PLoS ONE: Prognostisk Betydningen af ​​Tag SNP rs1045411 i HMGB1 af Aggressive Gastric Cancer i en kinesisk Population

Abstrakt

Overbevisende beviser har foreslået, at høj mobilitet gruppe box-1 (HMGB1) genet spiller en afgørende rolle i cancerudvikling og progression. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere virkningerne af enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i

HMGB1

gen på overlevelsen af ​​gastrisk kræft (GC) patienter. Tre tag SNPs fra

HMGB1

gen blev udvalgt og genotype ved hjælp Sequenom IPEX genotype-system i en kohorte af 1030 GC patienter (704 i træningssæt, 326 i validering sæt). Multivariate Cox proportional hazard model og Kaplan-Meier Curve blev anvendt til prognose analyse. AG /AA genotyper af SNP rs1045411 i

HMGB1

gen var signifikant associeret med en bedre samlet overlevelse (OS) i et sæt af 704 GC patienter sammenlignet med GG genotyper (HR = 0,77, 95% CI: 0.60-0.97 ,

P

= 0,032). Denne prognostisk effekt blev bekræftet i en uafhængig validering sæt og samlede analyse (HR = 0,80, 95% CI: 0,62 til 0,99,

P

= 0,046; HR = 0,78, 95% CI: 0,55-0,98,

P

= 0,043, henholdsvis). I stratificeret analyse, den beskyttende virkning af rs1045411 AG /AA genotyper var mere fremtrædende i patienter med negativ strata, sammenlignet med patienter med gunstige strata. Desuden blev stærke fælles prædiktive effekt på OS af GC patienter noteret mellem rs1045411 genotyper og Lauren klassifikation, differentiering, scene eller adjuverende kemoterapi. Derudover funktionel analyse indikerede en signifikant effekt af rs1045411 på

HMGB1

udtryk. Vores resultater tyder på, at rs1045411 i

HMGB1

er signifikant associeret med kliniske resultater af kinesiske GC patienter efter kirurgi, især i dem med aggressiv status, som berettiger yderligere validering i andre etniske befolkningsgrupper

Henvisning.: Bao G, Qu F, han L, Zhao H, Wang N, Ji G, et al. (2016) Prognostisk Betydningen af ​​Tag SNP rs1045411 i

HMGB1

af Aggressive Gastric Cancer i en kinesisk Befolkning. PLoS ONE 11 (4): e0154378. doi: 10,1371 /journal.pone.0154378

Redaktør: Qing-Yi Wei, Duke Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: Januar 23, 2016 Accepteret: April 12, 2016; Udgivet: 26 April, 2016

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:.. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.272.201 og nr 81.572.916 til GB, nr 81.200.330 til NW)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

. Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform i verden, der tegner sig for ca. 8% af nye kræfttilfælde og 10% af kræftdødsfald [1]. Af disse sager, 70% fandt sted i udviklingslandene, og halvdelen af ​​verdens samlede opstod i det østlige Asien, hovedsageligt i Kina [2]. I løbet af de seneste årtier, på trods af den betydelige stigning i investeringerne og fremskridt i diagnosticering og behandling af GC, den samlede overlevelse (OS) for avanceret GC er stadig dystre, med en 5-års overlevelse på mindre end 25% [3 ]. I øjeblikket er overlevelse og prognose af GC patienter stadig afhænge af den fase af tumor på diagnosetidspunktet. Men på grund af de klart vigtige forskelle inden for samme fase, tumor stadium alene ikke er tilstrækkelig til at forudsige prognosen for GC [4]. Derfor, for at opdage nye molekylære signaturer som pålidelige prognostiske markører for GC er meget vigtig og krævende. I de senere år har undersøgelser fokuseret på undersøgelse af genetiske varianter, der disponerer for udvikling og progression af GC [5].

