PLoS ONE: Dominerende ekspression af DCLK1 i Human bugspytkirtelkræft Stamceller Accelererer Tumor invasion og metastase

Abstrakt

Patienter med kræft i bugspytkirtlen typisk udvikle tumor invasion og metastase i den tidlige fase. Disse maligne adfærd kan stamme fra cancer stamceller (CSCS), men den ansvarlige mål er mindre kendt om usynlige CSCS især for invasion og metastase. Vi har tidligere undersøgt proteasomet aktivitet CSCS og bygget en real-time visualisering system til human pancreas CSCS. I nærværende undersøgelse fandt vi, at CSCS var meget metastatisk og overvejende lokaliseret på invaderende tumor marginer i en levermetastaser model. Microarray og siRNA screeningsbestemmelser viste, at doublecortin-lignende kinase 1 (DCLK1) overvejende blev udtrykt med histon modifikation i pancreas CSCS med invasiv og metastatisk potentiale. Overekspression af DCLK1 førte til amoeboid morfologi, der fremmer migrationen af ​​pankreatiske cancerceller. Knockdown af DCLK1 dybt undertrykt in vivo levermetastaser af pancreas CSCS. Klinisk DCLK1 blev overudtrykt i de metastatiske tumorer hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Vore undersøgelser viste, at DCLK1 er afgørende for de invasive og metastatiske egenskaber af CSCS og kan være et lovende epigenetiske og terapeutisk mål i human pancreascancer

Henvisning:. Ito H, Tanaka S, Akiyama Y, Shimada S, Adikrisna R, Matsumura S, et al. (2016) Dominerende ekspression af DCLK1 i Human bugspytkirtelkræft Stamceller Accelererer Tumor invasion og metastase. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10,1371 /journal.pone.0146564

Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA

Modtaget: August 17, 2015; Accepteret: 18. december 2015; Udgivet: 14 Jan 2016

Copyright: © 2016 Ito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Projekt for udvikling af innovative Kræftforskningscenter Therapeutics (P-Direct), en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på Innovative områder, Videnskabelig Forskning (A), Udfordrende sonderende Forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab Teknologi i Japan, og en Health Labour Sciences Research Grant fra Sundhedsministeriet Arbejds- Velfærd i Japan. Nummer: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL:. Https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : CSC, cancer stamceller; ODC, ornithindecarboxylase; Gdeg, ZsGreen-mærket degron ODC; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-methylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-methylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-methylering; FACS, fluorescens-aktiveret cellesortering; RT-PCR, revers transkription-polymerasekædereaktion; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; GAPDH, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen er den mest dødbringende almindelige kræftform, fordi det normalt er diagnosticeret på et fremskredent stadium og er resistente over for behandling [1]. Den samlede overlevelsesraten 5 år efter diagnosen er ca. 5-6%, hvilket er den laveste nogen kræft [2]. Trods nyligt udtænkt kirurgiske teknikker og anti-cancer medicin, har den behandlingseffekt for kræft i bugspytkirtlen ikke forbedret væsentligt i det seneste årti på grund af tendensen til tidlig invasion og metastase [3]. Disse meget maligne kendetegn skyldes den selvfornyelse og differentiering af en lille subpopulation af cancerceller med stamceller-lignende egenskaber, såkaldte cancer stamceller (CSCS) [4, 5], som også omtales som metastatiske stamceller [6, 7]. Nylige undersøgelser viste, at stamceller skæbne bestemmes ved epigenetiske mekanismer, herunder histon modifikation i enten normale celler [8] eller CSCS [9]. Endnu vigtigere, forventes identifikation af molekylære mål af CSCS at accelerere udviklingen af ​​nye målrettede behandlinger [10]. Selv om flere celleoverflademarkører er blevet identificeret som karakteristisk for pancreas CSCS [5, 11], terapeutiske mål for den invasive og metastatiske proces er stadig uklart i pancreascancer [12, 13]. Evaluering terapeutiske strategier til at målrette CSCS er vanskelig på grund af kompleksiteten i at rekonstruere blandede populationer med differentieret afkom i en hierarkisk måde [14, 15]. Et overvågningssystem baseret på CSC-specifikke funktioner kunne være en løsning på disse problemer, og vi udnyttet den lave proteasom aktivitet CSCS at oprette et sådant system. Humane bryst- og gliom cancerceller blev manipuleret til stabilt at udtrykke grøn fluorescens fusioneret til degron af ornithindecarboxylase (Gdeg), hvilket resulterede i intracellulær akkumulering af grønt fluorescerende protein Gdeg som følge af den lave aktivitet af 26S proteasomet [16, 17] . Ved at bruge denne egenskab, vi tidligere bygget en real-time visualisering system til humane lever CSCS og demonstreret deres høje metastatisk evne med niche dannelse [18]. Vores visualisering system blev også brugt til at afklare de meget ondartede egenskaber af humane pancreas CSCS [19]. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi doublecortin-like kinase 1 (DCLK1) som et protein, der udtrykkes overvejende i invasive og metastatiske CSCS. Genet var forbundet med epigenetik ændringer, herunder H3K4me3 og H3K27me3 histon modifikation. DCLK1 er tidligere rapporteret at være en kandidat normal stamcelle markør i tarmen [20, 21]. Men Nakanishi

