PLoS ONE: Hæmning af nicotinacetylcholinreceptorer af Cobra Venom α-Neurotoksiner: Er der en Perspektiv i Lung Cancer Treatment

Abstrakt

Nikotin udøver sine onkogene virkninger gennem binding til nicotinacetylcholinreceptorer (nAChRs? ) og aktiveringen af ​​downstream pathways, der blokerer apoptose og fremme neo-angiogenese. De nAChR’er af α7 subtype er til stede på en lang række forskellige cancerceller og deres inhibering med kobragift neurotoksiner er blevet foreslået i flere artikler og anmeldelser som en potentiel innovativ lungekræft terapi. da en del af de offentliggjorte resultater blev for nylig tilbagetrukket, Men vi mener, at den antitumoraktivitet af cobra gift nervegifte skal uafhængigt revurderes.

Vi bestemmes aktiviteten af ​​a-nervegifte fra

Naja atra Hotel (kortkædede nervegift, α-cobrotoxin) og

Naja kaouthia

(langkædede nervegift, α-cobratoxin)

in vitro

af cytotoksicitet målinger i 5 lunge cancer cellelinjer, ved kolonidannelse assay med α7nAChRs udtrykke og ikke-udtrykkende cellelinjer og

in vivo

ved at vurdere tumorvækst i en ortotopisk ikke-overvægtige Diabetic /svær kombineret immundefekt (

NOD /SCID

) musemodel der anvender forskellige behandlingsskemaer og doser.

blev ikke observeret nogen statistisk signifikant reduktion i tumorvækst i de behandlingsarme i sammenligning med kontrollen for begge toksiner. Paradoksalt α-cobrotoxin fra

Naja atra

viste tendensen til at øge tumorvækst selv, selv i dette tilfælde, blev den statistiske signifikans ikke nået.

Som konklusion vores resultater viser, at i modsætning til andre rapporter nAChR hæmmere α-cobratoxin fra

N. kaouthia

og α-cobrotoxin fra

N. atra

hverken undertrykt tumorvækst eller forlængede overlevelsen af ​​de behandlede dyr

Henvisning:. Alama A, Bruzzo C, Cavalieri Z, Forlani A, Utkin Y, Casciano I, et al. (2011) Hæmning af nicotinacetylcholinreceptorer af Cobra Venom α-Neurotoksiner: Er der en Perspektiv i Lung Cancer Treatment? PLoS ONE 6 (6): e20695. doi: 10,1371 /journal.pone.0020695

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: December 10, 2010; Accepteret: 7 maj 2011; Udgivet: 13 juni 2011

Copyright: © 2011 Alama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var fra den italienske sundhedsministerium (www.salute.gov.it/) og Fondazione Compagnia di San Paolo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de eksperimentelle beviser tyder på, at stimulerende eller hæmmende neurotransmission er involveret i kræft udvikling, progression og i respons på behandling har støt akkumuleret [1]. Faktisk tobakskomponenter regulere cellulære funktioner relateret til celletransformation og er involveret med rygning afhængighed og lungekræft disposition og udvikling ved direkte at interagere med neuronale og ikke-neuronale nicotin-acetylcholin receptorer (nAChRs) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Nikotin selv har begrænset lungekræft initierende kapaciteter, men kan opretholde tumorvækst og fremme metastatisk spredning gennem sine antiapoptotiske og neoangiogenic egenskaber [2], [7], [12].

udtryk for nAChR’er i ikke-neurale celler i lungerne, og især i luftvejsepitelet, afspejler de mange væsentlige funktioner, der udøves af det cholinerge system i normal lunge udvikling og funktion [13], [14]. I denne henseende er det blevet foreslået, at den rolle nAChRs i lungekræft kunne svare til den for østrogenreceptorer i brystkræft eftersom der i begge tilfælde den uhensigtsmæssige stimulering af receptorerne bidrager til udviklingen af ​​kræft [15]. I betragtning af det høje niveau af ekspression af visse undertyper af nAChRs i lungecancerceller forhold til de omgivende upåvirket væv [16], [17] og af fornøden eksperimentelle beviser [18], [19], [20], [21] blev det en hypotese, at antagonister af nAChRs, særlig cobra a-nervegifte, kunne udnyttes som potentielle terapeutiske midler [22], [23], [24]. Men den begrænsede viden om funktionaliteten og de langsigtede virkninger af stimulering af disse receptorer i cancerceller [2], [25], [26] og, vigtigst af alt, den nylige tilbagetrækning af en rapport, der understøtter antitumorale virkninger af cobra α-nervegifte

in vitro

in vivo

[27] gør tvivlsom målretning af nAChR’er med disse toksiner til lungekræft behandling.