Høj mobilitet gruppe box-1 (HMGB1), et vigtigt medlem af høj mobilitet gruppe proteinsuperfamilien, indeholder to 80-aminosyre DNA-bindende domæner (A-box og B-boks) og en sur carboxylgruppe hale [6]. Den fungerer som et kromatin strukturelt protein i kernen og en proinflammatorisk cytokin ekstracellulært. Som en nuklear protein, HMGB1 binder ikke-specifikt til minor groove i DNA og letter samlingen af ​​stedspecifikke DNA-mål [7]. I modsætning hertil ekstracellulære HMGB1 fungerer som et cytokin, der udbreder Infektion eller skade-fremkaldte inflammatoriske reaktioner [8]. Den konstante frigivelse af HMGB1 fra nekrotiske tumorceller kan skabe en mikromiljø ligner kronisk inflammation; en tilstand kendt for at bidrage til udviklingen af ​​epitelmalignanser især inflammations-associeret cancer [9]. Faktisk har talrige undersøgelser tidligere demonstreret overekspression af HMGB1 i mange typer cancer [10-13], herunder GC [14]. Desuden har overbevisende beviser bekræftede yderligere, at HMGB1 overekspression er tæt forbundet med tumorudvikling ved mediering af proliferation, invasion og migration af cancerceller [15, 16]. Derfor kan HMGB1 være en interessant kandidat som et nyt prognostisk markør eller terapeutisk mål for GC.

Akkumulerende beviser har foreslået, at genetiske baggrunde kan påvirke risikoen og prognose af GC [17]. Enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) er den mest almindelige genetiske variation, og kan være de lovende surrogat biomarkører for patienternes genetiske baggrunde for at forudsige terapeutisk respons og prognose [18]. Genetiske varianter er blevet identificeret i human

HMGB1

gen [19], men sammenhængen mellem

HMGB1

genpolymorfisme og GC overlevelse resultatet er aldrig blevet fastlagt. I betragtning af den afgørende rolle, som HMGB1 i udviklingen og progressionen af ​​kræft, er det plausibelt, at polymorfier af

HMGB1

kan påvirke de kliniske resultater af GC. Heri vi vurderet virkningerne af tre tag SNPs i

HMGB1

på de kliniske resultater af 1030 kinesiske GC patienter (704 i træningssættet, 326 i den uafhængige validering sæt), der modtog radikal resektion behandling. Desuden blev effekten af ​​en identificeret relevante tag SNP om regulering af genekspression yderligere undersøgt af en

in vitro

funktionelt assay. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse af sammenhængen mellem de polymorfier af

HMGB1

og det kliniske resultat af GC.

Materialer og metoder

Etik

Denne undersøgelse blev godkendt af Etik udvalg af fjerde Military Medical University. De procedurer blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer og til 1964 Helsinki-erklæringen og senere ændringer eller tilsvarende etiske standarder. Den underskrevne informerede samtykke blev opnået fra hver deltager indgår i undersøgelsen.

studiepopulation

I alt 1030 Han kinesiske patienter med primær gastrisk adenocarcinom blev inkluderet fra to uafhængige sites, Tangdu Hospital og Xijing Hospital Digestive Disease, i Xi’an, Kina. Alle GC sager modtaget kirurgisk resektion og havde ingen tidligere andre kræftformer eller enhver præoperativ anticancer behandling eller blodtransfusion inden for 3 måned før operationen. Der var ingen alder, køn, eller sygdom stage begrænsninger for tilfælde rekruttering. Blandt dem, blev de 704 patienter (Institut for Almen Kirurgi, Tangdu Hospital, mellem juli 2008 og juni 2013), der anvendes som en uddannelse sat i denne undersøgelse. En anden gruppe af 326 patienter (Xijing Hospital i Digestive Disease, mellem januar 2008 og december 2010) blev anvendt som en uafhængig validering sæt. Formålet var at identificere den klinisk signifikant prognostisk værdi af SNPs inden

HMGB1

gen fra træningssættet og testede det i den uafhængige validering sæt.