et al

. brugte slægt-sporing eksperimenter og viste, at DCLK1 markerer tumor stamceller, der kontinuerligt producerer tumor afkom [22]. Desuden Westphalen

et al

. brugte samme strategi og rapporterede forholdet mellem langlivede DCLK1-positive celler og initiering af tyktarmskræft [23]. Ifølge den seneste rapport fra Bailey

et al

., Pancreas neoplasmer i mus, der udtrykker DCLK1 indeholder morfologisk og funktionelt adskilte subpopulationer med CSC-lignende egenskaber [24]. Brug af ovenstående visualisering systemet og metastatisk pancreascancer, afslørede vores studier, at DCLK1 er højt udtrykt i humane pancreas CSCS og i kliniske prøver og kan repræsentere et terapeutisk mål.

Materialer og metoder

Retroviral transduktion af degron reporter i humane bugspytkirtelkræftceller

degron sekvens af ornithindecarboxylase (ODC) er anerkendt direkte af proteasomer, som fører til øjeblikkelig destruering af involverede protein [16]. Den retroviral ekspressionsvektor pQCXIN-ZsGreen-cODC, som indeholder grøn fluorescens ZsGreen-mærket degron ODC (Gdeg), blev venligst stillet til rådighed af Dr. Frank Pajonk (UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, Californien, USA). Vektoren blev transficeret ind Platinum retrovirale pakkeceller [25], og det opsamlede fra supernatanten retrovirus blev anvendt til at inficere bugspytkirtelkræftceller. Stabile transfektanter blev selekteret med G418 (Geneticin; Promega, Madison, WI, USA), og akkumuleringen af ​​ZsGreen-degronODC protein (Gdeg) blev overvåget ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri (FITC kanal). At verificere stabil transfektion blev cellerne udsat for proteasominhibitor MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) i 12 timer. Fluorescens mikroskopi blev udført ved hjælp AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland), og billederne blev erhvervet digitalt med AxioVision software (Carl Zeiss).

In vitro celle migration og invasion analyser

Den dobbelte -chamber migration assay blev udført ved anvendelse af et transwell kammer [26] (24-brønds plade, 8 um porer; BD Biosciences, Canaan, CT, USA). For invasionen assay blev Matrigelcoatede (BD Biosciences) transbrøndene (0,1 mg /ml) fremstillet ved inkubering i serumfrit medium i 2 timer ved 37 ° C i en 24-brønds plade. Det nedre kammer blev fyldt med 0,8 ml dyrkningsmedium uden antibiotika. Derefter DCLK1 høje ekspressionsniveauer, vildtype, Gdeg

høj, og Gdeg

high-siDCLK1 tumorceller (8 × 10

4 i 0,3 ml serumfrit medium) blev podet ind i det øvre kammer og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. Tumorcellerne på den øvre overflade af filteret blev fjernet ved anvendelse af en vattet vatpind. Celler blev derefter fikseret med 100% methanol og farvet med Giemsa-opløsning, og antallet af celler migrerer eller invaderende i den nedre overflade blev talt i tre tilfældigt udvalgte stor forstørrelse felter (100 ×) for hver prøve. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer.