Cobra gift udgøres af mange polypeptider med flere toksiske aktiviteter. Blandt disse, de tre-fingered toksiner (TFT’er) er de vigtigste komponenter og er repræsenteret ved a-nervegifte og cytotoksiner. A-neurotoksiner bindes til nAChR med forskellig specificitet og affinitet: kortkædede toksiner (60-62 aminosyrerester, 4 disulfidbroer) blok muskeltypen nAChRs henviser langkædede toksiner (66-75 aminosyrerester, 5 disulfidbindinger den femte binding er til stede i den centrale polypeptid loop) foruden muskeltypen nAChR’er blokere også de neuronale receptorer [28], [29]. Som et eksempel på kortkædede toksiner, α-neurotoksin kaldet α-COBr * o * toksin fra

Naja atra

kobragift kan nævnes. Den væsentligste α-neurotoksin fra

Naja kaouthia

kobragift kaldet α-COBr * a * toksin er et eksempel på langkædede toksiner. De kortkædede toksiner er strukturelt relateret til cytotoksiner, at ikke-selektivt dræber cellerne [30].

Under gennemgangen af ​​litteraturen om anti-tumor effekt af α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27] vi indså, at de forskellige rapporter præsenterede store forskelle på doseringen af ​​toksinet anvendes til de

in vivo

eksperimenter, om antallet af injicerede celler og på mus overlevelse. Også tilstedeværelsen af ​​α7 nAChR på cellelinjen anvendt til in vivo undersøgelserne var usikker, da modstridende resultater findes i litteraturen [22], [31]. Da en del af de data, blev trukket tilbage med nogen specifik motivation [27], følte vi nødvendigt at revurdere de anti-cancer egenskaber cobra nervegifte

in vitro

in vivo

i en klinisk relevant dyremodel for lungekræft [18] for at afklare, om disse toksiner kunne anses prototypen på en ny klasse af naturlige produkter med antitumor egenskaber som foreslået [15], [22], [24].

Resultater og diskussion

Angivelse af α7 nAChR i A549 og A549-luc celler

samspillet mellem α-cobratoxin og α7 nikotinreceptor [32] var en af ​​de eksperimentelle beviser bag rationale udnytte kobragift toksiner som anticancermidler [22]. Selv om denne receptor udtrykkes på et bredt spektrum af væv og cellelinier, en nylig undersøgelse af litteraturen [22], [31] rapporterede modstridende data om ekspression af denne receptor i A549 cellelinien anvendes til

i vivo

og det meste af

in vitro

anticancer assays på α-cobratoxin. Derfor, som et første skridt til at kontrollere aktiviteten af ​​α-cobratoxin i NSCLC, vi udførte en semikvantitativ RT-PCR og qPCR undersøgelse for at påvise ekspressionen af ​​α7 nAChR i 5 lunge cancer cellelinjer. Tre af cellelinierne anvendt i den foreliggende undersøgelse (A549, H1650 og SK-MES 1) var de samme i det oprindelige sæt af eksperimenter [18], [19], [20], [27]. Som vist i figur 1, felt A, den α7 nikotinreceptor var let påviselig i A549, H1650 og SK-MES 1, men ikke i H1975 og CALU 1. qPCR analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​forskellige mængder af α7 nAChR mRNA i A549, H1650 og SK-MES 1 (figur 1, felt B). Efter aftale med RT-PCR resultater, H1975 og CALU 1 den α7 nAChR udskrift, ved hjælp af den samme mængde cDNA bruges til alle cellelinjer, dukkede efter cyklus 40, et resultat, der kan tilskrives enten til et ekstremt lavt niveau af udtryk eller baggrundsstøj