Demografiske og kliniske data

demografiske og kliniske data blev indsamlet gennem i-personers interviews på det første besøg eller opfølgning på klinikkerne, medicinske journaler eller samråd med behandlende læger, herunder alder, køn, etnicitet, boligområde, diagnosetidspunktet, tidspunktet for kirurgi og /eller adjuvans kemoterapi (ACT), tid for tilbagefald og /eller død, tumor stadium Lauren klassificering, differentiering, histologisk type, og behandlingsprotokol. Opfølgning oplysninger blev opdateret 6-måneders intervaller gennem on-site interview, telefonisk kommunikation, eller gennemgå journaler af uddannet forskning specialister. Den seneste opfølgning date var juni 2015 og den mediane opfølgning varighed var 51 måneder (interval 6-89 måneder). Procentdelen af ​​patienten tabt under opfølgning var 9,8%. OS blev defineret som tiden fra operation til GC-specifik død. RFS (Gentagelse overlevelse) blev defineret som tiden fra kirurgi til datoen for den første gentagelse eller fjernmetastaser af GC. Patienter i live på den sidste opfølgning blev censureret.

Indsamling, behandling og opbevare prøvemateriale

Før operationen, 5 ml veneblod blev indsamlet fra hver GC patienter til at udtrække DNA ved hjælp af E.Z.N.A. blod DNA Midi Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA). Sixty gastrisk kræft væv blev samtidigt indsamlet fra valideringen sæt for real-time kvantitativ revers transkription PCR (RT-PCR) analyser.

SNP udvælgelse og genotyping

Den kandidat tag SNPs udvalg af

HMGB1

gen blev udført som en to-trins procedure. For det første, vi brugte et sæt af web-baserede SNP markeringsværktøjer (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) for at søge kandidat SNPs af

HMGB1

[20]. Alle validerede polymorfier i

HMGB1

genregion, herunder 5 kb opstrøms for det første exon og 5 kb nedstrøms for det sidste exon, blev anset for at være kandidat SNPs. Disse SNP’er med en mindre allel frekvens ≥ 5% i HapMap CHB (han-kinesere i Beijing) befolkning og en parvis koblingsuligevægt kvadreret korrelationskoefficient (r

2) 0.8 blev udvalgt som kandidat SNPs. For det andet blev tag SNPs valgt fra disse kandidat SNPs ved hjælp af internationale HapMap Projekt fase II-database af den kinesiske befolkning (https://www.hapmap.org/, adgang 18 November 2013) og HAPLOVIEW version 4.2. Endelig tre tag SNP’er (gennemsnitlig r

2 = 0,981) blev udvalgt: rs1045411 (G A), rs1412125 (T C) og rs2249825 (C G) .Genotyping blev udført under anvendelse Sequenom IPLEX genotypebestemmelse systemet (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) ifølge producentens protokol. De laboratorie personer, som har ledet den genotype analyser blev blindet for patienternes oplysninger. intern kvalitetskontrol og negative kontroller blev brugt til at sikre genotype nøjagtighed, og 5 prøver blev tilfældigt udvalgt og genotype i to eksemplarer med 100% konkordans. Ring sats for genotypning varierede mellem 99,3% og 99,7%. De detaljerede oplysninger om SNPs og genotype resultater blev opført i S1 tabel.

Funktionel assay

De funktionelle virkninger af tag SNP rs1045411 beliggende i 3’UTR af

HMGB1

gen blev undersøgt ved anvendelse af luciferase reporter assay. Kort fortalt blev 49-bp dobbeltstrenget DNA der bærer enten vild genotype eller variant genotype rs1045411 syntetiseret og klonet ind i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, Austin, Tex, USA) anvendelse af restriktionsenzymer Spe I og Hind III (Takara, Dalian, Kina). Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering. Humane GC cellelinier SGC-7901 og human embryonisk nyrecellelinie HEK-293T, hvori har-MIR-505 blev identificeret til at være positivt udtrykt ved anvendelse TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) som tidligere beskrevet [21], blev cotransficeret med enten pMIR-rs1045411-A eller pMIR-rs1045411-G (200 ng /brønd) med eller uden anti-miR-505 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og den interne kontrol reporterplasmid pRLTK (Promega, Madison, WI, USA) (20 ng /brønd) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en 24-brønds plade med 2 x 10

