PLoS ONE: Etablering og karakterisering af en ny celle Line of Canine inflammatorisk Mammary Kræft: IPC-366

Abstrakte

Canine inflammatorisk brystkræft (IMC) aktier epidemiologiske, histopatologiske og kliniske karakteristika med sygdommen hos mennesker og er blevet foreslået som en naturlig model for human inflammatorisk brystkræft (IBC). Formålet med denne undersøgelse var at karakterisere en ny cellelinje fra IMC (IPC-366) for den sammenlignende undersøgelse af både IMC og IBC. Tumorer celler fra en kvindelig hund med klinisk IMC blev indsamlet. Cellerne blev dyrket under adhærente betingelser. De vækst, cytologiske, ultrastrukturelle og immunhistokemiske (IHC) karakteristika for IPC-366 blev evalueret. Ti Balb /SCID-mus blev inokuleret med IPC-366 celler til at vurdere deres tumorigenicitet og metastatisk potentiale. Test for kromosomaberrationer og Karyotype afslørede tilstedeværelsen af ​​strukturelle aberration, numeriske og neutrale rearrangementer, viser en kromosomal ustabilitet. Mikroskopisk undersøgelse af tumor afslørede en epitelial morfologi med markant anysocytosis. Cytologiske og histologiske undersøgelse af udstrygninger og ultratynde sektioner ved elektronmikroskopi afslørede, at IPC-366 er dannet af stærkt malign store runde eller polygonale celler karakteriseret ved markant atypi og fremtrædende nucleoli og hyppige flerkernede celler. Nogle celler havde cytoplasmatiske tomme rum omfattet af cytoplasmatiske membran ligner kapillære endotelceller, et fænomen, der er blevet relateret til s vaskulogen mimicry. IHC karakterisering af IPC-366 var basal-lignende: epitelceller (AE1 /AE3 +, CK14 +, vimentin +, actin-, p63-, ER-, PR-, HER-2, E-cadherin, overudtrykt COX-2 og høj Ki 67 proliferation index (87,15%). efter 2 uger efter inokulering af IPC-366 celler, blev fundet en tumormasse i 100% af musene. Ved 4 uger metastaser i lunge og lymfeknuder blev fundet. xenograf tumorer opretholdt de oprindelige IHC karakteristika . den hunhund tumor sammenfattende cellelinien IPC-366 er en hurtigt voksende malign triple negativ cellelinie for inflammatorisk brystcarcinoma, der kan anvendes til sammenlignende undersøgelse af både IMC og IBC

Henvisning.: Caceres S, Peña L, de Andres PJ, Illera MJ, Lopez MS, Woodward WA, et al (2015) Etablering og karakterisering af en ny celle line of Canine inflammatorisk Mammary Cancer:.. IPC-366 PLoS ONE 10 (3): e0122277 doi: 10,1371 /journal.pone.0122277

Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

modtaget:. november 28, 2014; Accepteret: 17 Februar 2015; Udgivet: 25 Mar 2015

Copyright: © 2015 Caceres et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af det spanske ministerium for videnskab og uddannelse (forskningsprojekt nr SAF 2009-10.572.) til SC, LP, PJA, MJI, og JCI. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammatorisk brystcancer (IMC) er den mest aggressive mamma neoplasi, der påvirker hunhunde [1, 2]. Dens modstykke sygdom hos mennesker er kendt som inflammatorisk brystkræft (IBC) og tegner sig for mindre end 6% af humane brystkræftdiagnoser med en ringe overlevelse hos kvinder [3, 4]. I begge arter, denne form for kræft er yderst angiogene og angioinvasive [5-8]. Det vigtigste histologiske karakteristisk for sygdommen i begge arter er den massive invasion af dermal lymfekar af neoplastiske celler, som blokerer lymfedrænage forårsager den karakteristiske ødem [1, 9].