microarray analyse

For genekspression analyse, 2 × 10

5 frisk sorteret Gdeg

høje og Gdeg

lave KLM1 celler anvendes. Totalt RNA blev ekstraheret fra hver celletype med QIAZOL, en RNeasy Micro Kit, og QIAshredder spin-søjler (Qiagen, Hilden, Tyskland). Integriteten af ​​RNA opnået blev vurderet med en NanoDrop ND-100 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), en 2100Bioanalyzer, og en RNA6000Pico Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Ifølge GeneChip®3’IVT Express Kit, P /N702646 Rev.7 protokol (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), blev komplementært DNA fremstillet fra 100 ng total RNA ved hjælp af en cyklus target mærkning og en kontrol reagenskit (Affymetrix). Hybridisering og signal detektion af HG-U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix) blev udført. De microarray datasæt Gdeg

høje og Gdeg

lave celler blev normaliseret og kommenteret med Expression Console ™ Software (Affymetrix). Anslåede genekspressionsniveauer blev opnået som log2-transformerede værdier. Gener blev udelukket fra analysen, hvis afsløring opkaldet var “marginal” eller “fraværende” i begge Gdeg

høje og Gdeg

lave celler.

Silencing og overekspression af

DCLK1

Små interfererende RNA (siRNA) rettet mod kandidatgener og scrambled siRNA’er (siScr) ikke matcher nogen menneskelige gener blev købt fra Invitrogen. Frisk sorteret Gdeg

høje celler (både KLM1 og BxPC3) blev podet ved en densitet på 2,0 x 10

5 celler per brønd i plader med 6 brønde i 2 ml dyrkningsmedium. Derefter transfektion med siRNA blev udført ved anvendelse RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger [27]. Efter transfektion med forskellige koncentrationer (10 nM, 20 nM) blev cellerne inkuberet i 48 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Antallet af levedygtige og ikke-levedygtige celler blev talt ved en automatisk celletælling maskinen ved hjælp trypanblåt udstødelse (CYTORECON; Hirata, Tokyo, Japan). Ved 48-timers tidspunktet efter siRNA transfektion blev celler løsnet fra hver plade til brug for yderligere forsøg. SiRNA målsekvenser var dem af højt indhold genom-dækkende RNAi skærme [28]. Til konstruktion af shRNA ekspressionsvektor (pSilencer

TM 2.1-U6 puro; Invitrogen) [29], KLM1-Gdeg celler (2,0 x 10

5) blev transficeret med 2,5 pg plasmid med lipofectamin 2000 (Invitrogen). Mediet blev skiftet hver 2. dag, og stabile transfektanter blev isoleret ved inkubering i medium indeholdende 400 ug /ml puromycin. At skabe forbigående tumorceller overeksprimerer DCLK1, brugte vi pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF

TM cDNA kloner og PrecisionShuttle

TM Vector System, OriGene Technologies, Rockville, MD, USA). KLM1 celler blev transficeret under anvendelse lipofectamin 2000 ifølge fabrikantens protokol. Efter inkubation ved 37 ° C i 48 timer blev GFP-positive celler sorteret til yderligere forsøg.

In vivo studier af tumorigenicitet og metastase Salg

Kvinde NOD.CB17-PRkdcScid /J-mus, alderen 5-6 uger, blev indkøbt fra Charles River Laboratory (Kanagawa, Japan). Kirurgi blev udført under bedøvelse leveres af isofluran næse-kegle inhalation. Forskellige mængder sorteret celler (1 x 10

2 til 1 × 10

5 Gdeg

high-KLM1 og Gdeg

lavt KLM1, 1 × 10

2 til 1 x 10

4 Gdeg

høj BxPC3 og Gdeg

lav BxPC3) blev blandet med matrigel, og 100 pi blev injiceret subkutant i begge flanker af musene. Tumordannelse derefter blev overvåget hver 4. dag i op til 10 uger. Tumorvolumenet blev estimeret ved hjælp af følgende ligning: volumen = (længde) x (bredde)