5 celler pr. SGC-7901 og HEK293 cellelinjer blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (CAS) (Shanghai, Kina), hvor de blev verificeret ved mycoplasma detektion, DNA-fingeraftryk, isoenzym afsløring og celle vitalitet afsløring. En frossen hætteglas med hver 147 cellelinje, som straks blev udvidet og frosset modtages fra leverandøren, blev genoplivet og anvendes til den foreliggende undersøgelse. Efter 48 timer blev cellerne opsamlet til bestemmelse luciferaseaktivitet under anvendelse af en dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, WI, USA) med et luminometer (Tecan, Mannedorf, Schweiz). Alle transfektioner blev udført i tre eksemplarer, og alle forsøg blev uafhængigt gentaget tre gange.

For yderligere at vurdere virkningen af ​​tag SNP rs1045411 genotyper på ekspressionen af ​​

HMGB1

mRNA, totalt RNA blev isoleret fra 60 GC vævsprøver (30 med AA genotype og 30 med AG /GG genotyper af rs1045411) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Derefter blev cDNA syntetiseret ved anvendelse PrimeScript RT reagenskit (Takara, Dalian, Kina). RT-PCR blev udført under anvendelse af følgende

HMGB1 Salg primere: forward, 5′-TAAGAAGCCGAGAGGCAAAA-3 ‘; reverse, 5’-AGGCCAGGATGTTCTCCTTT- 3 ‘, og β-actin blev anvendt som en intern kontrol (primere: forward, 5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′; revers, 5’-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3 ‘) [13]. Relativ udtryk for

HMGB1

mRNA niveauer blev bestemt ved anvendelse af den relative kvantificering metode og 2

-ΔΔCt analyse.

Statistisk analyse

Statistik analyser blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics 19.0 software (IBM). Normalfordelte kontinuerlige variabler blev udtrykt som middelværdi ± SD, mens unormalt fordelte kontinuerlige variabler blev udtrykt som median og rækkevidde. Pearsons χ

2-test blev anvendt til at teste forskellene i kategoriske variable. Forskellen på normalfordelte kontinuerlige variabler mellem to grupper blev analyseret ved anvendelse af Students

t

-test, mens Mann-Whitney U test blev anvendt til sammenligning af unormalt fordelte kontinuerlige variabler. Multivariate Cox proportional hazard regressionsmodel blev anvendt til at vurdere effekten af ​​individuelle SNP og patienters karakteristika på OS eller RFS. Hazard ratio (timer) og 95% konfidensintervaller (CIS) blev anslået med justering for alder, køn, Lauren klassificering, differentiering, TNM stadie og ACT. Kaplan-Meier-kurver og log-rank test blev også anvendt til at evaluere effekten af ​​de enkelte SNPs på overlevelsestiden. Statistik signifikans blev fastsat på et niveau på 0,05 og alle

P

værdier rapporteret i denne undersøgelse var tosidet.

Resultater

Fordeling af patienternes karakteristika og prognose analyse

GC patienternes karakteristika blev sammenfattet i S2 tabel. På grund af den sene slutdato for patientrekruttering for træningssættet, median follow-up tid var kortere i træningssættet (46 måneder, der spænder fra 6 til 80 måneder) end i den uafhængige validering sæt (72 måneder, der spænder fra 6 til 89 måneder). Således sammenlignet med patienterne i uafhængig validering sæt dem i træningssættet havde lavere tilbagefald (58,4%

vs

. 66,8%,

P

= 0,005) og død (41,4%

vs

. 55,8%,

P

= 0,001). Der var ingen forskelle mellem uddannelse sæt og validering sat i forhold til alder, tumor site, Lauren klassificering, TNM stadie, differentiering og ACT (

P Drømmeholdet værdi spænder fra 0,082 til 0,898). Ved seneste opfølgning, 641 patienter (423 og 218 i uddannelse og validering sæt, henholdsvis) udviklede tilbagefald og 482 døde (300 og 182 i uddannelse og validering sæt henholdsvis). Multivariate Cox regressionsanalyse viste, at der var betydelig højere død og fornyet risiko hos patienter med diffus type, dårlig differentiering og tumor stadium III og IV, sammenlignet med patienter med intestinal type, godt /moderat differentiering og tumor trin I og II blandt træningssæt, validering sæt og pooled analyse. Desuden platinbaseret ACT efter operationen viste en signifikant beskyttende virkning på både OS og RFS af GC-patienter (S3 tabel).

