Abstrakt
Kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom, og er et presserende behov derfor effektiv behandling og /eller forebyggelsesstrategier. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, som embelin hæmmet vækst human bugspytkirtelkræft celle
in vitro
, og xenografter i Balb C nøgne mus, og bugspytkirtlen vækst kræft celle isoleret fra Kras
G12D transgene mus. XTT assays blev udført for at måle cellernes levedygtighed. AsPC-1-celler blev injiceret subkutant i Balb c nøgne mus og behandlet med embelin. Celleproliferation og apoptose blev målt ved Ki67 og TUNEL-farvning, henholdsvis. Ekspressionen af Akt, og Sonic Hedgehog (Shh) og deres målgenprodukter blev målt ved immunohistokemi, og Western blot analyse. Virkningerne af embelin på bugspytkirtelkræftceller isoleret fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus blev også undersøgt. Embelin inhiberede cellelevedygtighed i bugspytkirtelkræft AsPC-1, PANC-1, MIA PaCa-2 og Hs 766T-cellelinier, og disse inhibitoriske effekter blev blokeret af enten konstitutivt aktiv Akt eller Shh protein. Embelin-behandlede mus viste signifikant inhibering i tumorvækst, som var forbundet med reduceret ekspression af markører for celleproliferation (Ki67, PCNA og Bcl-2) og cellecyklus (cyclin D1, CDK2, og CDK6), og induktion af apoptose (aktivering af caspase-3 og spaltning af PARP, og forøget ekspression af Bax). Desuden embelin inhiberede ekspression af markører for angiogenese (COX-2, VEGF, VEGFR, og IL-8), og metastase (MMP-2 og MMP-9) i tumorvæv. Antitumoraktivitet af embelin var forbundet med hæmning af Akt og Shh veje i xenotransplantater, og bugspytkirtelkræftceller isoleret fra Kras
G12D mus. Desuden embelin også hæmmede epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) ved opregulering E-cadherin og hæmme ekspression af Snail, Slug, og ZEB1. Disse data antyder, at embelin kan inhibere pancreascancer vækst, angiogenese og metastase ved at undertrykke Akt og Shh veje, og kan udvikles til behandling og /eller forebyggelse af pancreas cancer
Henvisning:. Huang M, Tang SN, Upadhyay G, Marsh JL, Jackman CP, Shankar S, et al. (2014) Embelin Undertrykker væksten af humane kræft i bugspytkirtlen Xenografter, og bugspytkirtelkræft celler isoleret fra Kras
G12D Mus ved at hæmme Akt og Sonic Hedgehog Pathways. PLoS ONE 9 (4): e92161. doi: 10,1371 /journal.pone.0092161
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
Modtaget: Maj 11, 2013; Accepteret: 19 Feb 2014; Udgivet: 2 April, 2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i bugspytkirtlen er en af meget aggressive maligne sygdomme på verdensplan . Den samlede 5-års overlevelsesraten for denne dødelige sygdom er mindre end 5% [1]. På grund af sin invasive og metastatiske egenskaber, 10% af patienterne er berettiget til kirurgi på tidspunktet for diagnosen. Den dårlige prognose af sygdommen er relateret til sen præsentation, aggressiv lokal invasion, og tidlig metastaser. Konventionel kemoterapi og strålebehandling er generelt ineffektive, og fremkomsten af resistens er almindelig [2], [3]. Gemcitabin er et potent anticancer lægemiddel godkendt til behandling af kræft i bugspytkirtlen, men svarprocenten er meget dårlig. De store mangler i den nuværende gemcitabin terapi er dens hurtige metaboliske inaktivering og smalt terapeutisk vindue. FOLFOX kemoterapi (folinsyre, 5-fluoruracil og oxaliplatin) er almindeligt anvendt til behandling af pancreascancer med begrænset succes. Adskillige faktorer er forbundet med øget risiko for kræft i bugspytkirtlen og disse omfatter diabetes, kronisk pancreatitis, forudgående gastrisk kirurgi, rygning, stråling, og specifikt gen-polymorfier [4], [5]. Arvelige og flere erhvervede genmutationer (fx Kras) er almindelige i pancreas tumorer [6]. Mutationer i cyklin-afhængige kinase inhibitor p16, har den tumorsuppressorgen
p53,
Smad4 også blevet identificeret [7], [8]. Derfor forstå patogenesen af preinvasive fase, og udvikling af effektive strategier til at forebygge og /eller behandle kræft i bugspytkirtlen er af afgørende betydning.
