PLoS ONE: proteomiske Undersøgelse betulinsyreinduceret apoptose for Human Livmoderhalskræft HeLa-celler

Abstrakt

Betulinsyre er en pentacyklisk triterpenoid der udviser anticancer funktioner i humane cancerceller. Denne undersøgelse dokumenterer, at betulinsyre er yderst effektiv mod den humane cervikale cancercellelinie HeLa ved fremkaldelse dosis- og tidsafhængig apoptose. Den apoptotiske proces blev yderligere undersøgt ved anvendelse af en proteomics tilgang at afsløre proteinekspressionssystemer ændringer i HeLa-celler efter betulinsyre behandling. Proteomisk analyse afslørede, at der var seks op- og tredive nedregulerede proteiner i betulinsyreinduceret HeLa-celler, og disse proteiner blev derefter underkastet funktionel pathway analyse ved anvendelse af flere analysesoftware. UDP-glucose-6-dehydrogenase, 6-phosphogluconat dehydrogenase decarboxylering, kæde A Horf6-et hidtil ukendt humant peroxidase enzym, som er involveret i redox proces, viste sig at være nedreguleret under apoptose processen med den oxidative stressreaktion pathway. I overensstemmelse med vores resultater på proteinniveauet, blev en stigning i intracellulær reaktive oxygenarter observeret i betulinsyrebehandlede celler. Den proteiner glukose-reguleret protein og fragt-udvælgelse protein TIP47, der er involveret i det endoplasmatiske reticulum vej, var opreguleret af betulinsyre behandling. I mellemtiden 14-3-3 familie proteiner, herunder 14-3-3β og 14-3-3ε blev nedreguleret som respons på betulinsyre behandling, hvilket er i overensstemmelse med faldet i ekspressionen af ​​target-gener

14 -3-3β

og

14-3-3ε

. Desuden blev det konstateret, at den antiapoptotisk

bcl-2

genet blev nedreguleret mens proapoptotiske

Bax

genet blev opreguleret efter betulinsyre behandling i HeLa-celler. Disse resultater antyder, at betulinsyre inducerer apoptose af HeLa-celler ved at udløse både det endoplasmatiske reticulum pathway og ROS-medierede mitokondriel pathway

Henvisning:. Xu T, Pang Q, Zhou D, Zhang A, Luo S, Wang Y, et al. (2014) proteomiske Undersøgelse betulinsyreinduceret apoptose for Human livmoderhalskræft HeLa-celler. PLoS ONE 9 (8): e105768. doi: 10,1371 /journal.pone.0105768

Redaktør: Daniela Flavia Hozbor, Universidad Nacional de La Plata, Argentina

Modtaget: April 18, 2014 Accepteret: 26 Jul 2014; Udgivet: 22 August, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af skovbruget Research særlig fond for Public Welfare (201004069) og Grundforskning Midler til de centrale universiteter ( DL13EA02-03). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

betulinsyre (3β-hydroxy-lup-20 (29) -en-28-syre) (BA) er et naturligt forekommende lupane-typen triterpen findes i barken af ​​hvide birketræer. BA spiller en afgørende rolle som en kilde til potentielle anticancer-forbindelser [1]. In vitro undersøgelser har vist, at dette middel er kraftigt effektivt mod en bred række af cancerceller, herunder melanom, leukæmi, coloncarcinom, lungecarcinom, prostatacarcinom og multipel myelom [2] – [8], samtidig, BA og dets analoger kan anvendes som potentielle lægemidler for HIV-1 infektion [9], [10]. Det er velkendt, at mitokondrierne spiller en vigtig rolle i den indre vej af pattedyr apoptose. Et fald i den mitokondriske indre transmembranpotentiale er forbundet med BA behandling, hvilket antyder, at den indre mitokondrielle pathway er involveret i BA-induceret apoptose. Det mitokondriske pathway indledes med frembringelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) og reguleres af Bcl-2-familien af ​​proteiner, som består af prosurvival (f.eks Bcl-2, Bcl-XL og Mcl-1) og proapoptotiske (Bax , Bad og BH3-kun proteiner) medlemmer [10], [11]. BA er blevet vist at inducere apoptose i en CD-95 og p53-uafhængig måde ved en direkte virkning på mitokondrier [4], [12], [13]. Formationer af ROS og protein neosynthesis er blevet rapporteret at være nødvendig for BA-induceret celledød [14], [15], [16]. En tidligere undersøgelse af apoptose ved BA fandt, at mitokondrielle pathway blev hæmmet af Bc-2 /Bd-XL overekspression i humane myelomatoseceller [15], BA inducerer apoptose primært gennem et mitokondrie vej med tumor specificitet.