2/2. Hver gruppe bestod af 4-6 mus. For levermetastaser analyse abdominale hud og muskel ca. 5 mm langt blev indridset lige midterlinjen. Milten blev blotlagt gennem snittet ved at anvende blid trækkraft, og de sorterede celler (Gdeg

high-KLM1, Gdeg

lavt KLM1 og Gdeg

high-KLM1-shDCLK1, Gdeg

high-BxPC3 og Gdeg

lav BxPC3, n = 6), suspenderes ved 1 x 10

6 celler pr 100 pi PBS, blev injiceret lige under kapslen af ​​den nedre stang ved hjælp af en tuberkulin sprøjte med en 30-gauge nål . Hæmostase blev opnået ved at tilføre et let tryk (med en vattet vatpind) på injektionsstedet. Milten blev derefter returneret til den peritoneale kavitet, og abdomen blev lukket ved anvendelse af to 6-0 silkesuturer gennem både hud og muskel samtidigt [30, 31]. Vi observerede disse mus i 8 uger, og derefter undersøgt, om metastase var sket [32]. Alle in vivo procedurer i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care udvalg for Tokyo Medicinsk og Dental University (tilladelse No.0150044A).

Patienter og prøver

Vi inkluderede patienter, som gennemgik primær og metastatisk (lever og lunge) tumor resektion for pancreas ductal adenocarcinom på Tokyo Medicinsk og Dental University Hospital mellem 2005 og 2013. parrede prøver blev brugt til immunhistokemisk analyse. Reseceret væv blev fikseret i 10% formaldehyd-opløsning og indlejret i paraffin til histopatologisk analyse efter de almindelige regler for klinisk og patologisk undersøgelse af Primary kræft i bugspytkirtlen. Denne undersøgelse blev godkendt af etiske udvalg af Tokyo Medical og Dental University (Tilladelse No.1080) og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Statistisk analyse

Alle værdier er præsenteret som den gennemsnitlige ± SD med mindre andet er angivet. De to-halede t-test (til sammenligning mellem grupper) eller envejs variansanalyse (til sammenligning af tre eller flere grupper) efterfulgt af Dunnett

post-hoc Salg tests blev anvendt til statistiske analyser. SPSS softwareversion 21.0 (SPSS, Chicago, IL) blev anvendt. Statistisk signifikans blev defineret som p. 0,05

Resultater

visualiseret pancreas CSCS er særligt i stand til levermetastaser

Stabil transfektion af Gdeg reporter i to human bugspytkirtelkræft celle linjer med forskellige onkogene potentialer metastase; KLM1 som high-evne celler med mutant KRAS, og BxPC3 som lav-evne celler med vildtype-KRAS [33-35]. CSCS mærket med reporter viste en Gdeg

stor befolkning, der tegnede sig for ca. 1,0% af det samlede antal celler (S1 Fig). I assayet for kugle-dannelse [36], at antallet af kugler ( 50 um i diameter) afledt af Gdeg

høje celler var signifikant højere end den for Gdeg

lave celler (p 0,01, Fig 1A og 1B). Øget tumorigenicitet in vivo er også blevet anvendt som et stykke kritisk beviser for eksistensen af ​​CSCS [4]. Således er en ordnet befolkning Gdeg

høje eller Gdeg

lave celler blev injiceret subkutant i NOD /SCID-mus. For Gdeg

høje celler afledt af både KLM1 og BxPC3 cellelinjer, bekræftede vi den meget maligne potentiale (S2 Fig). I både KLM1 og BxPC3 cellelinjer, Gdeg

høje celler havde en signifikant større evne til at migrere og invadere end Gdeg

lave celler i en dobbelt-kammer assay (p 0,01, figur 1C og 1D). For at undersøge om de Gdeg celler medierer metastase in vivo, Gdeg

høje eller Gdeg

lave celler blev injiceret i miltene fra NOD /SCID-mus (n = 6). Efter 8 uger, vi visuelt bekræftede tilstedeværelsen af ​​tumorer i milten og talte antallet af levermetastaser. Vi fandt signifikant mere lever metastatiske tumorer i Gdeg