Der er betydelige epidemiologiske, kliniske og histopatologiske ligheder deles af IBC og IMC derfor sidstnævnte betragtes som en god spontan model til at studere den humane sygdom [2, 8]. Brugen af ​​cellelinjer i kræftforskning giver fordele i behandlingen af ​​cellevækst og progression [10-12]. Mere end 33 humane brystcancercellelinier fra primære tumorer, metastatiske tumorer og pleural effusion er blevet etableret [10, 11, 13]. Men for at udføre undersøgelser på IBC, er det cellelinjer tilgængelighed begrænset til SUM149, SUM 190 og MDA-IBC-3, FC-IBC02 [12, 14, 15].

I de sidste år flere hunde brystkirtler carcinoma cellelinier er blevet udviklet [16-18], selv om ingen af ​​dem er en hunde inflammatorisk cellelinie. Det er således ønskeligt at udvikle og etablere en hund IMC cellelinie at sammenligne den inflammatoriske brystkræft typen hos begge arter og for at lette yderligere in vitro-undersøgelser. Formålet med denne undersøgelse var at etablere den første IMC cellelinje (IPC-366) og at beskrive det i form af immunofænotype og tumorgenicitet.

Materialer og Metoder

Tumor eksemplar

en IMC cellelinie (IPC-366) blev etableret fra en hund primær IMC prøve opnået umiddelbart efter aflivning af en hunhund klinisk og histopatologisk diagnosticeret med IMC, efter de hidtil IMC diagnostiske funktioner offentliggjort for denne art [1, 19] : hastigt voksende sygdom i mælkekirtlerne og overliggende hud, med erytem, ​​fasthed, varme, ødem, fortykkelse, og tegn på smerte, ifølge den forelæggende veterinære kliniker. Den oprindelige hunde brysttumor blev diagnosticeret som et faststof carcinom med multipel tumor emboli i overfladiske dermale lymfekar (fig. 1), hvilket bekræfter diagnosen af ​​IMC [2, 20]. Efter eutanasi blev tumorprøver hurtigt opnået ved obduktion og forarbejdet til histopatologisk bekræftelse af IMC og cellekultur. Tumorfragmenter (1,5 cm) blev anbragt i Modified Eagles Medium (MEM) med penicillin-streptomycin-opløsning (Sigma-Aldrich, Madrid)

Tumor paraffinsnit, H paraffin sektion, H markant anisocytose og anisokaryosis og tydelige nucleoli. Endotel-lignende celle (ELC), der viser cytoplasmatisk frirum (pil). IPC-366 ultrastrukturelle træk blev evalueret ved elektronmikroskopi. Cellerne havde rigelige cytoplasmatiske projektioner, mange organeller og proteinholdige sekretoriske produkter. Ved elektronmikroskopi, de klare cytoplasmatiske vakuoler ses af optisk mikroskopi, resulterede tomme rum foret med cytoplasmatiske membraner, der lejlighedsvis samles til et indre hulrum (ELCs, vaskulogen efterligning). (. Figur 3C-H)

A og B) Semithin sektioner farvet med toluidin blå (40X).; nogle endotelceller-lignende celler observeres (pile). C til H) Ultraestructure i ultratynde sektioner. C) Celler med store kerner og tydelige nucleoli. Mitose (pil). D) Enkelt celle med aflang kerne, meget tydelige kernelegeme og talrige organeller, vakuoler og proteinholdigt sekretion. E) Tumor degenereret celle med indskrumpet kerne og rigelig proteinholdigt sekretion. F) Cytoplasma af en tumor celle indeholdende talrige organeller (mitochondrier, endoplasmatisk reticulum) og en sekretorisk vacuole. G) Tumor celle med tre cytoplasmatiske tomme rum (asterisker) er omfattet af cytoplasmatisk membran; progression til et cytoplasmisk “lumen” karakteristisk for endotelceller-lignende celler. Evident kernelegeme. H) Binucleate tumor celle med en cytoplasmatisk central tom plads ( “lumen”, stjerne) (ELC) ligner en kapillær fartøj (vaskulogen mimik). Fig. E og G viser forskellige felter fra samme gitter. Ved 25

th passage blev celler kryogene oplagring (-180 ° C). Re-dyrkede præsenteret optøede celler tilsvarende vækst og morfologiske karakteristika med en levedygtighed på 95-99%. Den fordoblingstid af IPC-366 celler ved 30

th passage var cirka 24 timer, og cellerne nåede et plateau på dag 6 (fig. 4).