cervikal cancer er den tredje mest almindelige type tumor hos kvinder [17]. Adskillige behandlinger anvendes for livmoderhalskræft, men hver af dem har alvorlige bivirkninger. Derfor er det stadig nødvendigt at finde en sikrere og mere effektiv behandling. BA er en plante-afledt pentacyklisk triterpenoid der er toksisk for cancerceller, men det har ingen virkning på ikke-transformerede celler [1], [2], [8]. Det er blevet rapporteret, at BA inducerer antiproliferativ aktivitet på livmoderhalskræft [18], men de molekylære mekanismer i denne proces er ikke fuldt forstået.

Hovedformålet med den foreliggende undersøgelse er at undersøge de underliggende molekylære mekanismer i potentielle anticancer effekter af BA på humane livmoderhalskræft celler. Global proteom profilering førte til identifikation af flere veje, der reagerer på BA behandling og hjalp til bedre at forstå BA apoptose-relaterede mekanismer. I dette arbejde, vi karakteriserede apoptose-relaterede protein profil BA-behandlede HeLa-celler under anvendelse af en komparativ 2-DE proteomics tilgang. De molekylære funktioner og biologiske processer, der er involveret i mekanismen for BA-induceret apoptose vil blive drøftet. Ændringer i ekspressionen af ​​fire gener, der koder apoptose-relaterede proteiner blev analyseret ved at udføre real-time PCR (QRT-PCR) analyse.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og Proliferation Assay

BA blev købt fra Boyle Chemical CO., LTD (Shanghai, Kina). Den humane cancercellelinie HeLa blev købt fra tumoren Center (Beijing, Kina). Celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) med 10% FBS (PAA, Østrig), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Hyclone, Logan, UT, USA). Celler blev podet i mikroplader med 96 brønde og derefter inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2. Efter 24 timer blev mediet fjernet og erstattet med frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af BA. Dernæst blev 30 pi 3 mg /ml MTT (Amresco, USA) i PBS tilsat til hver brønd, og derefter pladen blev yderligere inkuberet i 4 timer. Den resterende supernatant blev fjernet, og 150 pi DMSO blev tilsat til hver brønd og blandet grundigt for at opløse de formazankrystaller, der dannes. Efter 10 minutters inkubation blev absorbansen af ​​hver brønd aflæses ved 490 nm under anvendelse af en BioTek-ELISA-pladelæser (BioTek Instruments, Winooski, USA). Koncentrationen af ​​BA inhibere cellevækst med 50% (IC50 værdi) blev beregnet ud fra dosis-respons-kurver. Alle bestemmelser blev udført tre gange.

morfologiske ændringer

For at påvise morfologiske ændringer, der skete i løbet af apoptose, blev nukleare farvning udført ved hjælp af en 5 ug /ml Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO blev USA) plet, og prøver visualiseret ved hjælp af et Nikon fluorescens mikroskop (ECLIPSE Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan) [19].

Flowcytometrianalyse af celle apoptose

BA induceret apoptose blev observeret ved AnnexinV-FITC /PI-farvning (Beyotime Biotech, Beijing, Kina) ifølge producentens instruktioner. Flowcytometri (PARTEC Flowcytometri, Tyskland) blev anvendt til at analysere forskellene i apoptose mellem kontrol og BA-behandlede (15 pmol /l, 30 pmol /L og 50 pmol /L) celler ved 48 timer efter behandling. Cellerne blev indsamlet og analyseret ved at tælle normale celler, debuterende apoptotiske celler og sene apoptotiske /nekrotiske celler i tre synsfelter af mikroskopet. Købet og dataanalyse blev udført ved hjælp af Flagyl software. Celler blev behandlet som beskrevet i producentens protokol og analyseret i tre eksemplarer.