høj gruppen end i Gdeg

lav (p 0,05; Gdeg

high-KLM1 celler, 5,3 ± 3,4 tumorer versus Gdeg

lav- KLM1 celler, 0 ± 0 tumorer, p 0,01; Gdeg

high-BxPC3 celler, 13,6 ± 5,1 tumorer versus Gdeg

lave BxPC3 celler, 2,2 ± 2,8 tumorer) (fig 2A og 2B, 2F og 2G ). Vi observerede også nogle mikro-metastaser i leveren af ​​Gdeg

høje grupper (Fig 2C og 2H), men vi konstatere, at der ikke metastatiske tumorer blev set i mus injiceret med Gdeg

lav KLM1 celler. Immunfluorescerende analyse klart afsløret Gdeg

høje celler, der blev lokaliseret til tilknytning til tumor (Fig 2D og 2i). Andelen af ​​Gdeg

høje celler i tumor margin område (MA, 200 pm) var meget højere end i tumoren centrale område (CA) (Gdeg

high-KLM1 tumor, 26,1 ± 4,2% versus 4,1 ± 2,5%, Gdeg

high-BxPC3 tumor, 21,0 ± 1,9% versus 4,1 ± 0,2%, p 0,01) (fig 2E og 2J). Som i en tidligere undersøgelse [11], vores resultater antydede, at CSCS tendens til at invadere yderligere uden for tumoren.

(A) Repræsentative mikroskopiske billeder af kugler er vist. Gdeg

high-KLM1 og Gdeg

high-BxPC3 celler dannede komplette kugler, men Gdeg

lavt KLM1 og Gdeg

lave BxPC3 celler ikke gjorde. Scale bar, 50 um. (B) Antallet af kugler ( 50 um i diameter) observeret i hver brønd (n = 6). Data er gennemsnit ± SD. ** P 0,01 sammenlignet med Gdeg

høj. De to-sidet t-test blev anvendt til at sammenligne to uafhængige grupper. (C og D) Cell migration og invasion blev analyseret med en dobbelt-kammer under anvendelse Gdeg

high-KLM1, Gdeg

lav KLM1, Gdeg

high-BxPC3, og Gdeg

low-BxPC3 celler. Repræsentative mikroskopiske billeder vises. Kvantificering af migration og invasion præsenteres som gennemsnit ± SD for tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01 sammenlignet med Gdeg

høje celler

(A og F) Repræsentant lever metastatiske tumorer er vist i mus 8 uger efter injektion. (B og G) Histogram viser det gennemsnitlige antal af tumorer i leveren (n = 6; middelværdi ± SD). For begge cellelinier, fandt vi en signifikant forskel mellem Gdeg

høj og Gdeg

lave celler. * P 0,05 i (B) og ** p 0,01 i (G). (C og H) Mikroskopiske billeder af lever, der var reseceret, snittet og farvet med H middelværdi ± SD). ** P 0,01. Vi tælles tre forskellige områder for hver region.

Overekspression af DCLK1 sammen med histon modifikation er ansvarlig for den invasive potentiale af pancreas CSCS

For at klarlægge de invasive og metastatiske markører for pancreas CSCS, vi sammenlignede genekspressionsmønstre mellem Gdeg

høje celler og Gdeg

lave celler ved microarray hybridisering (S1 data). Scatterplot analyse af de 25,572 sonder, som afsløring opkaldet var “til stede” viste, at 483 gener var opreguleret og 1.138 gener blev nedreguleret med mere end 2 gange i Gdeg

high-KLM1 celler sammenlignet med Gdeg

low-KLM1 celler. Baseret på den fold ændre placering i Gdeg

høje celler (tabel 1), blev siRNA screening for kandidatgener vurderet i henhold til de hæmmende effekt på Gdeg

høj celle migration og invasion efter det dobbelte-kammer assay. Følgelig kan kun en siRNA mod DCLK1 faldet markant cellulære migration og invasion i forhold til kontrol i både KLM1 og BxPC3 Gdeg