Tumorigenicitet

indsprøjtet IPC-366 celler i den ventrale side af Balb /SCID-mus stammer tumorer efter 2 ugers inokulation (100% af inokulerede mus, n = 10, længde: 0,6 og 0,9 cm

3, bredde: 0,2 og 0,4 cm

3). To uger efter observation af xenotransplanted tumorer deres størrelse var op til 1,5 cm

3 og mus blev aflivet (længde: mellem 1,3 og 1,7 cm

3, og bredde: mellem 0,8 og 1,2) (. Fig 5A) . Den histologiske undersøgelse afslørede en meget infiltrere, dårligt afgrænsede, uindkapslet tæt cellulær neoplastisk vækst, der strækker sig til dermis og tværstribede muskler. Neoplastiske celler arrangeret i faste masser med ringe stromale og havde lignende morfologi og malignitet der er beskrevet for IPC · 66. Mitoseindekset var meget høj og atypiske mitose blev hyppigt observeret. (Fig. 5B-C). Tilstedeværelsen af ​​emboli på dermis kapillærer (fig. 5D) bekræftede histologisk karakteristisk for inflammatorisk brystcarcinoma. Tilstedeværelsen af ​​vaskulogen mimicry (stærkt maligne tumorceller ligner endotelceller og omgivende vaskulære rum (vaskulogen mimicry) (fig. 5E), var en hyppig fund.

A) IPC-366 mus xenotransplantater på fire uger (pil ). B til E: tumor paraffinsnit H markant ødem i dermis (4X). D) Meget maligne tumorceller med markant anisocytose og anisokaryosis; tydelige nucleoli (40X) .D) Mikrovaskulære kanaler linet op ved neoplastiske celler (vaskulogen mimicry, pile) (20X).

immunhistokemisk karakterisering af IPC-366 fænotype

Primær hunde inflammatoriske brystcarcinom og IPC-366 celler præsenterede lignende immunoreaktion til immunofænotype markører, der anvendes. De var positive med et generelt epitelcelle markør (pancytokeratin, AE1 /AE3), og et basalt cellemarkør (CK14), med en 95,11% og 92,58% af positive celler i pelleten, (fig. 6A-B). Alle prøver havde også en positiv reaktion på vimentin, der viser IPC-366 en 81,14% af positive celler i pillerne. (Fig. 6C). Myoepithelial cellemarkører P63 og actin var negative (fig. 6D-E), samt hormonelle receptorer (ER, PR), og HER-2. (Fig. 6F-H). Mere end 90% af IPC-366 overudtrykt E-Cad (fig. 6I) og COX-2 (fig. 6J-K). COX-2 immunomærkning var meget stærk i 10% af cellerne. Alle prøver havde en høj proliferationshastighed målt med Ki-67. Den gennemsnitlige Ki-67 spredning indeks over IPC-366 i pellets var 87,15% (Fig 6L.)

A) Pancytokeratin (AE1 /AE3) (10X).; intens immunolabeling og talrige positive celler. B) CK14; intens immunolabeling og talrige positive celler (10X). C) vimentin; moderat immunolabeling og talrige positive celler (10X). D) p63; negativ (20X). E) α-glatmuskelactin, negative celler (10X). F) Estrogen receptor; negative celler (20X). G) Progesteron receptor; negative celler (20X). H) HER-2; negative celler (20X). I) E-cadherin; intens membranøs immunmærkning i talrige celler (20X). J) COX-2; de fleste af cellerne er moderat positiv; nogle celler er intenst positive (10X). K) COX-2; nogle celler stærkt positiv Viser funktioner for malignitet (binucleated celle, pil) (40X). L) Ki-67 proliferationsmarkør; mange kerner er positive (10X).