Protein forberedelse til 2-DE-

Hela-celler behandlet med 30 mmol /l BA blev høstet efter 48 timers inkubation. Celler blev vasket to gange med iskold PBS, derefter ekstraheret med lysispuffer indeholdende 7 mol /l urea, 2 mol /L thiourinstof, 4% CHAPS, 2% pH 3-10 /4-7 lineær IPG buffer (GE Healthcare, USA ), 20 mmol /L dithiothreilol (DTT, Sigma, USA), 40 mmol /l Tris (Sigma, USA) og fuldstændig mini EDTA-fri proteaseinhibitor cocktail (Roche, USA). Efter sonicating10 gange i 30 sekunder med 30 s pauser i et is-vand-bad og derefter inkubere ved 4 ° C i 1 time, blev cellelysater centrifugeret ved 14.000 rpm i 1 time ved 4 ° C. Proteiner i den resulterende supernatant blev kvantificeret ifølge Bio-Rad-protein-assay reagens ifølge Bradford-metoden (Bio-Rad, Hercules, USA) [19].

To-dimensional gelelektroforese

celle proteinlysater (130 ug) blev blandet med rehydrering opløsning indeholdende 7 mol /l urea, 2 mol /L thiourinstof, 2% CHAPS, 0,5% IPG buffer og 0,002% bromphenolblåt og DTT til et endeligt volumen på 450 pi. Færdigstøbt 24-cm immobiliseret pH-gradient strimler (IPG, pH 3-10, pH 4-7, GE Healthcare) blev rehydreret i 12 timer ved 30 V. separation på en Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, Tyskland) blev udført med den følgende parametre: 100 V i 2 h, 200 V i 1 time, 500 V i 1 time 1000 V i 1 time og 8000 V i 3 timer, efterfulgt af et trin og hold mønster af 8000 V i 8 timer. Efter isoelektrisk fokusering blev strimlerne inkuberet i 15 minutter i ligevægt opløsning I (6 mol /l urea, 2% SDS, 30% glycerol, 1% DTT, 0,002% bromphenolblåt, 50 mmol /L Tris-HCI, pH 8,8) og i yderligere 15 minutter i ækvilibrering opløsning II (1% DTT blev erstattet med 2,5% iodacetamid). Efterfølgende blev IPG-strimler flyttet til toppen af ​​polyacrylamidgeler og indlejret under anvendelse af 0,5% (w /v) agarose indeholdende bromphenolblåt. To-dimensional SDS-PAGE blev udført ved 25 ° C og 3,5 vægt /gel i 30 minutter og derefter indtil bromphenolblåt farvefronten ankom i bunden af ​​gelerne 17,5 m /gel i 4 timer 30 min under anvendelse af Ettan Dalt seks systemet (GE Healthcare). Geler blev fikseret i en blanding af 40% ethanol og 10% iseddike natten over. Proteiner blev visualiseret ved sølvfarvning, og gel billeder blev erhvervet ved hjælp af en ImageScanner (GE Healthcare) med Image Master 2D Platinum Software Version 7.0 (GE Healthcare). For at opnå pålidelige resultater fra 2-DE-billeder, var pletter godt løst i de tre biologiske gentagelser. En måling blev foretaget for hver biologisk replikat, og normaliserede mængder blev beregnet ved hjælp af den samlede procedure spot volumen normalisering af softwaren. Den normaliserede volumen af ​​hver plet blev antaget at repræsentere dets ekspression overflod. Kun de pletter, der ændrede konsekvent og markant (mere end 1,5 gange og

s

0,05). Blev udvalgt til massespektrometri analyse

Massespektrometri og protein klassifikation

peptid MS og MS /MS blev udført på et ABI 5800 MALDI-TOF /TOF Plus massespektrometer (Applied Biosystems, USA). Data blev erhvervet i en positiv MS reflektor ved hjælp af en CalMix5 standard til kalibrering af instrumentet (ABI5800 Calibration Blanding). Både MS og MS /MS-data blev integreret og behandles ved hjælp af GPS Explorer v3.6 software (Applied Biosystems, USA) med standardparametre. Baseret på kombineret MS og MS /MS-spektre blev proteiner med succes identificeret på basis af 95% eller højere konfidensinterval på deres scorer i MASCOT V2.3search motor (Matrix Science Ltd., UK), ved hjælp af følgende søgeparametre: NCBInr-humandatabase ; trypsin som fordøjelsen enzym; en savnet spaltningsstedet; faste modifikationer af Carbamidomethyl (C); delvise ændringer af Acetyl (Protein N sigt), Deamideret (NQ), Dioxidation (W), Oxidation (M); 100 ppm for forstadie ion tolerance og 0,5 Da for fragment ion tolerance.

