte sammenlignet for at identificere forskelle. Potentielle forskelle blev manuelt revideret med samtools tview og mpileup [15]. Mutationer, der syntes at være tilpasning artefakter baseret på manuel gennemgang overvejer streng ubalance, mange mutationer i samme læst, tilstedeværelse af klipning nær mutationen position, ikke-tilfældige placering af mutation i læser, lav kortlægning kvalitet, og bevis for læse i normal prøver (og ikke 1000 genomer) blev udelukket fra analysen. Dette trin diskvalificeret 12,3% af potentielle differentiale mutationer, og 26% af disse var i

MUC4

, et gen mistænkes for at havnen artefakt varianter [16, 17]. Prøverne blev betragtet anderledes i en position, hvis mutationen var til stede i en prøve (generelt 10%, vores empirisk allel frekvens følsomhed givet ~ 140x gennemsnitlig dybde på dækning fra dette og andre projekter fra samme forælder datasæt på ~ 4.000 prøver) og fraværende eller sjældent ses i den anden. For at undgå falske forskelle som følge af differential mutation bestemmelser blev linjeføringer ved mutation positioner manuelt revideret: Denne manuel gennemgang også tilladt os at identificere falske-forskelle; det er, når allel frekvenser på en position var ens, eller en mutation blev pålideligt observeret i “reference” prøve (på trods af et differentieret bestemmelse), vi omklassificeret disse at være overensstemmende mutationer.

Resultater

Kliniske data

fra 2008 til 2010, vi indsamlede 488 CRC prøver relateret til 468 sekventeret patienter for at vurdere den genomiske profil CRC fra primær eller metastatisk væv. Ud af disse prøver, 18 patienter havde tilgængelige genomiske profiler fra mere end en vævsprøve (dvs. parret primær: metastatiske prøver). Femten patienter havde både primære og metastatiske /lokale regionale lymfeknude prøver, to havde separat metastatiske prøver, og en patient havde to primærfarver og to metastatiske vævsprøver rådighed. Derfor i alt 19 parrede prøver var tilgængelige. Kliniske kendetegn er beskrevet i tabel 1. Parret prøver oprindeligt præsenteret med synkrone læsioner i 16 tilfælde (84%), mens tre par involveret metachronous metastatisk sygdom. Distant metastatiske steder inkluderet leveren (N = 8), lymfeknuder (N = 7), lunge (N = 3), og ovarie (N = 1).

Mutationsanalyse profilering og MSI test

En median på 16.209.684 læsninger blev genereret for hver prøve, med 15.785.209 justering til referencen humane genom, og 5.390.906 justering inden 25 bp af målregionerne. Median dækninger ved målrettede baser var: 94,3% = 10x; 90,7% = 20x, og 79,6% = 50x. Medianen af ​​gennemsnitlig dybde på dækning på tværs målrettede baser var 146.7x (se tabel B i S1-fil for detaljer om sample_seq_metrics).

I profilerer mutationsstatus af patienterne, vi specifikt fokuseret på kendte gener sådanne som

APC

,

KRAS

,

TP53

,

BRAF

PIK3CA

. MSI status blev også bedømt som godt ved genetisk analyse af mikrosatellitter i alle tilfælde. En

APC

mutation blev set i 16 ud af 18 patienter og TP53 mutationer blev set hos 12 patienter.

KRAS

mutationer blev fundet i 9 patienter og placeret ved codon 12, 13, eller 61.

påvistes PIK3CA

mutationer i tre patienter. Især ingen af ​​patienterne havde en

BRAF (V600E)

mutation. En patient var MSI-H, 4 patienter var MSI-L, men kun i en af ​​de væv, mens de resterende 13 patienter var MSS.

Overensstemmelse af mutationer i matchede par af primære carcinomer og afledte metastaser

Vi undersøgte mutations overensstemmelsen mellem et kohorte af 19 par af tumorer (figur 2, tabel 2, eksakte positioner, dybder, og allelfrekvenserne er beskrevet i tabel C i S1 File). Fra de 38 tumorer blev 1.352 formodede somatiske ændringer identificeret blandt blandt 1.321 gener. Af disse 1.264 ændringer forekom i begge prøver (gennemsnit = 33,3 /prøve), 35 forekom kun blandt de 17 delprøver (middelværdi = 2,1), og 53 forekom kun i de 21 metastatiske prøver (gennemsnit = 2,5). Især optællingerne var bemærkelsesværdigt ens for den primære: lymfeknude og primær: fjernmetastaser par (betyde delte ændringer = 36,7 og 31,2). Således er den samlede konkordans sats for mutationer var 93,5%. Men næsten alle (18/19 (94,7%)) parrede tumorer viste mindst én mutations uoverensstemmelse.