A) Semikvantitativ alfa7 RT-PCR-analyse på menneskelige NSCLC adenocarcinom e pladecellekræft cellelinjer. GAPDH udtryk blev anvendt som intern kontrol for mRNA integritet og cDNA kvantificering. NCI-H1975 og Calu1 er negative. C: Ingen template kontrol. B) qPCR alpha 7-ekspression i de samme cellelinjer. På y-aksen naturlige logaritm (ln) af fold forandring. NCI-H1650 blev anvendt som kalibrator, GAPDH som reference gen. En UGR af Total RNA blev retrotrascibed og den samme mængde cDNA per prøve (2 ul) blev anvendt (Ct GAPDH på mellem 15,65 og 17,65). NCI-H1975 og Calu1 resulterede negativ eller med ekstremt lav udtryk grundet Ct 40. C) Western blot-analyse for alfa 7. PC12 blev fyldt som positiv kontrol. Actin-ekspression blev anvendt som intern kontrol.

Ekspressionen af ​​α7 nAChR på proteinniveau blev bekræftet ved Western blot-analyse i A549 og A549-luc celler (figur 1, panel C).

det er blevet beskrevet, at stimulering af α7 nAChR i humane lungecancer-celler resulterer i opregulering af denne receptor [33]. Vi har testet påvirkningen af ​​a-nervegifte fra

N. atra

N.kaouthia

på niveauet af α7 nAChR fokus på A549 og A549-luc.

qPCR-analyse viste, at behandling med enten α-cobrotoxin eller α-cobratoxin ved koncentration på 0,003 pM, den rapporterede IC

50 for α-cobratoxin i A549 [20], sammen med koncentrationer tre gange lavere (0,001 um) og tre gange højere (0,009 uM), ikke væsentligt ændre niveauet for udtryk af receptoren i disse cellelinjer (mindre end dobbelt forandring, figur S1).

In vitro effekter af kort- og langkædede a-nervegifte på NSCLC cellelinjer

Tidlig

in vitro Salg forsøg antydede, at virkningen af ​​α-cobratoxin er dosisafhængig, og at den høje selektivitet og specificitet af dette molekyle afhænger af tætheden af ​​α7 nAChR [20], [21]. I denne henseende ikke-tumorale pulmonale celler samt andre primære upåvirkede celler, der udtrykker lave niveauer af a7-receptorer var bemærkelsesværdigt modstandsdygtigt over for a-cobratoxin behandling [20].

At evaluere den cytotoksiske aktivitet af α-cobratoxin, at effektivt binder sig til α7 nAChR (se materialer og metoder) og specificitet og selektivitet for søgsmålet, vi udførte MTT assays med kort- og langkædede a-nervegifte på formentlig følsomme α7 nAChR-positive og formentlig resistente α7 nAChR-negative cellelinier. Dosis-respons-kurver blev tegnet for at vurdere lægemiddelkoncentrationen reducere overlevelse. De indledende cytotoksiske eksperimenter blev udført under anvendelse af toksiner koncentrationer, der i andre publikationer blev rapporteret at være effektive til a7 nAChR-positive NSCLC cellelinier, men ikke toksiske i normale celler (IC50: 0,003 pM til A549, 0,04 uM for SK-MES 1 og 1 iM for H1650) [18], [20], [21], [22]. Men ved disse koncentrationer vi ikke kunne detektere mærkbar cytotoksisk aktivitet og IC50 kunne ikke nås med nogen af ​​de to toksiner (data ikke vist).

Ved højere koncentrationer (op til 30 uM) i α-cobrotoxin viste en begrænset dosisafhængig toksicitet ikke som forblev i det væsentlige konstant i en lang række koncentrationer i alle 5 cellelinjer (figur 2, panel a).

NSCLC cellelinier A549, NCI-H1975, H1650, CALU 1 og SK-MES 1 blev inkuberet i 72 timer med α-cobrotoxin (0,6-30 uM), øvre panel, eller α-cobratoxin (0,75-50 uM), nedre panel, og toksiciteten blev målt med det kolorimetriske MTT-test. IC50 blev kun nået med α-cobratoxin.