Baseret på PANTHER klassificering (version 7.2, https://www.pantherdb.org/), molekylær funktion og biologisk proces af tilsvarende identificeret proteiner blev klassificeret [20]. Proteinet interaktion netværk genereret med STRING (version 9.05, https://string-db.org) afslørede de funktionelle forbindelser mellem forskellige proteiner [21], [22].

Måling af oxidativt stress

niveauerne af intracellulært ROS blev bestemt under anvendelse af et ROS assaykit (Beyotime Biotech, Kina) ved at følge fabrikantens protokol. Celler blev høstet efter 48 timer på 30 pmol /L BA behandling og derefter vasket to gange med PBS og inkuberet med DCFH-DA (10 pmol /l) ved 37 ° C i 40 min i et mørkekammer til endelig analyse ved flowcytometri. Alle bestemmelser blev udført tredobbelt.

RNA-isolering og QRT-PCR-analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA). Revers transkription blev udført under anvendelse af en PrimeScriptTM revers transkriptase (Takara, Tokyo, Japan), og transkripter blev derefter underkastet QRT-PCR under anvendelse af en SYBR Green PCR-reagenser Kit (Takara, Tokyo, Japan). Kvantitative assays blev udført tre gange ved anvendelse af 1 pi cDNA (1:10 fortynding) og en SYBR Green Master mix (Takara, Tokyo, Japan) og analyseret ved anvendelse af et ABI 7500 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems, USA). Amplifikationen af ​​glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol og normalisere dataene. Detaljerne for de anvendte primere er vist i tabel 1 [23].

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) for tredobbelte prøver. Statistisk analyse blev udført med statistik software (SPSS-version 17.0). Data blev analyseret ved anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferronis multiple sammenligninger. En værdi på

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekt af BA på proliferation og apoptose af HeLa celler

HeLa-celler. behandlet med forskellige koncentrationer (15 pmol /l, 30 pmol /l, 50 pmol /L) af BA i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Cellelevedygtigheden viste et generelt fald med stigende koncentrationer af BA i varighed mediet og behandling som analyseret ved en MTT assay (fig. 1A). Dette resultat antyder, at BA inhiberer proliferation af HeLa-celler på en dosis- og tidsafhængig måde. IC

50 var 30,42 ± 2,39 uM når HeLa celler blev behandlet med BA i 48 timer.

(A) Effekt af BA mod Hela celler som bestemt af MTT-analysen. Celler blev behandlet med koncentrationer af BA (0 pmol /l, 15 pmol /l, 30 pmol /l, 50 pmol /L) for angivne tid (24 timer, 48 timer, 72 h). Værdierne for hver BA-koncentration testede repræsenterer gennemsnit af tre forsøg, er datas præsenteret som gennemsnitlige middelværdi ± SD; **

s

0,01 sammenlignet med kontrolgruppen (0 mmol /l BA). (B) Hoechst 33258-farvning af HeLa-celler behandlet med 15 mmol /l, 30 pmol /L BA. Røde pile angiver flere apoptotiske celler med typisk kondensering af kromatin.

For at afgøre, om den antiproliferative aktivitet induceret af BA på HeLa-celler blev medieret af induktion af apoptose, vi evalueret apoptose ved morfologisk undersøgelse ved hjælp af fluorescens mikroskopi og flowcytometri. Efter behandling med 15 pmol /L og 30 pmol /L BA i 48 timer blev HeLa-celler farvet med 5 pg /ml Hoechst 33258 og visualiseret med fluorescerende mikroskopi. Den typiske morfologi af apoptose blev påvist i BA-behandlede HeLa-celler (fig. 1B). Dette afslørede var der en betydelig stigning i procentdelen af ​​apoptotiske celler efter BA behandling sammenlignet med kontrol celler. Desuden BA forårsagede dosisafhængig apoptose som angivet ved annexinV-FITC /PI anvendelse af flowcytometri. Den totale procentdel af apoptotiske celler var 20,53 ± 0,81% (13,45 ± 0,80% af celler tidligt apoptotiske og 7,07 ± 0,51% af celler sent apoptotiske) og 38,56 ± 1,79% (30,92 ± 1,22% af celler tidligt apoptotiske og 7,64 ± 0,53% af celler sent apoptotiske) for celler behandlet med 30 pmol /L og 50 pmol /L BA ved 48 timer henholdsvis (som vist i fig. S1).