Cytogenetisk analyser

Analysen blev foretaget efter to cellecykler, Cellerne blev delt for kromosomafvigelser (AC) test og Karyotype. Fire hundrede celler blev undersøgt, og 69% af cellerne viste normal karyotype (2n = 78). På den anden side undersøgte metafaser detekteres mindst én eller flere abnormiteter i 31% af cellerne (tabel 2). De autosomerne kromosomer har lignende morfologi, antallet og alle af dem er acrocentriske, og kromosomet X metacentriske. 2% af de observerede celler har numerisk aberration involverer kromosomer X, 12 og 17 ved hjælp af ideogram for G banding analyse i Hund [24, 25]. AC test afslører, at 30% af cellen set har pauser:. 15% kromatisk, 8% chromosomic aberration og 6% huller

Diskussion

IMC og IBC er en undertype af aggressiv brystcancer, der påvirker kvindelige hunde og mennesker henholdsvis [1, 2, 26].

In vitro

studier under anvendelse etablerede kræft cellelinjer tilbyde viden om progression og væksten af ​​brystkræft i almindelighed og IBC i særdeleshed [11, 12]. Der er få modeller til rådighed til undersøgelse af biologi IBC [10, 12, 15]. De fleste undersøgelser er blevet udført ved hjælp af cellelinjer, såsom SUM190 og SUM149. SUM149 er en tredobbelt negativ cellelinie mens SUM190 er ER /PR negative og HER-2 positiv. Andre mindre studeret IBC cellelinjer er: MDA-IBC3, KPL4 og WIBC-9 (alle ER /PR negative og HER-2 positiv). I det forløbne år er det blevet beskrevet og karakteriseret den nye FC-IBC02 cellelinje [15]. Canine IMC deler mange kliniske, biologiske og patologiske egenskaber med sygdommen hos mennesker, derfor er det blevet foreslået som en god spontan dyremodel til undersøgelse den humane sygdom [2]. Ikke desto mindre, at vores bedste viden, IPC-366 er den første hunde IMC cellelinje etableret.

IPC-366 cellelinje gengivet de histologiske træk af hundens primære tumor. Det er en meget aggressiv, stærkt malign cellelinie, inokuleret til Balb /SCID-mus kan stamme tumorer, der gengiver de histologiske træk ved den primære hunde IMC: en meget infiltrativ tumor komponeret af anaplastisk celler med lymfatisk invasion af de overfladiske dermale lymfekar, idet denne sidstnævnte karakteristik den histologiske kendetegn for både IBC og IMC histologiske diagnoser [2, 5, 26]. IPC-366 også bevaret den oprindelige hunde mamma IMC immunofænotype. Ifølge de immunohistokemiske resultater, IPC-366 er positivt for panCK, CK14 og vimentin, og negativ for actin, P63, ER, PR, HER-2, hvilket indikerer, at denne cellelinie er en basal epitelcellelinie.

Multimodal behandling til patienter med IBC omfatter kemoterapi, efterfulgt af aggressiv strålebehandling og kirurgi. Som i andre ikke-IBC brystcancere, er anti-HER-2 eller anti-hormonal målrettet terapi anvendes i positive patienter til disse molekyler [4]. På trods af dette, overlevelse af patienter med IBC er meget kort [4]. Overlevelse er endnu kortere i triple negativ IBC tilfælde (TN IBC, negative tumorer til ER, PR og HER-2), der er særligt resistente over for de behandlinger [27].

Triple negativ brystkræft (TNBC) tegner sig for ca. 10-15% af brystkræfttilfælde og har en dårligere prognose end positive hormon receptor patienter [28-30]. Denne type af brystkræft også et resultat karakteristisk for aggressivitet, invasiv, tidlige metastaser og ikke reagerer på terapeutiske mål [28], og behandles oftest med kemoterapi [30].

In vitro forskning i TN-IBC gennemføres hovedsagelig på den tredobbelte negative cellelinie SUM149. Denne cellelinie er blevet anvendt til at identificere genetiske faktorer i IBC fænotypen [10]. Immunohistokemiske resultater viste, at IPC-366 manglede ER, PR og HER-2-ekspression, at være en anden ny triple negativ cellelinie, der kan anvendes til forskning i nye terapeutiske mål.