Langt de fleste mutationer deles. Par A til F repræsenterer regionale lymfeknudemetastaser og par G gennem R repræsenterer fjernmetastaser.

mutations forskelle observeret i prøvepar er anført i tabel 3.

TP53 (R196X)

ændring blev set i 10 af de øvrige 450 patienter, som ikke har parrede prøver; vi henvise til sådanne mutationer som

tilbagevendende

. Andre differentierede mutationer, der var tilbagevendende i vores større kohorte var

APC (R223X)

i 7 patienter,

APC (E1268X)

i 3 patienter,

TP53 (E294fs) Hotel ( Bemærk: andre forandringer var E294X) i 2 patienter, og

JAK1 (802_803del)

og

HSP90AB1 (549_550del)

forekommer i en anden patient

Syv gener. havde to eller flere uharmoniske ændringer (tabel 4). De præsenteres i faldende rækkefølge efter deres disharmoniske mutationsrater, hvilket er antallet af mutationer pr nukleotid basis pr vævsprøve. Seks af dem har præcis 2 uharmoniske ændringer, så mutationen sats i mindre gener er højere. Fem udelte ændringer blev set i

TTN

; dog givet sin størrelse, den udelt mutation sats var lavest blandt de syv gener. Der bør lægges særlig vægt på

TP53

APC

mutationer, som de er kendt for at være chauffør mutationer i tyktarmskræft. Udover den

APC

gen, som forekommer i over to tredjedele af kolorektal cancer,

WNT2

MACF1

også påvirke Wnt-vejen, mens

RASA1

er i ras-banen. Gener af særlig interesse med et enkelt udelt mutation omfatter

SMAD2

,

SMAD3

,

Smad4

, og

FBXW7

; derudover tre PTP’er (

PTPN13

,

PTPRC

,

PTPRD

) var uharmonisk.

En række af de gener identificeret som uharmonisk har vist sig at være muteret i TCGA CRC datasæt ved frekvenser 10% (f.eks

Smad4

,

ZNF831

,

ZNF217

,

HSP90AB1

,

TP53

,

SYNE1

,

SMAD2

,

TTN

,

MACF1

,

PREX1

,

FBXW7

,

CSMD3

).

diskussion

Metastase menes at være stort set en klonal proces, hvorved cellen oprindelse for metastatisk læsion er afledt af den primære læsion, kraftigt antyder de to bør være tæt forbundet [3], men i tvist er netop, hvordan forskellige primære og metastatiske læsioner er i forhold til deres mutationer, udtrykt gener og proteiner. Også ukendte er den relative heterogenitet af den primære tumor. For eksempel er tumoren i vid udstrækning består af celler med høj metastatisk potentiale og kun få flugt på grund af en stokastisk begivenhed, der medfører metastase, eller er det sådan, at kun nogle få celler i den primære tumor har fået metastatisk potentiale og opholde sig i nogle ukendt geografisk placering inden for den primære læsion? Den tidligere koncept ville støtte den opfattelse, at biopsi af den primære læsion er tilstrækkelig til at forudsige metastatisk potentiale samt potentielle lægemiddelkandidater mål, mens sidstnævnte biologi ville resultere i biopsi stikprøvefejl fører til uhensigtsmæssige kliniske konklusioner. Det tidligere begreb kan også føre til den lejlighedsvise mønster af diffust og dødbringende shotgun metastase vs den sædvanlige oligometastatic mønster ses. En anden helt anden mulighed er, at ingen nye mutationsbegivenheder er nødvendige for metastase, men det er snarere en fysiologisk begivenhed udløses af stromale spor. Denne teori er indeholdt i begrebet epitelial til mesenkymale overgang, hvor en plastik forbigående mesenkymale tilstand er nødvendig for en tumor celle til at invadere og rejse til fjerne metastatiske steder, hvor en vending af processen (MET) resulterer i en re-kapitulation af primær tumor biologi. Der er

in vivo

og

in vitro

modeller af metastaser viser variabel genekspression mellem primære læsioner og deres beslægtede metastatiske læsioner uden væsentlige genomiske forandringer støtter denne teori. For eksempel har klassiske studier vist højt metastatisk potentiale kan erhverves via seriel “fænotypiske” selektion eller endda sortering af celler fra en original dårligt metastatisk klon. Hvis dette er tilfældet, kan genetik i det primære og metastatisk tumor være næsten identisk, tillader biopsi af enten læsion.