2-DE-analyse af forskelle i proteinekspression induceret af BA

Proteomics er en kraftfuld platform for at undersøge protein-ekspression og modifikation som reaktion på specifikke fysiologiske forhold i biologiske systemer. De proteomer kontrol- og 30 pmol /L BA-behandlede HeLa-celler blev analyseret ved 2-DE. To gradient-range IPG strips (pH 3-10 og 4-7) blev anvendt som den første dimension. Repræsentative 2-DE-protein mønstre i pI-regionen i 3-10 viste, at proteiner hovedsagelig fokuseret på pH-området fra 4.2 til 7,0 (fig. 2A). For yderligere at adskille denne prøve blev smal-range pH-gradienter (4-7), der anvendes (fig. 2B), så vi kan øge både protein belastning på geler og opløsningen af ​​proteinerne i dette område. Protein- pletter med ændringer end 1,5 gange (

s Restaurant 0,05) blev derefter udsat for proteinidentifikation ved MALDI TOF /TOF-MS-analyse (tabel S1). I alt 18 proteinpletter fra den brede vifte IPG-baserede 2D-geler (pH 3-10) og 19 proteinpletter fra snævrere område IPG-baserede 2D-geler (pH 4-7) viste reproducerbare og statistisk signifikante ændringer i BA-behandlede prøver sammenlignet med kontrolprøver (fig. 2). Proteiner fra alle de protein spots lykkedes identificeret af MS og MASCOT database søgninger med høj tillid (tabel 2). Proteinprofilering (pH 3-10) afslørede 5 opreguleret proteiner og 13 nedreguleret proteiner i BA-behandlede celler. Derudover proteinprofilering (pH 4-7) afslørede 1 opreguleret protein og 18 nedreguleres proteiner i BA-behandlede celler. Uventet, var der kun 1 protein (gi4826760) i overlapningen mellem pH 3-10 (Spot NO. 868), og pH 4-7 (Spot NO. 626) geler.

(A) 2-DE blev udført med 130 ug protein under anvendelse 24-cm pH 3-10 NL IPG strips og 12,5% SDS-PAGE. (B) 2-DE blev udført med 130 ug protein under anvendelse 24-cm pH 4-7 NL IPG strimler og 15% SDS-PAGE. De geler blev visualiseret ved sølvfarvning og analyseret med Image Master Software.