Ved høje koncentrationer viste α-cobratoxin en klar dosisafhængig toksicitet (Figur 2, panel B). Men IC50 koncentrationen observeret i vores undersøgelse for A549 og SK-MES 1 var 2466 og 105 gange højere end rapporteret i en tidligere publikation [20]. Forskellen var meget lavere for H1650 (2,9 gange) et resultat forenelig med anvendelsen af ​​en anden toksin præparat.

Den begrænsede toksisk virkning af den kortkædede α-cobrotoxin kunne forklares ved den manglende evne til at binde til α7 receptor. Overraskende imidlertid α-cobratoxin var også effektivt på a7 nAChR-negative celler antyder, at den toksiske aktivitet ikke medieres ved binding af toksinet til α7 receptoren.

For at bekræfte og udvide denne observation har vi udført en kolonidannelse assayet med α7 nAChR + A549 og med a7 nAChR-NCI-H1975 cellelinier. Da IC50 ikke blev nået med α-cobrotoxin, vi udnyttet de to højeste koncentrationer testet af MTT (15 og 30 uM). For α-cobratoxin udnyttede vi de koncentrationer, der svarer til IC50 for A549 og NCI-H1975 (7. 5 og 3 uM) og koncentrationer svarende til halvdelen og det dobbelte af IC50. Som vist i figur 3 blev klonogene aktivitet af de to cellelinier ikke påvirket af behandlingen og ved tilstedeværelsen af ​​α7 nach receptoren.

cellelinier A549 (α7 AChR +) og NCI-H1975 ( α7 AChR -) blev udpladet i 35 mm petriskåle eller i 24 brønde plader ved densiteter på 150 (A549) og 300 (NCI-H1975) celler /skål og udsat for enten langkædede α-neurotoksin fra

Naja kaouthia

, ved koncentrationer på 15 uM, 7,5 pM, 3,8 pM (A549) og 6 uM, 3 pM, 1,5 pM (NCI-H1975), eller kortkædede fra

Naja Atra

, ved koncentrationer på 30 uM og 15 uM (begge cellelinier). Behandlede celler blev derefter inkuberet i 7-10 dage, indtil synlige kolonier dannet.

Aktiveringen af ​​den apoptotiske kaskade blev betragtet som den afgørende virkning af bindingen af ​​den α-cobratoxin til α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. I betragtning af de store forskelle mellem vore resultater og de tidligere publicerede vedrørende doseringen ved som kunne opnås IC50 og fraværet af selektive virkning α-cobratoxin på a7 nAChR-positive celler, forsøgte vi at forstå, hvis aktivering af apoptose faktisk forekommer ved behandling med α-cobratoxin af Annexin V-PI flowcytometri farvning. Det blev rapporteret, at den maksimale induktion af apoptose i A549-celler kan opnås ved behandling med 1 uM toksin i 24 timer [18]. Vi har gentaget samme eksperiment under anvendelse af samme metode, men med toksin koncentrationer (1, 10 og 50 uM), der inducerede vækst inibition området fra 5 til 87% i MTT-assays.

Som vist i figur 4, selv ved den højeste koncentration meget få celler (1-3%) præsenterede beviser på apoptose med nekrotiske celler er fremherskende.

celler blev inkuberet i 24 timer med 1, 10 og 50 uM α-cobratoxin og apoptose blev vurderet ved Annexin V-PI-farvning og FACS adskillelse. Apoptose i ubehandlede celler var 0,63%, og i behandlede celler var i området fra 0,98 til 2,32%.

Samlet tyder disse resultater, at celledød observeret in vitro er sandsynligvis et resultat af nekrose snarere end aktivering af den apoptotiske vej efter den specifikke binding af α-cobratoxin til sin ligand.