Cellelinien IPC-366 præsenteres som en basal epitelial cellelinje med mesenkymale karakteristika: positiv immunoexpression til pancytokeratiner (AE1 /AE3) (generel epitelcelle markør), cytokeratin 14 (for basale epitelceller) og vimentin (generel mesenchymale markør). Co-ekspression af cytokeratiner og vimentin er blevet beskrevet i brysttumorer forbundet til malignitet [31, 32]. Vimentin ekspression er også forbundet med en stigning af malignitet af cellerne i kultur [31]. Således immunoexpression profil afslørede, at IPC-366 indeholdt i en basal-lignende subtype cellelinie med epitel-mesenkymale overgang (EMT) [33]. Den basale-lignende subtype er kendetegnet ved en negativ ekspression af ER, PR og HER2 afsluttet med en CK14 og vimentin positive [28]. SUM149, en veletableret IBC cellelinie er også af basal ligesom subtype [12]. Det faktum, at hunde IPC-366 cellelinje aksjer fænotypiske karakteristika med den menneskelige SUM149 cellelinie vil tillade sammenlignende prækliniske studier i en fremtid. Negativ immunoexpresion til myoepithelial cellemarkører P63 og actin indikerer, at IPC-366 er ikke af myoepithelial oprindelse. I modsætning til human brystcancer, hunde brystcancer har hyppige myoepithelial proliferationer fører til komplekse og blandede tumorer [20]. Fraværet af en myoepithelial celle afstamning i IPC-366 vil yderligere lette ordentlig sammenlignende undersøgelser. Disse resultater viste epitel oprindelse IPC-366 og købet af mesenkymale egenskaber samt fraværet af myoepitelcellerne i denne cellelinie. Således IPC-366 celler er et eksempel på epitelial-mesenkymale overgang. EMT er en proces impliceret i tumorudvikling førende epitelceller bliver til mesenchymale celler [34, 35]. Købet af mesenkymale fænotype involveret tabet i epitel markører udtryk samt gevinst celle motilitet og tumor invasion øget [36]. IPC-366 overudtrykt COX-2 i 90% af cellerne. For nylig er overekspression af COX-2 blevet relateret til EMT og invasivitet i brystcancercellelinier [37].

E-cadherin overekspression i IPC-366 er også blevet demonstreret. E-cadherin er en celle-celleadhæsion-protein i epitelvæv kodet af tumorsuppressorgen CDH1. Det er kendt, at mutationer i CDH1 forøget proliferation og tumorinvasion og metastase [38-40]. , Tab af funktion af E-cadherin spiller således en meget vigtig rolle i EMT og tumor overlevelse [40, 41]. Det vides, at i IBC E-cadherin overudtrykkes og lokaliseret omkring tumoren cellemembranen, som tegner sig for dannelsen af ​​lymphovascular embolus [42, 43].