Funktionelle kategorier af differentielt udtrykte proteiner

For bedre klassificere de identificerede proteiner, to uafhængige grupper af gen ontologier blev anvendt til at beskrive funktionen af ​​genprodukterne: molekylære funktion og biologiske processer, som identificeret ved PANTHER klassifikationssystemet. Fordi EEF (gi530425157, spot 932) var fast besluttet på at være den samme som EEF2 (gi4503483, spot 673) og GLOD4 (gi4929769, spot 146) blev ikke identificeret af klassifikationssystem PANTHER blev 34 ændret proteiner analyseret af softwaren. De identificerede proteiner blev kategoriseret i 9 grupper baseret på biologiske processer: metaboliske processer (31,90%), cellulære processer (19,10%), cellulære komponent organisation eller biogenese (14,90%), udviklingsprocesser (10,60%), lokalisering (10,60%), biologisk regulering (4,30%), reaktion på stimulus (4,30%), flercellede organismal processer (2,10%) og immunsystemet processer (2,10%) (fig. 3A). BA behandling inhiberede protein foldning (plet 81, 655, 1109, 613, 981), hvilket er vigtigt for proteinbiosyntese. Desuden er glykolyse (spot 372), oversættelse (spot 673, 885) og mRNA splejsning (spot 868) er involveret i metaboliske processer og blev nedreguleret af BA-behandling. BA undertrykker mest biologiske processer til at blokere normale metaboliske processer, såsom cellulære processer (spot 361, 128, 1087, 970, 823, 991, 842), udviklingsprocesser (spot 361, 128, 1087, 970), lokalisering (spot 120, 970, 991), at svarene stimulus (spot 81), flercellede organismal processer (spot 81), og immunsystemet processer (spot 81). Faktisk er nogle proteiner involveret i flere biologiske processer, og proteiner, der var involveret i cellulære processer bidrog også til cellulær komponent organisation (spot 361, 128, 1087, 970). Ifølge deres molekylære funktion blev de modulerede proteiner klassificeret i 5 grupper: katalytisk aktivitet (36,00%), strukturel molekyle aktivitet (32,00%), binding (20,00%), oversættelse regulator aktivitet (8,00%), og antioxidant aktivitet (4,00% ) (fig. 3B). I den katalytiske aktivitet kategorien proteindisulfidisomeraseaktivitet (spot 655, 1109) og oxidoreduktaseaktivitet (spot 542, 526, 1120, som er i den mitokondriske elektrontransportkæde) blev inhiberet af BA behandling. Samtidig blev antioxidant aktivitet (spot 542) også faldt med BA behandling. Desuden fleste proteiner involveret i strukturel molekyle aktivitet (spot 81, 361, 1085, 1087, 970), binding (spot 128, 573, 868) og oversættelse regulator aktivitet (spot 673, 885) blev reduceret betydeligt i BA behandlede HeLa-celler .

Baseret på PANTHER klassificering og gen kategori, biologisk proces (A) og molekylær funktion (B) af de tilsvarende identificerede proteiner blev klassificeret.

Et protein interaktion netværk blev genereret af STRING, som tilbyder en forbedring af funktionel analyse (fig. 4). Proteinet interaktion netværk giver en platform til at analysere de identificerede proteiner ‘funktioner, protein-protein interaktioner, biologiske veje og molekylære funktioner. Derfor blev fire store netværk genereret: (1) neurotrophin signalvejen, (2) langvarig depression, (3) arytmier højre ventrikel kardiomyopati, og (4) VEGF signalvejen. MAP2K2 (spot 942), YWHAB (spot 823) og YWHAE (spot 842) var de centrale proteiner af de interagerende netværk, og deres niveauer blev nedsat med BA behandling, som kan spille en vigtig rolle i neurotrofin signalvejen. Af de identificerede proteiner, er 14-3-3-proteiner involveret i mange fysiologiske veje, og disse proteiner er blevet vist at være ansvarlig for væksten og apoptotiske kapacitet mange maligne tumorer.

De ændrede proteiner fra proteomik analyse blev uploadet til STRING redskab til at identificere funktionelle signalering netværk. De forventede funktionelle links bestå af op til otte linjer:. Én farve for hver type beviser

ROS generation i BA-behandlede HeLa celler

ROS spiller en vigtig rolle i apoptose induktion fordi det er involveret i mitokondriel membranpermeabilisering og celledød induktion. Ifølge proteinprofilering af BA-behandlede celler, UDP-glucose-6-dehydrogenase (spot 526), ​​6-phosphogluconat-dehydrogenase (spot 1120) og peroxidase-enzym (spot 542) var involveret i den biologiske proces med oxidase stressreaktion, som korrelerer med BA-induceret apoptose af HeLa-cellerne. Niveauet af ROS-produktion blev detekteret efter behandling af HeLa-celler med BA (15 pmol /l, 30 pmol /l) i 48 timer. Niveauet af ROS i BA-behandlede celler steg betydeligt. Niveauet af ROS i BA-behandlede celler var 9,28 gange og 12,77 gange højere end niveauet af ROS i kontrolceller for behandlinger af 15 pmol /L og 30 pmol /l, og der blev observeret en opreguleret tendens igennem eksperimentet (fig. 5). Disse resultater antyder, at BA inducerer apoptose gennem aktivering af ROS-medieret celledød mekanismer i HeLa-celler.