høje celler (p 0,01, figur 3A og 3B). DCLK1 blev identificeret som et mål molekyle, der er overudtrykt i Gdeg

høje celler med migration og invasiv evne i forhold til Gdeg

lave celler. QRT-PCR og Western blotting analyser viste, at DCLK1 mRNA og protein blev overudtrykt i Gdeg

høje celler, men ikke i Gdeg

lave celler (S3 Fig). Immuncytokemisk analyse viste DCLK1 protein blev primært lokaliseret i cytoplasmaet (figur 4A og 4B) og reduceret ekspression af DCLK1 blev bekræftet ved anvendelse af siRNA (S3 Fig, Fig 4C og 4D). Dernæst undersøgte vi epigenetiske aspekter af

DCLK1

udtryk ved at gennemføre kromatin immunofældning (chip) analyse af tre centrale histon methylering markører, H3K4me3, H3k9me3, og H3K27me3, både Gdeg cellelinier. Som vist i fig 4E, Gdeg

høje celler udtrykte højere niveauer af H3K4me3, som er forbundet med aktive promotorer, end H3K27me3, som er forbundet med lyddæmpede promotorer. Gdeg

lave celler var næsten bivalent. Disse resultater indebærer, at

DCLK1

udtryk i Gdeg cellelinjer blev reguleret af histon modifikation af H3K4 og H3K27. Vi fandt ingen forskel i H3K9me3 niveauer mellem Gdeg

høj og Gdeg

lav i disse cellelinjer.

(A) Dobbelt-kammer assay af migration og invasion for både Gdeg

høj cellelinjer efter behandling. Repræsentative mikroskopiske billeder vises. (B) Antallet af trækkende og invaderende celler i sammenligning med kontrolgruppen blev påfaldende undertrykt i begge Gdeg

Høje-siDCLK1 cellelinier. #not signifikant, ** p. 0,01 ved envejs variansanalyse efterfulgt af Dunnett multipel sammenligningstest

(A og B) Immuncytokemisk analyser af DCLK1 i begge cellelinier (oprindelig forstørrelse × 200) er vist. Gdeg

høje celler udtrykte DCLK1 protein, som blev lokaliseret i cytoplasmaet, men Gdeg

lave celler viste kun svag udtryk. Scale bar, 10 um. (C og D) Immuncytokemisk analyse af celler behandlet med

DCLK1

-specifik siRNA vises (oprindelig forstørrelse x 200). DCLK1 proteinekspression blev reduceret i Gdeg

høje celler efter transfektion med siDCLK1. Scale bar, 20 pm. vises (E) chipanalyse. Begge Gdeg

høje cellelinjer var stærkt beriget for H3K4me3 forhold til H3K27me3 på

DCLK1

promoter region. Histon H3 og IgG blev brugt som positive og negative kontroller til chip analyse henholdsvis.

DCLK1 fremmer morfologiske ændringer, migration og invasion i humane bugspytkirtelkræftceller

Til undersøge rolle DCLK1 i humane bugspytkirtelkræftceller vedtog vi en gevinst af funktion strategi ved hjælp KLM1 celler, som forbigående over-udtrykte GFP-mærkede DCLK1. Som tidligere rapporteret for neuronale cellelinier, immunofluorescens-analyse af KLM1-DCLK1-GFP demonstrerede overlappende mønstre af DCLK1 ekspression med mikrotubuli ved anvendelse af en α-tubulin-antistof [37] (Fig 5A). Funktionen af ​​DCLK1 i humane bugspytkirtelkræftceller kan således være at styre handlingen af ​​mikrotubuli. Bevægelse og morfologiske ændringer, herunder strækker pseudopodia var klart observeret i time-lapse mikroskopiske billeder (Fig 5B). Under en 15-timers observationsperiode, migration afstand på KLM1-DCLK1-GFP-celler var længere end for vildtype KLM1 celler (p 0,01, figur 5C). I den dobbelt-kammer-assay, antallet af trækkende og invaderende KLM1-DCLK1-GFP-celler var højere end den for vildtype KLM1 celler (p 0,01, figur 5D). Desuden KLM1-DCLK1-GFP celler trans-placeret via hastigt skiftende cykler af morfologiske udvidelse og sammentrækning kaldes amoeboid migration (S1 Video) [38].