In vivo

toksicitet af a-neurotoksiner Salg

den akutte toksicitet af stigende doser af toksiner efter iv administration (som i M M) blev vurderet i CD1 mus på grundlag af kliniske og adfærdsmæssige tegn. Akutte symptomer udviklet inden for 15 minutter efter injektion og var for det meste præget af generel ubehag og åndedrætsbesvær, som gendannes til de normale betingelser inden for 60-180 minutter. Baseret på antallet af døde CD1 mus efter indgivelse af enten α-cobrotoxin eller α-cobratoxin og over en observationsperiode på 14 dage blev LD værdier bestemmes og MTD blev identificeret som 0,1 mg /kg for α-cobrotoxin og 0,2 mg /kg for α-cobratoxin som vist i tabel 1.

vigtigere, LD50 for α-cobrotoxin bestemt i vores undersøgelse (0,128 mg /kg) var i meget god overensstemmelse med data fra litteraturen (0,1 mg /kg: https://www.uniprot.org/uniprot/P60770). Den observerede LD50 for α-cobratoxin var 0,35 mg /kg, en værdi i samme størrelsesorden af ​​litteratur (0,1 mg /kg; https://www.uniprot.org/uniprot/P01391).

rapporterne om in vivo toksicitet α-cobratoxin er forvirrende og i nyere litteratur, vi har observeret, at LD50 koncentrationen rapporteret i tre forskellige publikationer fra den samme gruppe adskiller på 1000 fold (0,15 mg /kg eller 0,15 ug /kg ) [18], [21], [22]. De opnåede i nærværende undersøgelse resultater er væsentlige i overensstemmelse med de af to af de tidligere rapporter [18], [21] og, vigtigst, demonstrere den biologiske aktivitet

in vivo

af vores toksin præparater.

Halvdelen af ​​MTD for hvert toksin (0,05 og 0,1 mg /kg) blev derefter anvendt i en af ​​de to behandlingsprotokoller formål at vurdere antitumoraktiviteten in vivo af disse toksiner.

antitumoraktivitet af a-nervegifte

for at vurdere antitumoraktiviteten af ​​begge toksiner,

NOD /SCID

mus blev orthotopisk transplanteret med 0,5 × 10

6 humane A549-luc celler /i et volumen på 10 pi PBS i den højre lunge. Som surrogatmarkør for tumorvækst målte vi lysemissionen af ​​luciferase-mærkede A549-celler; dette system muligt for os at langs følge hvert enkelt dyr og til at overvåge effekten af ​​behandlingen.

Efter vurderingen af ​​tumor implantater ved IVIS afsløring, musene blev randomiseret til en af ​​studiegrupper og behandling i gang 7 dage efter orthotopisk transplantation efter de to forskellige protokoller, der er skitseret i figur 5.

Mus blev injiceret med 0,5 x 10

6 humane A549-luc celler. På dag 7, efter IVIS bestemmelsen blev dyrene randomiseret og underkastet behandling. For tidsplan 1 blev musene behandlet med 1/1000 af LD10 som angivet i [20] tre gange /uge i tre uger. For tidsplan 2 musene blev behandlet en gang om ugen med en dosis, der svarer til ½ MTD (bestemt i nærværende undersøgelse)

Protokol 1:. 8 dyr blev tildelt til at modtage intravenøs 0,12 ug /kg af toksin (1/1000 af LD

10 angivet i [20]), tre gange om ugen i tre uger efter en tidligere rapporteret tidsplan [20] og 8 dyr modtog vehikel alene.

protokol 2: 8 dyr blev behandlet iv en gang om ugen i tre uger med på 0,05 mg /kg af α-cobrotoxin eller 0,1 mg /kg af α-cobratoxin (svarende til halvdelen-MTD). For α-cobratoxin den halve MTD svarer til 12,8 uM, en koncentration,

in vitro

skulle dræbe mellem 50 og 63% af A549 celler. Otte kontroldyr modtog køretøj alene.

I en anden publikation [18], hvor tidsplan af protokol 1 blev udnyttet, den rapporterede α-cobratoxin dosis var 0,12 mg /kg. På baggrund af vores

in vivo

toksicitet bestemmelse anses vi denne dosis er for høj til at blive administreret i tre på hinanden følgende dage til mus med kompromitteret respiratoriske funktion.