Foreningen af ​​

HMGB1

SNPs med klinisk resultat i GC patienter

Vi vurderede sammenslutning af

HMGB1

SNP genotyper med GC kliniske resultat ved hjælp af multivariat Cox regressionsanalyse med justering for alder, køn, tumor site, Lauren klassificering, differentiering, TNM stadie og ACT (som vist i tabel 1). Resultaterne viste, at tag SNP rs1045411 var signifikant associeret med OS af GC patienter i træningssættet. I forhold til patienter med GG-genotypen, dem med variant alleler (AG og AA genotyper) havde en signifikant lavere dødsrisiko (HR = 0,77, 95% CI: 0,60-0,97,

P

= 0,032). Denne betydelige fund blev bekræftet i den uafhængige validering sæt og samlet analyse, med HRs af 0,80 (95% CI: 0,62-0,99;

P

= 0,046) og 0,78 (95% CI: 0,55-0,98;

P

= 0,043), hhv. Kaplan-Meier kurver analyse også en stærk association med OS. Patienter der bærer AG /GG genotyper af rs1045411 havde bedre OS end dem med GG genotype gjorde i uddannelse sæt (

P

= 0,024, Fig 1A), validering sæt (

P

= 0,017, Fig 1B ) og samlet analyse (

P

= 0,001, fig 1C).

OS af GC patienter stratificeret af SNP rs1045411 i træningssættet (A), validering sæt (B) og samlede analyse ( C). Patient numre kan ikke tilføje op til 100% af de disponible fag på grund af manglende genotypebestemmelse data.

Stratificeret analyse på sammenslutning af rs1045411 med OS af værtsvariabler

Vi har udført lagdelt analyser at vurdere sammenhængen mellem genotyper af rs1045411 og OS af GC patienter efter alder, Lauren klassificering, differentiering, TNM stadie og ACT. De signifikante beskyttende virkninger knyttet rs1045411 var mere fremtrædende i negative undergrupper med en HR interval 0,39-0,69 (figur 2A). For detaljer, den betydelige faldt død risiko forbundet med variant-holdige genotyper (AG /AA) af rs1045411 blev observeret hos ældre patienter (HR = 0,69, 95% CI: 0,48-0,99), diffus typen (HR = 0,67, 95% CI: 0,47-0,95), dårlig differentiering (HR = 0,66, 95% CI: 0,45-0,95), klinisk fase III og IV (HR = 0,58, 95% CI: 0,37-0,93) og uden ACT (HR = 0,39, 95 % CI: 0,20-0,76). Desuden viste den nuværende stratificeret analyse en lignende tendens for RFS med en HR-interval 0,44-0,79 (figur 2B). Resultaterne viste, at AG /AA genotyper af rs1045411 tillagt den gunstigere prognose i de negative grupper.

Stratificeret analyser af sammenhængen mellem genotyper af rs1045411 og OS af GC patienter efter alder, Lauren klassificering, differentiering, TNM stadie og ACT (2A), og effekten på RFS af rs1045411 AG /AA genotyper i negative grupper (2B). Patient numre kan ikke tilføje op til 100% af de disponible fag på grund af manglende genotypebestemmelse data.