IPC-366 er også kendetegnet ved en høj proliferation målt ved en vækst-assay og en Ki-67 indeks (87,15%), hvilket sikrer in vitro-undersøgelser. Ki-67-ekspression er blevet associeret med dårlig prognose i maligne brysttumorer både hos kvinder og hunde [22, 44]. IPC-366 havde højere proliferationsindeks end den oprindelige tumor, tyder på en stigning af proliferativ kapacitet, sandsynligvis ved udvalg af de maligne celler. Den cytogenetisk analyse viser tilstedeværelsen af ​​strukturelle aberration, numeriske og neutrale rearrangementer, viser en kromosomal ustabilitet. Disse data kan korreleres med resultaterne hos patienter med inflammatorisk brystkræft og anvendelse af mere følsomme og specifikke metoder såsom SKY, CGH Southern blot-analyse og studier af ekspressionsmønster med cDNA microarray chips ville øge viden om genetiske afvigelse og konserverede segmenter HVEM KAN åbne vinduet for at fundet genetiske markører. Histologiske træk af malignitet i den primære hunde brysttumor og cellelinjen var ens med markante anisokaryosis og anisocytose. Den typiske morfologi af endotheliale-lignende celler, som er blevet relateret til den vaskulogen mimicry (VM) fænomen [7, 8] blev observeret på samme måde i den primære tumor og det afledte cellelinie. Tilstedeværelsen af ​​ELCs bør betragtes som en interessant første resultat, der fortjener yderligere specifik forskning. I de afledte mus tumorer, foruden observation af ELCs, var det muligt at finde store kanaler af VM. Den højere andel af højt maligne flerkernede celler findes i IPC-366 og i den transplanterede tumor i mus kunne også repræsentere tidlige stadier af VM i højt udifferentierede ELCs, selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte denne bekræftelse. Dette fænomen defineret som vaskulogen mimicry blev først beskrevet i human melanom og [45] består i frembringelsen af ​​vaskulære kanaler ved maligne tumorceller, der erhverver endothelceller egenskaber og giver de blodforsyning kræves for tumorvækst og metastase. Frembringelsen af ​​funktionelle vaskulære kanaler ved tumoren er en markør for malignitet tumor-fænotype [45, 46]. Vaskulogen efterligning vises ikke i alle typer af kræft, men det ofte forekommer i IBC [47] og IMC [7]. For nylig blev det også identificeret i xenotransplantater fra IMC [48].

Halvfems procent af IPC-366-celler var positive for COX-2. Nogle celler, herunder ELCs, var intenst positive for COX-2. COX-2 spiller en rolle i den invasive og angiogen fænotype af IBC [49], og det har været forbundet med lymfangiogene pathway stimulation i IMC [8]. Forholdet af COX-2 med tumor ekstravasation, tumorcelleoverlevelse og fjernmetastase re-initiering er blevet beskrevet [50]. COX-2 er angivet til at være en markør for ELCs involveret i VM [7, 8, 51]. Selv er nødvendige for at karakterisere de angiogene karakteristika IPC-366 flere undersøgelser, kan denne cellelinje udgør en meget interessant model for studiet af VM og andre angiogene egenskaber IMC.

En rolle for COX-2 som en stamcellemarkør er blevet postuleret for nylig [52]. De stamceller egenskaber IPC-366, der efterforskes, er ikke formålet med denne undersøgelse, men den høje andel af COX-2-positive celler og tilstedeværelsen af ​​talrige ELCs tyder på, at antallet af stamceller kunne være høj. Fuldføre fremtidige undersøgelser af stamcelle-fænotype vil dilucidate dette aspekt af IPC-366 cellelinje.

Fast tumorigenicitet er en anden meget vigtig egenskab ved IPC-366. Denne cellelinie er i stand til at reproducere tumorer

in vivo

meget hurtigt, uden at miste sine oprindelige egenskaber, der tillader at studere neoplastisk vækst i et biologisk dyr miljø. Selvom det er en meget værdsat egenskab, ikke alle de etablerede cellelinjer er i stand til at reproducere tumorer

in vivo

. MCF7 vokser ikke i mus, selv om andre tumorigene IBC cellelinjer, såsom SUM149 eller SUM190 frembringe tumorer i SCID mus xenotransplantater efter 6-8 uger efter injektion af celler ind brystfedtpude [53]. Xenografter fra IPC-366 i Balb /SCID-mus voksede i 3 uger med en frekvens på 100%, hvilket viser, at denne cellelinie havde en hurtigere vækst

in vivo

. IBC og IMC har en stærk tendens til at metastasere og invadere lymfekar [1, 5, 42]. IPC-366 xenografter i mus viste spontane metastaser i lunge- og lymfeknuder med en frekvens på 100% (alle injicerede dyr lider metastaser). Derfor kunne IPC-366 betragtes som en god model for studiet af metastatiske mekanismer

in vitro

in vivo

. Der er ingen IBC eller brystcancercellelinier med dette høje kapacitet af metastaser i de tilsvarende xenotransplanted mus; som et eksempel, SUM149 producerer metastaser i lungerne med en frekvens på 2/3 [53]

I de sidste år er der etableret flere hunde mamma kræftceller linjer:. DTK-E og DTK-SME [17