Efter en indledende vurdering af tumorvækst på dag 7, blev antitumoraktivitet induceret af toksiner evalueret i behandlede og ubehandlede mus, på dagene 14, 21 og 28 efter administration i begge protokoller. Vi har observeret, at ved de indledende stadier af vækst, bioluminiscence af dyrene nøje repræsenteret omfanget af tumorvækst. Omvendt på senere tidspunkter, tumor nekrose og reduceret perfusion, sandsynligvis mindsket lys emission i mus, selv når tumoren helt havde invaderet brysthulen og i de fleste tilfælde, havde forlænget uden brystkassen.

præ- behandling IVIS evaluering af de 56 mus inkluderet i undersøgelsen på dag 7 udviste vellykket tumorvækst i alle dyr på trods af en 300-fold individuel variation (gennemsnitlig photon emission: 5,5 × 10

7 /mus, område 6,68 × 10

5-2,06 × 10

8). Derfor, for dataanalyse, vi behandlede fold-change af emissionen mellem behandlede og ikke-behandlede dyr ved hver behandling tidspunkt (14, 21 og 28 dage) frem for de absolutte foton emissionsværdier [18].

i figur 6, rapporterer vi den rå IVIS beslutsomhed i hver mus behandlet med α-cobrotoxin planmæssigt 1 og i den tilsvarende kontrolgruppe. Som vist, er denne behandling ikke ud til at have en mærkbar virkning på tumorvækst i dette dyr model system. Den eneste tilsyneladende slående forskel var antallet af døde dyr ved afslutningen af ​​den observationsperiode (4 i kontrolgruppen og 2 i behandlingsgruppen). Dog skal det bemærkes, at på dette tidspunkt alle dyr måtte aflives af etiske grunde, og at obduktion viste, at tumoren havde udvidet uden brysthulen hos alle behandlede og ubehandlede mus. Som vist i figur 7 også ved de højere doser anvendes i tidsplanen 2 behandlingsplan, virkningen af ​​α-cobrotoxin som antitumormiddel var ubetydelig, hvis nogen. Som for tidsplanen 1 behandlingsplan, også disse dyr blev aflivet på dag 28 på grund af tumorvækst-relaterede symptomer. Faktisk ved obduktion alle dyr præsenteret en helt invaderet brysthulen med tumorer strækker uden for brystet uanset behandling ordning.

X betegner de døde dyr.

X betegner de døde dyr.

i figur 8 er rapporteret den gennemsnitlige fold-ændring af udledningen i behandlings- og kontrolgrupperne for tidsplanen 1 (panel A) og tidsplan 2 (panel B). Selv om forskellen, vurderet ved Mann-Withney test, ikke nåede statistisk signifikans (bortset skema 1, dag 14, p = 0,04), observerede vi en slående højere emission i toksinet behandlingsgruppen i forhold til kontrolgruppen. Denne effekt var dramatisk tydelig i tidsplanen 2 på dag 28, selv om forskellen i photon emission ikke nåede statistisk signifikans, sandsynligvis på grund af det begrænsede antal dyr,

Panel A: mus behandlet med α- cobrotoxin planmæssigt 1. Panel B: mus behandlet med α-cobrotoxin planmæssigt 2. Panel C: mus behandlet med α-cobratoxin ifølge tidsplaner 1 og 2.

De samme behandlingsplaner var også anvendes med α-cobratoxin. Resultaterne af dette sæt af eksperimenter viste, at dette toksin mangler tydelig antitumoraktivitet samt. I figur 9, vi rapporterer den rå IVIS bestemmelse for hver mus behandlet med α-cobratoxin ifølge tidsplaner 1 og 2, mens i figur 8, panel C, viser vi den gennemsnitlige fold-ændring af emission i kontrollen og behandlede mus. Som det kan ses, er behandlingen ikke mærkbart påvirke tumor vækst som foton emission i behandlede mus var sammenlignelig med kontrollen ved hvert tidspunkt. Antallet af dyr, der skulle ofres for humanitære grunde inden udgangen af ​​det observerende periode var højere i kontrol i forhold til behandlede mus. Dog skal det bemærkes, at også i dette tilfælde alle dyr, på dag 28, præsenterede massiv tumorvækst, der udvides uden brysthulen uanset behandlingsplanen.