NGS studier er for nylig blevet iværksat for at kaste lys over nogle af disse spørgsmål. Nylige undersøgelser under anvendelse NGS af andre maligniteter såsom bryst- og renalcellecarcinom har støttet den hypotese, at der er betydelige genetiske forskelle mellem de primære læsioner sammenlignet med metastatiske steder, der kan tillade en evolutionær sporing af udvikling [18, 19]. Interessant, en nylig undersøgelse i tyktarmskræft viste, at bemærkelsesværdigt kun halvdelen af ​​metastatiske CRC læsioner testede havde samme klonoprindelse med deres primære tumor, mens resten af ​​tilfældene var genetisk forskellige [6]. Den slags undersøgelser kunne antyde, at hver metastatisk læsion skal biopsi for fuldt ud forstå kompleksiteten af ​​sygdommen. Andre undersøgelser har imidlertid foreslår at metastaser kan være mere som deres primære læsioner end ikke [20, 21]. Til støtte for dette begreb, der er en nyere kolorektal undersøgelse, der viser en høj overensstemmelse mellem almindeligt muterede gener såsom

KRAS

,

NTM

,

BRAF

,

PIK3CA

, og

TP53

mellem primære og metastatiske steder [22]. Dette er også meget lig den senest offentliggjorte undersøgelse i lungekræft, hvor 15 parret ikke-småcellet lungekræft blev evalueret [23].

For at løse disse vigtige kontroversielle emner, vi undersøgte et nyt sæt parrede primær og metastatiske CRC læsioner ved hjælp af en målrettet gen-analyse af en robust sæt af 1.321 cancer forbundet gener med en ~ 100X sekventering dybdegående dækning. Vores data foreslog en meget høj konkordans af detekterede mutationshændelser mellem primære og metastatiske par, uanset om stammer fra locoregional lymfeknuder eller fjerntliggende metastatiske steder. Vores data synes at modsige en nylig CRC forsøg med hele exome sekventering viser store forskelle mellem læsioner, som kan forklares af uafhængige primære hændelser (Fig 1B), eller også kan prøveudtagning fejl eller støj sekundært til lav dækning hel exome sekventering hvor lav frekvens begivenheder registreres [6]. Vores data i tyktarmskræft viste, at hovedparten af ​​mutationer identificeret, blev delt mellem en primær tumor og dets beslægtede parret metastatisk læsion, herunder

KRAS

,

APC

, og

PIK3CA

som almindeligvis testes mutationer i vores patienter.

trods den høje konkordans rate observerede vi samlet, næsten alle (18/19 (95%)) parrede tumorer viste mindst én mutations uoverensstemmelse. Bekymringen for klinikeren bliver så, om denne uoverensstemmelse er klinisk signifikant og værdig til en ny biopsi. Er det ansvarligt for den metastatiske adfærd? Er det en ny terapi mål, eller en mulig ny mode for resistens over for terapi? Eller er det bare repræsenterer utilstrækkelig prøvetagning af en tumor, som i sagens natur er heterogen? Vores syv formere-disharmoniske mutationer omfattede to tilfælde hver af

APC

og

TP53

, sandsynlige potentielle førere af tumor progression og metastatisk potentiale. Derudover tre Wnt vejen (

APC

,

MACF1

,

WNT2

) og en Ras-vejen (

RASA1

) gener er blandt de syv. Disse resultater tyder også dødelige metastatiske celler kan opstå som følge af yderligere nye mutationsvarianter. Identificere karakteristika primære kræft, der kan give anledning til dødelige metastatiske cellekloner er af stor interesse. I vores undersøgelse,

TTN

TP53

mutationer blev fundet i både den primære og metastatisk websted, men hver med nye ændringer, der støtter teorien om gevinsten af ​​funktionen dødbringende metastatisk celle klon.

TP53

er en mutation, som er blevet omfattende undersøgt i tyktarmskræft [24]. Det er blevet rapporteret, at en øget forekomst af

TP53

mutationer er associeret med sekundære læsioner af kolorektale tumorer, hvilket antyder, at mutationer i dette gen kan spille en vigtig rolle i etableringen af ​​kolorektale levermetastaser [25]. For eksempel p53, proteinproduktet af

TP53

, er blevet rapporteret at inhibere Warburg effekten og fremme mitokondriel oxidativ metabolisme, et anti-metastase mekanisme, og dermed inaktivering af denne tumorsuppressorfunktion bidrager til processen for metastase [26]. I vores undersøgelse, 13/19 (68%) par havde

TP53

mutationer, en høj hastighed, som ligner andre undersøgelser [27]. Interessant nok i vores undersøgelse, en patient havde en afvigende

TP53

mutation i den metastatiske site, mens en anden havde en i den primære tumor. De uharmoniske mutationer fra de parrede prøver er informative med hensyn til udviklingen af ​​tumoren. Disse resultater tyder på, at

TP53

mutationer er ofte en sen kræftfremkaldende begivenhed, i overensstemmelse med en evolutionær model fremsat af Vogelstein et al [28].