Fælles effekt mellem rs1045411 og Lauren klassificering, differentiering, scene eller ACT på OS

Tidligere undersøgelser har vist, at både genetiske variationer og kliniske karakteristika interagerer at spille kritiske roller i GC progression [17]; og at hvor interaktioner eksisterer, virkningerne af kliniske elementer på tumorprogression vil blive ændret med genotyper. Derfor blev en fælles analyse udført for at vurdere den mulige modulerende effekt af rs1045411 i disse kliniske karakteristika (Lauren klassificering, differentiering, scene og ACT), der repræsenterer status for tumor progression på OS af GC patienter. Som vist i tabel 2, var der en signifikant interaktion mellem genotyper af rs1045411 og Lauren klassificering, differentiering, scene eller ACT (alle

P

interaktion 0,001). I forhold til personer, der bærer AG /AA genotyper og tarm typen, dem med GG genotype og diffus form havde en signifikant øget dødsrisiko (HR = 2,09, 95% CI: 1,42-3,08,

P

0,001). De tilsvarende resultater blev også fundet hos patienter transporterer GG genotype med dårlig differentiering (HR = 2,48, 95% CI: 1,70-3,62,

P

0,001) hos patienter med GG genotype af fase III /IV ( HR = 2,99, 95% CI: 2,04-4,38,

P

0,001), og hos patienter, der bærer GG genotype med ACT (HR = 4,49, 95% CI: 2,70-7,45,

P

. 0,001) i sammenligning med den tilsvarende referencegruppe

Funktionelle virkninger af rs1045411 på genekspression

Bioinformatik analyse (https://www.microrna.org/microrna /home.do) afslørede en tæt tag SNP rs1045411 til den forudsagte microRNA bindingssteder (HSA-miR-505) i 3′-utranslaterede region (3’UTR) af

HMGB1

gen [22] (fig 3A). Vi bekræftede første ekspressionen af ​​MIR-505 i SGC-7901 og HEK-293T-cellelinier, og fandt, at MIR-505 havde en relativt højere ekspressionsniveau (Fig 3B). For at undersøge om de genotyper af tag SNP rs1045411 i 3’UTR af

HMGB1

gen kunne ændre genekspression, to cellelinier blev transfekteret med luciferase reporter plasmider indeholdende enten vildtype (GG) eller variant (AA) genotype af SNP rs1045411 (fig 3C). Resultaterne viste, at SNP rs1045411 signifikant viste en virkning på den normaliserede luciferaseaktivitet i begge transficerede celler. Sammenlignet med celler transficeret med konstruktioner, der bærer vild genotype (GG) af SNP rs1045411, celler transficeret med konstruktioner, der bærer variant genotype (AA) udviste en signifikant reduceret luciferaseaktivitet. Virkningen af ​​anti-MIR-505 på luciferaseaktiviteten af ​​reporterplasmider blev også vurderet i undersøgelsen. Resultaterne viste, at luciferaseaktiviteten af ​​to UTR-konstruktioner (p-MIR-G og p-MIR-A) var signifikant forhøjet ved anti-MIR-505 i begge cellelinier med elimineret forskelle luciferaseaktivitet mellem to reporterplasmider. Desuden har vi brugt kvantitativ RT-PCR for at undersøge virkningen af ​​SNP rs1045411 genotyper på HMGB1 mRNA-ekspression i 60 GC væv (30 med GG genotype og 30 med AG /AA-genotyper) fra validering sæt. Som vist i figur 3D, fandt vi, at mRNA-ekspression niveau af HMGB1 var signifikant højere i bærerne med vilde (GG) genotype rs1056560 end dem, der foretog variant (AG /AA) genotyper (1,04 ± 0,50

vs

. 0,79 ± 0,37,

P

= 0,004).

(A) sekvens herunder SNP rs1045411 i 3’UTR af

HMGB1

gen. (B) Relative ekspressionsniveauer af HSA-MIR-505 i SGC-7901 og HEK-293T-celler. (C) Effekten af ​​SNP rs1045411 genotyper på ekspressionen af ​​

HMGB1

gen i SGC-7901 og HEK-293T-celler. (D) Relativ mRNA-ekspression på

HMGB1

genet i 60 GC væv med forskellige SNP rs1045411 genotyper. Rekombinant vektor (pMIR-rs1045411-G eller pMIR- rs1045411-A) og PTL-TK blev co-transficeret ind SGC-7901 og HEK-293T-celler. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) af tre uafhængige forsøg. Studerendes

t

test blev anvendt til at undersøge statistisk forskel.