(A) Immuncytokemisk analyse viste, at DCLK1 var overvejende samarbejde lokaliseret med α-tubulin i KLM1-DCLK1-GFP celler. Scale bar, 20 pm. Forstørrede billeder af boxed regioner er vist i den anden række. Scale bar, 10 um. (B) Fire KLM1-DCLK1-GFP-celler blev observeret med time-lapse fotografering i 15 timer. De vedtog en amoeboid morfologi som de flyttede. Scale bar, 20 pm. En forstørret billede af de indrammede områder er vist i hjørnet. Hvide pile markerer strække pseudopodia. Scale bar, 10 um. Deres numre (vist som røde stiplede linjer) blev målt. (C) Histogram viser den gennemsnitlige afstand af migration for vildtype KLM1 celler (kontrol celler) og KLM1-DCLK1-GFP-celler (n = 4 hver, gennemsnit ± SD). KLM1-DCLK1-GFP celler migrerede betydeligt længere end kontrol celler. ** P 0,01. (D) Antallet af trækkende og invadere KLM1-DCLK1-GFP celler var også højere end for kontrol celler. ** P. 0,01

DCLK1 knockdown fører til en reduktion i den metastatiske evne pancreas CSCS

For at bekræfte in vivo tab af funktion analyse, stabil knockdown af DCLK1 blev vurderet i Gdeg-KLM1 celler ved hjælp af

DCLK1

shRNA. Kvaliteten af ​​transfektion blev bekræftet ved QRT-PCR, western blotting og immuncytokemiske analyser (Fig 6A-6C). Populationen af ​​shDCLK1-Gdeg

høj KLM1 celler var mindre end 0,5% af det samlede celleantal (S1 Fig). Injicerede vi frisk sorteret shDCLK1-Gdeg

høj KLM1 celler i milt fra NOD /SCID-mus (n = 6). Væsentlige levermetastaser blev påvist efter injektion af kontrol Gdeg

høje celler, men interessant, blev der ikke metastaselæsioner identificeret efter injektion af shDCLK1-Gdeg

høje celler, som bestemt ved makroskopisk og mikroskopisk undersøgelse (figur 6D). Disse resultater antydede, at DCLK1 spiller en væsentlig rolle i levermetastaser i human bugspytkirtelkræft.

(A og B)

DCLK1

-specifik shRNA (shDCLK1) faldt betydeligt DCLK1 mRNA og protein-ekspression i Gdeg

high-KLM1 celler. ** P 0,01. (C) et markant fald i DCLK1 immunreaktivitet blev observeret efter transfektion med shDCLK1 sammenlignet med Gdeg

høj (kontrol). Scale bar, 20 pm. (D) Nogle tumorer langs kanten af ​​leveren var synlige i Gdeg

high-KLM1 gruppen, men ingen tumorer blev set i shDCLK1-Gdeg

høj gruppe. Det gennemsnitlige antal af tumorer i leveren (n = 6 mus) er vist (middelværdi ± SD). Vi observerede en signifikant forskel mellem kontrolgruppen og shDCLK1 gruppen. * P. 0,05

dominerende udtryk for DCLK1 i metastatiske tumorer er klinisk anerkendt i patienter med kræft i bugspytkirtlen

Blandt 135 bugspytkirtlen kræftpatienter, som gennemgik kirurgisk resektion 2005-2013 i vores hospital blev seks metastatiske tumorer resekteres synkront eller metachronously. Disse seks par af primære og metastatiske tumorer blev evalueret for ekspression af DCLK1. Primære og metastatiske tumorer blev resektion synkront i tre tilfælde, og primære tumorer og metachronous fjernmetastaser blev separat resektion i de andre tre tilfælde (tabel 2). Interessant, kræftceller, der var positivt farvet for DCLK1 protein, blev sjældent påvist i de primære tumorer, men var klart påvist i metastatiske tumorer (Fig 7A-7F), og i alle tilfælde, farvningen score var højere i metastatiske tumorer end i primære tumorer (fig 7G). I tilfælde 5 og 6 i særdeleshed blev de primære tumorer fuldstændigt reseceret og ingen lokalt recidiv forekom. Men selv om disse patienter blev behandlet med adjuvans kemoterapi, fjernmetastase optrådte. I disse to tilfælde, DCLK1 udtryk var meget højere i metastatiske tumor end i den primære tumor. Disse resultater antyder, metastatiske tumorer er resistente over for konventionel kemoterapi og at DCLK1 er en markør af metastatiske tumorer.