HeLa-celler blev behandlet med 15 mmol /l, 30 pmol /L BA i 48 timer og derefter inkuberet med 10 mmol /l DCFH-DA i 40 min. Den fluorescerende intensitet DCFH blev målt ved flowcytometri. (A) faktisk spektre fra et repræsentativt enkelt eksperiment. (B) Fluorescensintensiteten af ​​farvede celler blev bestemt ved flowcytometri. Søjler viser middelværdier for tre eksperimenter (± SD). **

s

0,01 sammenlignet med kontrolgruppen (0 mmol /l BA)

QRT-PCR-analyse af gener involveret i BA-induceret celle apoptose

.

Fordi 14-3-3 proteiner er involveret i mange fysiologiske veje, herunder vækst og apoptose, ekspressionsvektorer ændringer i de to gener, der koder det identificerede 14-3-3-familien af ​​proteiner blev udvalgt til yderligere analyse ved QRT-PCR. Den nedregulering af de to udvalgte gener (

14-3-3β

og

14-3-3ε

) på transskription niveau var i overensstemmelse med de 2-DE-data. Ekspressionsniveauerne af

14-3-3β

og

14-3-3ε

var signifikant nedreguleret af BA behandling. Gener

Bcl-2

og

Bax

blev undersøgt for yderligere at udforske de roller ROS ophobning i BA-induceret apoptose fordi mitokondrie vej reguleres af prosurvival Bd-2 og proapoptotiske Bax. Udtrykket niveau af

Bcl-2

blev observeret at være betydeligt lavere end kontrolniveauet. I modsætning hertil ekspressionen af ​​proapoptotiske

Bax

blev signifikant forøget sammenlignet med kontrollerne ved QRT-PCR (fig. 6).

HeLa-celler blev behandlet med 30 mmol /l BA i 24 timer og derefter Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et Trizol-reagens. Søjler viser middelværdier for tre eksperimenter (± SD). *

s

0,05, **

s

. 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen (0 mmol /l)

Diskussion

BA, til et naturligt forekommende pentacyklisk triterpenoid med potentiale dræbe melanomceller [1], er blevet vist at inducere apoptose i mange cancercellelinier [2] – [8]. BA er blevet rapporteret at være fri for cytotoksiske virkninger over for raske celler. Normale celler, såsom dermale fibroblaster, perifert blod lymfoblaster [2], melanocytter [14] og menneskelige astrocytter [15], har vist sig at være resistente over for BA behandling in vitro. Flere undersøgelser har givet stor indsigt i BA-induceret cytotoksicitet. BA undertrykte også tumorvækst in vivo i en række dyreforsøg. I et xenotransplantat musemodel for ovariecancer indgivelse af BA forøgede overlevelsestiden [25] betydeligt. Schettino, M T udnyttede BA i behandling af Human Papilloma Virus, som anses for nødvendige for udviklingen af ​​livmoderhalskræft, tyder resultaterne på BA kan være en af ​​lovende lægemidler til behandling af livmoderhalskræft [26]. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at belyse den molekylære mekanisme (r) af de apoptotiske virkninger af BA i en cervikal cancer cellelinje (HeLa) og at undersøge virkningerne af BA på væksten af ​​HeLa-celler.

for at bestemme den passende koncentration af BA for proteomik-forsøg blev HeLa-celler behandlet med en serie af BA koncentrationer i 24 timer, 48 timer og 72 timer, og derefter cellelevedygtigheden blev målt ved et MTT-assay og apoptose sats blev analyseret ved flow- cytometri. Resultatet afslørede BA inhiberer proliferation af HeLa-celler på en dosis- og tidsafhængig måde, og IC

50 var 25,93 ± 1,87 uM i 72 timer, hvilket var konsistent med IC

50 (26,0 ± 2,1 uM) fra Rita C testet HeLa celler udsat for BA behandling i 72 timer [24]. Der blev observeret signifikant vækstinhibering og celleapoptose når cellerne blev eksponeret for 30 pmol /L BA i 48 timer. For at overholde en standard, som celle apoptose skal fremkaldes, men nok levende celler bør også holdes for protein udvinding og proteomisk undersøgelse, 30 pmol /L BA blev valgt til behandling af HeLa-cellerne.