X betegner de døde dyr.

in vivo Salg forsøg blev udført kun med A549-luc cellelinie siden udnyttelsen af ​​ikke-luc mærkede celler ville have krævet et stort antal mus til vurdering af antitumoraktivitet af toksiner. På baggrund af de opnåede resultater

in vitro

på 5 cellelinjer og

in vivo

med A549-luc vi betragtes som uetisk at gå forud med yderligere dyreforsøg

Den molekylære grundlag af lungekræft er blevet grundigt undersøgt og samspillet mellem nikotin og nAChR’er er blevet anerkendt som en af ​​de vigtigste begivenheder, der førte til udviklingen af ​​denne tumor [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Det er således ikke overraskende, at nAChRs blev betragtet som god kandidat mål for innovative “biologiske” behandlinger [15], [22], [23], [24]. I den forbindelse kan eksistensen af ​​potente toksiner hæmmer Nach receptorer åbne mulighed for at tilpasse Paul Ehrlich er “magisk kugle” koncept til lungekræft behandling [34].

cobra slange gift er en kilde til forskellige toksiner besidder cytolytisk og nAChR hæmmende aktiviteter [32], [35]. På grund af denne sidstnævnte aktivitet, den α-cobratoxin fra

N. kaouthia

er blevet foreslået som en innovativ naturlig terapeutisk middel for lungekræft [18], [19], [20], [22], [24] er i stand til dramatisk hæmme væksten tumorceller lunge og til en væsentlig forbedring af overlevelsen af lungetumor-bærende mus. Vi har revurderet de antitumorale aktiviteter to forskellige cobra nervegifte

in vitro

og

in vivo

udnytte to skemaer for administration og de samme eksperimentelle betingelser for tidligere rapporter. Resultaterne af vores forsøg viser tydeligt, at disse to biologisk aktive toksiner har væsentlige ingen virkning på tumorcellevækst i

in vitro

analyser på koncentrationen rapporteret i andre publikationer. En betydelig tumorcellevækst inhibering blev opnået ved α-cobratoxin koncentration for høj til at blive udnyttet

in vivo

. Vigtigere a-nervegifte, ved koncentrationer brugbare

in vivo

, ikke hæmme tumorvækst blev heller ikke i stand til signifikant at forlænge overlevelsen hos mus, der bærer en orthotopisk-podet NSCLC. Faktisk

in vivo

eksperimenter måtte afbrydes på dag 28, eller tidligere, i behandlede og ubehandlede forsøgsdyr til etiske grunde, da den podede tumor i alle tilfælde havde udvidet uden brystkassen. Disse resultater er i slående kontrast til de andre undersøgelser, der rapporterede en øget levetid på 93% i α-cobratoxin behandlede versus ubehandlede mus [20], og tyder på, at Cobra α-nervegifte har nogen potentiel terapeutisk effekt i lungekræft.

det er endnu ikke forklaret, hvorfor i en offentliggjort rapport fra den samme gruppe havde at blive dræbt af humanitære årsager på dag 29 alle dyr [18], mens i en anden undersøgelse af dyrene, behandlet på lignende måde kunne følges op til dag 170 [20 ], (revideret i [22]).

overraskende har vi observeret, at

in vivo

tumorvækst i mus behandlet med α-cobrotoxin var højere end for kontrolgrupperne. Denne uventede opdagelse antyder, at selv om dette toksin ikke binder til den α7 receptoren, den rapporterede fremherskende subtype stede på A549-celler, kan det aktivere nikotin-afhængige tumorigen pathway gennem dets binding til forskellige nAChR (sandsynligvis til muskel-typen receptor) . Således kan dette toksin være et fremragende værktøj til fint dissekere de biologiske veje, hvor nAChR’er er involveret

Materialer og metoder

Etik erklæring

alle detaljer om:. Tilladelser , regler og dyrevelfærd er rapporteret i “dyr” underafdeling af dette Metoder sektion