Diskussion

I nærværende undersøgelse, vi undersøgt sammenhængen mellem genetiske polymorfier i

HMGB1

gen med prognosen for GC patienter ved to-trins analyse af uddannelses- og validering sæt. Vi viste, at AG /AA genotyper af tag SNP rs1045411 i

HMGB1

3′-UTR er signifikant associeret med en bedre OS i et sæt af 704 GC patienter sammenlignet med GG genotyper. Denne signifikant association blev bekræftet i en uafhængig validering sæt af 326 GC patienter samt en samlet analyse af alle 1030 GC patienter. Funktionel analyse viste, at SNP rs1045411 genotyper haft en betydelig indflydelse på mRNA ekspressionen af ​​

HMGB1

i GC væv samt to tumorcellelinier. Endvidere den gunstige prognostiske virkning rs1045411 var mere tydelig i de negative undergrupper af GC patienter. Derudover fælles analyse fundet en signifikant interaktion af gen-kliniske elementer. Så vidt vi ved, denne undersøgelse for første gang rapporteret sammenhængen mellem

HMGB1

gen polymorfier og GC prognose. Efter validering

HMGB1

SNP rs1045411 kan anvendes som en prognostisk markør i kombination med traditionelle kliniske prognose faktorer for beslutningstagning GC individuel behandling.

De stigende beviser tyder på, at forhøjet HMGB1 er forbundet med tumormetastase og dårlig prognose [16, 23-26], hvilket gør HMGB1 en attraktiv tumor biomarkør. Det er blevet foreslået, at HMGB1 fungerer som et potentielt onkogent protein til at fremme tumor fremskridt [15, 27, 28], og dets overekspression i cancerceller påvirker anti-cancer T-celle-respons ved aktivering af intracellulær signalering [15, 29]. Faktisk har den forhøjede ekspression af HMGB1 blevet detekteret i patienter med GC og andre former for kræft [30-32], og dets ekspression er tæt forbundet med tumorigenese [33], tumorinvasion og metastase [29]. Endvidere Chung et al [34] påvist, at serum HMGB1 niveauer også var signifikant associeret med tumorinvasion, metastase, vækst, samt dårlig prognose. Kollektivt, disse resultater understøtter en vigtig rolle for HMGB1 i kræft transformation, tumorvækst og invasion.

På trods af de omfattende undersøgelser af HMGB1 udtryk i væv og dens tilsvarende serologisk aktivitet på kræft evolution, er der et par undersøgelser, der fokuserer på effekten af ​​SNP’er i

HMGB1

genet på kræft prognosticering eller behandling hidtidige respons. I en gruppe af kinesiske patienter med lungekræft, to SNP’er, rs141215 og rs2249825, har været forbundet med platinbaseret kemoterapi svar [35]. Tilsvarende i patienter med oral pladecellekarcinom, anden

HMGB1

polymorfi ved SNP rs3742305 er blevet forbundet med tumorprogression og fornyet overlevelse [36]. Men vi udelukkede SNP rs3742305 fra denne undersøgelse, fordi det er i stærk bindingsuligevægt med SNP rs1045411. I nærværende undersøgelse fandt vi, at variant-indeholdende (AG /AA) genotyper af tag SNP rs1045411 var signifikant associeret med en bedre OS hos patienter med GC, understøtter en vigtig rolle for HMGB1 i GC evolution.