Proteomics tilbyder en metode til at identificere hvilke proteiner medierer apoptotiske veje i celler behandlet med kemoterapeutiske midler [27] – [29]. Fordi den molekylære mekanisme involveret i induktionen af ​​proliferation hæmning og apoptose med BA er stadig ikke klart, vi implementeret en proteomics ordning til globalt søgning efter differentielt udtrykte proteiner i HeLa-celler er ramt af BA. De fleste proteiner (30 spots) blev nedsat, og få proteiner (6 pletter) blev forstærket af BA behandling. Funktionel kategori analyse tyder på, at ændringer i proteinekspression efter BA behandling er forbundet med forskellige biologiske processer og molekylære funktioner. Disse resultater antyder, at BA-induceret apoptose af HeLa-celler er hovedsageligt afhængig inhibering af proteiner involveret i syntese og metabolisme.

Blandt de femten metaboliske proces relaterede proteiner, to af de opregulerede proteiner (HSPA5, spot 613 og PLIN3, spot 248) er involveret i det endoplasmatiske reticulum (eR) vej, som er involveret i komplekse apoptotiske svar. ER stress respons kan fremme cellulær reparation og vedvarende overlevelse ved at reducere belastningen af ​​ufoldede proteiner gennem global dæmpning af proteinsyntese eller opregulering af chaperoner, enzymer og strukturelle komponenter af ER [30]. Selv om mekanismen er stadig uklart, hvor ER stress er overvældende, celler undergår apoptose [31]. Glukose-regulerede protein HSPA5 (spot 613), hvilket er en ER-resident chaperon, reagerer på skadestuen vej gennem et netværk af tilsynsmyndigheder og nye mekanismer, der fører til vækst anholdelse [32]. Fragt, herunder PLIN3 (spot 248), translokeres ind i ER og inkorporeres derefter i små vesikulære bærere, der medierer transport til Golgi rum [33]. En anden opreguleret protein er IL18 (plet 27), en hidtil ukendt pro-inflammatorisk cytokin, der inducerer ekspression af tumornekrosefaktor a (TNF-a) og Fas-ligand, samt nuklear translokation af nuklear faktor kB (NF-KB) [ ,,,0],34], [35]. NF-KB er en vigtig regulator af stress-induceret transkriptionel aktivering, og BA er også blevet rapporteret at inhibere inflammatoriske aktivering af NF-KB [36]. I det foreliggende arbejde, blev opreguleret proteinekspression opdaget, som kan mægle ER processen med BA i HeLa-celler.

To ned-regulerede antioxidant aktivitet, proteiner, UGDH (spot 526) og PGD (spot 1120) , katalyserer oxidationen af ​​C6 alkoholer til carboxylsyrer i to på hinanden NAD

+ – afhængige trin uden frigivelse af et mellemliggende aldehyd, og disse proteiner er meget vigtige for elektronoverførsel kæden i mitokondrier [37], [38]. Endvidere kan antioxidant aktivitet protein PRDX6 (spot 542) tilvejebringer beskyttelse mod nitroxidative stress og reparation oxidativt beskadigede molekyler, og dette protein spiller en vigtig rolle i fjernende ROS i fysiologiske betingelser [39]. Samtidig blev niveauet af ROS produktion påvist ved flowcytometri steg efter behandling af HeLa-celler med BA, og dette resultat er i overensstemmelse med resultaterne af tidligere oxidoreduktase aktivitetsassays og kan bidrage til at forklare de apoptotiske virkninger af BA. Disse resultater indikerer, at mitochondrier pathway blev aktiveret ved BA, som derefter induceret apoptose af HeLa-cellerne. Oxidativ stress har været kendt for at være en mediator af apoptose induceret af en række triggere, og mitokondrier betragtes som sensorer oxidativ skade og kan spille en vigtig rolle i apoptose [40], [41]. Bcl-2-familien af ​​proteiner kan regulere mitokondrier pathway gennem at ændre mitokondriske membranpermeabilisering [42]. Antiapoptotisk Bcl-2 og proapoptotiske Bax er meget vigtige for mediering den ydre mitokondriske membran permeabilisering og mitokondriel pathway apoptose [43]. Vi fandt, at BA behandling undertrykt udtryk for

bcl-2-

udskrifter, lettet udtryk for

Bax

ved QRT-PCR.