Yderligere interessante mutationer findes i metastatiske steder var medlemmer af den proteintyrosinphosphatase (PTP) familie. Der var 3 nye mutationer set i metastatiske læsioner. Disse PTP’er er blevet beskrevet som enten tumorsuppressorer eller som kandidat oncoproteiner [29]. Ændringer i disse gener kan resultere i ændringer i ligevægt kinase phosphatase aktivitet, der kan have skadelige virkninger, som i sidste ende kan føre til kræft progression.

Vores undersøgelse især identificeret gevinst på nye mutationer i både det primære i forhold til dens beslægtet metastatisk parret læsion samt nye mutationer i de metastatiske læsioner i forhold til primærvalgene. Denne observation kan forklares med co-evolution af både de primære og metastatiske læsioner over tid (figur 1C). Det er også muligt, at disse uharmoniske mutationer repræsenterer forskellige populationer af en heterogen primær tumor.

Der er adskillige begrænsninger for vores undersøgelse. Vores lille størrelse kohorte omfattede en heterogen population, med både synkrone og metachronous tumorer. Disse grupper kan være i sagens natur anderledes genomisk. For eksempel kan nye mutationer set i den metastatiske steder være resultatet af den metastatiske proces eller på grund af selektion af resistente kloner induceret af tidligere systemisk behandling såsom neoadjuvansterapi før leverresektion. Desværre har vi ikke kliniske kemoterapi data for patienter, som udviklede metachronous sygdom. Derfor er det uklart, hvilken virkning, hvis nogen, vil kemoterapi eller målrettede behandlinger har på fremkomsten af ​​nye mutationer i metastatiske steder. Også intratumoral heterogenitet, mens sandsynligt ikke så høj i CRC læsioner som i geografisk adskilte renale celle knuder afledt fra den samme primære tumor [28], kan være forstyrrende element, som kunne forklare nogle af genetisk divergens samt. Vores undersøgelse udnyttet kirurgisk resektion prøver dermed giver os mulighed for at fange en stor del af hver tumor og effektivt at vurdere dens heterogenitet ved at observere lavfrekvente, sub-klonede varianter.

Konklusioner

Vores undersøgelse viste en høj niveau af konkordans for potentielle somatiske ændringer, hvilket antyder, at genomiske profil primære sted er meget lig den af ​​den metastatiske site for størstedelen af ​​interrogerede cancer gener. Således kan biopsi af den primære tumor være tilstrækkelig i kemo-naive patienter. Men vi mener også, at der er tilfælde, hvor nye biopsier sandsynligvis er nødvendige for nøjagtigt at vurdere mutations landskab af en tumor og design passende behandling, for eksempel i CRC patienter, som fremskridt efter en bestemt terapi (dvs. anti EGFR terapi). I denne situation er det muligt, at en resistent subklon er opstået under selektivt pres af det målrettede terapi. Der er også tilfælde, hvor respons kun vil blive set i den primære tumor og ikke i den metastatiske site. I dette scenario er det muligt, at nye mutationer har fundet sted i den metastatiske stedet fører til modstand. Disse data vil begrunde behovet for en ny biopsi af metastatisk stedet for bedre at forstå den erhvervede resistens eller nye handlingsrettede mutationer, så patienterne kunne tilbydes personlig behandling. Derfor kan det være vigtigt, at fremtidige undersøgelser giver mulighed for nye biopsier af metastatiske steder til bedre at forstå metastaser og erhvervet resistens.

Støtte Information

S1 fil. Kombineret fil af understøttende borde

tabel A. Listen over 1321 gener for målrettet sekventering.; Tabel B. prøve sekventering målinger; Tabel C. Mutationen sekventering metrikker

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126670.s001

(DOCX)

Tak

I alt Cancer Care er aktiveret, delvist, af den generøse støtte fra DeBartolo familie, og vi takker de mange patienter, der så nådigt leveres data og væv til alt Cancer Care Consortium. Vores undersøgelse modtog også værdifuld hjælp for Biostatistik og Bioinformatik Core Faciliteter på H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, en NCI udpeget Comprehensive Cancer Center, støttes under NIH tilskud P30-CA76292.