Siden SNP rs1045411 ligger i 3’UTR-regionen i

HMGB1

gen, det kan påvirke ekspressionen af ​​

HMGB1

gen i GC patienter. Til dato, men der er ingen undersøgelser til at vurdere funktioner i SNP rs1045411. Vi fandt, at rs1045411 er i tæt nærhed til et forudsagt microRNA-bindingssted (har-MIR-505) [22], hvilket tyder på, at en sådan variation i denne stilling kan påvirke stabiliteten af ​​mRNA og bindingsaktivitet til microRNA, hvorved modulering af genekspression [ ,,,0],37]. Faktisk vores luciferase reporter analyser bekræftede en væsentlig påvirkning af rs1045411 på post-transkriptionel regulering af

HMGB1

gen i en miR-505-afhængig måde. Desuden ved at undersøge HMGB1 mRNA-ekspression niveau i 60 GC vævsprøver med genotype data fra SNP rs1045411, fandt vi, at de væv, der bærer variant-holdige (AG /AA) genotyper havde signifikant nedsat HMGB1 mRNA-ekspressionsniveauer sammenlignet med dem med homozygot vilde (GG ) genotype. Tilsammen vores eksperimentelle data viste, at den gunstige prognostiske effekt tillagt ved variant-holdige (AG /AA) genotyper af rs1045411 blev tæt forbundet med afvigende ekspression af

HMGB1

.

Vores nuværende undersøgelse viste at de betydelige eller grænsetilfælde beskyttende virkninger af variant-indeholdende (AG /AA) genotyper af SNP rs1045411 på OS og RFS af GC patienter blev fundet næsten fuldstændigt i den negative (men ikke i fordelagtige) strata patienter. Dette er enig med tidligere undersøgelser, der viser, at SNPs påvirker kræft overlevelse mere fremtrædende i specifikke undergruppe patienter. For eksempel Wang

et al

[38] har rapporteret, at

PSCA

rs2294008 er signifikant associeret med overlevelse resultater blandt diffus type mavekræft, men ikke tarm-typen mavekræft. Pu

et al

[39] har også foreslået, at microRNA-relaterede genetiske varianter er mere bemærkelsesværdigt forbundet med ikke mindre overlevelse celle lungekræft hos patienter tidlige fase. Vi har også observeret en betydelig interaktion effekter mellem rs1045411 genotyper og kliniske elementer som Lauren klassificering, differentiering, klinisk fase, og adjuverende kemoterapi i modulering prognosen for GC. Disse signifikante korrelationer foreslog, at SNP rs1045411 kan have potentielle modulerende roller i disse kliniske karakteristika, der repræsenterer tumor progression. Men de underliggende mekanismer tilbage, som skal undersøges nærmere i fremtiden.

Den nuværende undersøgelse har flere forskellige funktioner. Først de inkluderede patienter kommer hovedsagelig fra Shaanxi og tilstødende områder, som er egnet til udførelse af populationsbaseret forskning på grund af den geografiske stabilitet med lav mobilitet sats. For det andet, den relative store befolkning størrelse indskrevet i nærværende undersøgelse tilladt os at gennemføre fase-stratificeret analyse i uddannelse og validering sæt, der begrænsede de forstyrrende faktorer af tumor og behandling heterogenitet. En væsentlig begrænsning ved denne undersøgelse er, at den relative lille befolkning i valideringen sættet kan resultere i falsk-negative resultater. Da vores undersøgelse var begrænset til han-kinesere, kan vi ikke udelukke generaliserbarhed problemet. Fremtidige studier i større populationer og andre etniske grupper er berettiget.

Samlet set som den første undersøgelse observere effekten af ​​

HMGB1

gen polymorfier på GC prognose i en kinesiske befolkning, vores data tyder på, at tag SNP rs1045411 i

HMGB1

gen har en signifikant effekt på det kliniske resultat af GC patienter, især for patienter med fremskreden eller anden aggressiv klinisk-patologisk tilstand. Den foreliggende undersøgelse har potentiale klinisk betydning i bestræbelserne på at forfine terapeutiske beslutninger i behandling af GC.

Støtte Information

S1 Table. Den information og genotype resultater af HMGB1 SNP’er

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s001

(DOC)

S2 Table. Udvalgte demografiske og kliniske karakteristika for mavekræft patientpopulation

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s002

(DOC)

S3 Table. Fordeling af patienternes karakteristika og prognose analyse i sættet Uddannelse og Validering sæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154378.s003

(DOC)