(A, C og E) I primære læsioner, få cancerceller var positive for DCLK1, og farvningen intensitet var svag (venstre, 100 ×, højre, 400 ×). (B, D og F) I metastatiske læsioner (lever eller lunge), at antallet af DCLK1-udtrykkende celler var højere end i primære tumorer, og farvningen intensiteten var stærkere (venstre, 100 ×, højre, 400 ×). (G) Sammenligning af Immunofarvning scores mellem primære læsioner og metastatiske læsioner. I kliniske alle seks prøver blev DCLK1 mere stærkt udtrykt i metastatisk læsion end i den primære læsion.

Diskussion

DCLK1 består af en N-terminal, der er 65 % svarende til doublecortin (DCX) over hele længden af ​​DCX, men DCLK1 indeholder også yderligere 360 ​​aminosyrer i den C-terminale domæne, hvilket skaber en formodet Ca

2 + /calmodulin-afhængig proteinkinase.

DCLK1

ligger på region af kromosom 13q13.3 [37].

dcx

gen, som er placeret på kromosom region Xq23, er en mikrotubuli-associeret protein kræves for migration af neurale stamceller til hjernebarken.

Mutationer i DCX fører til kortikale laminering defekter i udviklingslandene hjernen, kaldes subkortikal band heterotopia i hunner og klassiske lissencephalies hos mænd [39]. En tidligere mus undersøgelse, hvor DCLK1 og /eller DCX blev slået ud afslørede, at begge proteiner har genetisk kompenserende roller i neuronal migration; det vil sige, at

DCLK1

gen funktioner i en delvist redundant vej med DCX i dannelsen af ​​axonale projektioner på tværs af midterlinien og migration af kortikale neuroner [40]. Vi fandt, at overudtrykt DCLK1 fremmer migration og invasion i cellelinier, og knockdown undertrykker disse evner. Vi nøje overvejet, hvordan vores resultater med hensyn DCLK1 pasform med tidligere resultater vedrørende en neuronal rolle for DCLK1. findes nogle beviser for den potentielle inddragelse af axon vejledning gener i bugspytkirtlen carcinogenese [41], og disse resultater er i overensstemmelse med vores fund, at stærkt udtrykt DCLK1 er nært beslægtet med invasion og metastase i bugspytkirtelkræft. Epigenetisk kontrol af genekspression spiller en stor rolle i celle skæbne bestemmelse. Især er højere orden chromatin struktur at være en vigtig regulator af stamcelle-differentiering [8], herunder endda pancreatisk udvikling [42]. Under induktion af pluripotens, er passende kromatin remodeling kræves til ekspression af stamcelle-specifikke gener. Endvidere har flere undersøgelser om hjernetumorer, hepatocellulært carcinom og brystcancer vist, at histon modifikation er ansvarlig for den hierarkiske struktur, der omfatter cancer stamceller ved toppunktet [43-45]. Rheinbay

et al

. rapporterede tabet af H3K27me3 aktiverer en signalvej kræves til vedligeholdelse og tumorgenicitet af glioblastom CSCS [43]. Knockdown af H3K20 methyltransferase PR-set7 i lever inducerede spontan udvikling af hepatocellulært carcinom med kræft stamceller egenskaber [44]. Westcott

et al

. rapporterede en epigenetisk særskilt delpopulation af brystkræft tumorceller med en forbedret evne til kollektivt invadere [45]. I denne undersøgelse afslørede chipanalyse at

DCLK1

transkriptionsstartsitet i begge Gdeg

høj cellelinjer blev stærkere markeret med histon modifikation for genaktivering (H3K4me3) end undertrykkelse (H3K27me3).