Tumor cellelinjer og α-neurotoksin præparater

rotte fæokromocytom cellelinje PC12, anvendt som positiv kontrol for α7 nAChR udtryk, de humane NSCLC adenocarcinom cellelinjer H1650 og H1975 blev opnået fra ATCC; Den NSCLC adenocarcinom A549 og pladecellekræft karcinom cellelinjer SK-MES 1 og Calu 1, blev opnået fra vores Institutional Cell Repository (ICLC, www.iclc.it). Cellelinjen A549-luc, modificeret til stabilt udtrykke luciferase, og anvendes til

in vivo

studier blev venligst stillet til rådighed af Dr. J. W. Shay (H. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas, Dallas). A549, A549-luc, SK-MES 1 og H1650 anvendt i den foreliggende undersøgelse havde samme oprindelse af disse anvendes i andre udgivne værker [18], [19], [20], [27]. Celler blev dyrket i RPMI 1640 med 10% bovint serum. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italien).

kortkædede α-cobrotoxin fra

N. ATRA

(MW 6949 kDa) opnåedes fra Sigma (Milano, Italien). LD50 hos mus af partiet udnyttes i dette arbejde, bestemt af selskabet, var 0,09 mg /kg.

langkædede α-cobratoxin (MW 7821 kDa) blev oprenset fra

N. kaouthia

gift som beskrevet [36]. Denne procedure indebærer: gel-filtrering, højtydende ionbytning og omvendt-fase-kromatografi og anvendes til at producere store mængder af toksinet til receptorsteder undersøgelser [37]. Den α-cobratoxin fremstillet ved denne fremgangsmåde er fuldt aktiv og hæmmede acetylcholin-inducerede strømme i

Xenopus

oocytter udtrykker human α7 nicotinacetylcholinreceptor med IC

50 på 4,1 nM [38]. Den biologiske aktivitet af det parti toksin brugt i dette studie blev testet for evne til at inhibere radioaktivt α-bungarotoxin binding til humant α7 nicotinacetylcholinreceptor heterologt udtrykt i GH4C1 celler. Ved 20 nM α-cobratoxin inhiberede α-bungarotoxin binding med mere end 50%.

De lyofiliserede toksiner blev opløst ved bestanden koncentration på 10

-3 M i phosphatbufret saltvand (PBS) og holdt ved -20 ° C.

Western blot-analyse

Cellesuspensioner blev opnået efter trypsinering af A549 eller A549-luc og PC12-kulturer (anvendt som positiv kontrol). Celler blev opløst i lyseringsbuffer og behandlet som tidligere beskrevet [39]. Koncentrationen af ​​cellelysater protein blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italien) ifølge producentens instruktioner.

Halvtreds ug af totale proteiner blev adskilt på NuPAGE 4-12% bis-Tris-gel (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italien) og derefter overført til en nitrocellulose membran ved iBlot ™ gel Overførsel Stacks (Invitrogen).

Blottene blev sonderet med anti α7 AChR polyklonale antistof (Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland) og efterfølgende med anti-ßActin monoklonalt antistof (Sigma, Milano, Italien) for at konstatere, at en lige mængde protein blev lagt i hver bane.

Immundetektion blev udført ved hjælp af forøget kemiluminescens (ECL) kit (GE Healthcare, Milano, Italien) efter leverandørens anbefalede procedurer.

RT og qPCR analyse

Total RNA fra A549-luc (ubehandlet og behandlet med 1, 3 og 9 nM α- cobratoxin eller α-cobrotoxin i 72 timer), A549 (ubehandlet og behandlet med 1, 3 og 9 nM α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES 1, Calu 1 og PC12 cellelinier blev isoleret ved anvendelse af RNAeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. RNA blev behandlet med RNAse-fri DNAse under på-kolonne oprensning. RNA integritet blev vurderet ved gelelektroforese: forholdet 28S til 18S var ca. 2:01. RNA blev kvantificeret ved spektrofotometri. Forholdet mellem aflæsningerne ved 260 nm og 280 nm blev omfattet mellem 1,9 og 2,1.

Et ug totalt RNA blev anvendt til at fremstille cDNA med Superscript ™ II RNase H- Reverse Trascriptase (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

for at bestemme tilstedeværelsen af ​​α7 nAChR på cellelinjer, cDNA blev anvendt i en semikvantitativ reaktion som beskrevet andetsteds [40], [41], [42].

PCR betingelser var:. 95 ° C i 10 minutter, 45 cykler 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 15 sek og 72 ° C i 30 sek)

qPCR reaktioner blev udført under anvendelse af Maxima Sybr Green qPCR Master Mix .