Embelin, der stammer fra frugten af
embelia Ribes
Burm plante (Myrsinaceae), har vist sig at besidde anticanceraktivitet [9]. Selv om det oprindeligt blev opdaget som en XIAP inhibitor [10], og det hæmmer også cellemigrering, og invasion og inducerer apoptose [11]. Det er blevet vist at inducere apoptose i pancreas, colon, prostata og lunge cancerceller, og kronisk leukæmi og multipelt myelom celler [12], [13]. Det kan også modulere tumor-immun mikromiljø i Kras
G12D mus [14]. Endvidere STAT3 pathway er blevet vist, at regulere den antiinflammatoriske og anti-cancer aktiviteterne embelin [15]. Det øger proapoptotiske virkninger af TRAIL [16]. På trods af disse resultater, de molekylære mekanismer, som embelin hæmmer tumorvækst, angiogenese og metastase er ikke godt forstået.
PI3K /Akt signalvejen spiller væsentlig rolle i celle proliferation og overlevelse, og det er ofte og aberrerende aktiveret i senere stadier af pancreatisk duktalt adenokarcinom (PDAC) [17]. PTEN betinget knockout mus med aktiveret Kras
G12D viste signifikant hurtigere udvikling af acinære-til-duktalt metaplasi (ADM), maligne pancreas intraepitelialneoplasi (mPanIN), og PDAC inden for 12 måneder [18]. Vigtigst er det, alle mus med Kras
G12D aktivering og PTEN homozygot sletning bukkede under for kræft ved 21 dage. Denne undersøgelse bekræftede den rolle for PTEN, og den resulterende dysregulering af PI3K /AKT signalering akse i PDAC initiering og progression. Ligeledes har vi for nylig vist, at resveratrol kan inhibere pancreas carcinogenese i Kras
G12D mus [19]. Her har vi forsøgt at undersøge de anti-proliferative virkninger af embelin på bugspytkirtelkræftceller isoleret fra Kras
G12D mus.
Sonic pindsvin (Shh) er medlem af the Hedgehog (Hh) familie af udskilt signalering proteiner med forskellige funktioner under hvirveldyr udvikling og i væv homeostase [20]. Uhensigtsmæssig aktivitet af Hh signalvejen er blevet forbundet med tumortyper, der opstår sporadisk eller i genetisk prædisponerede individer [21]. Bindingen af Shh at Patched (ptch) receptorer medfører tab af ptch aktivitet og deraf følgende phosphorylering og posttranskriptionel stabilisering af Smoothened (Smo) [22]. Den Gli-familien af transskriptionsfaktorer regulerer flere gener, der Paly roller i cellecyklus, proliferation, migration og apoptose [23]. Interessant, Gli regulerer sit eget udtryk og andre medlemmer af Shh pathway såsom Patched 1 og lappet 2 og bugspytkirtelkræftceller isoleret fra Kras
G12D mus. Aktiveringen af Shh via Smo kan forekomme enten ved Hh-protein stimulering eller gennem tab af ptch aktivitet [23]. Shh pathway stimulerer cellevækst i autokrin og parakrin måde [24]. Vi har for nylig demonstreret, at adskillige kemoforebyggende midler og anticancerlægemidler kan inhibere pancreascancer celle og cancer stamceller vækst in vitro og in vivo [19], [25] – [31]. Inhiberingen af Shh pathway alene eller i kombination med andre kan være effektive til behandling og /eller forebyggelse af pancreas cancer.
Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, hvormed embelin inhiberer tumorvækst, angiogenese , og metastase af bugspytkirtelkræftceller xenotransplanterede i Balb C nøgne mus. Desuden er de molekylære mekanismer, hvormed embelin hæmmet vækst af bugspytkirtelkræftceller isoleret fra Kras
G12D mus blev også undersøgt. Vores data viser, at embelin hæmmet vækst bugspytkirtelkræft celle
in vitro,
AsPC-1 xenograft tumorvækst
in vivo
bugspytkirtelkræftceller isoleret fra Kras
G12D mus ved at undertrykke Akt og Shh signalveje. Som konklusion kan det udvikles til forebyggelse og /eller behandling af kræft i bugspytkirtlen.
Resultater
Embelin Hæmmer Cell Levedygtighed i bugspytkirtelkræft cellelinier
Vi først undersøgte anti-proliferative virkninger af embelin på fire bugspytkirtelkræft cellelinjer aSPC-1, Panc-1, MIA Paca-2 og Hs 766T ved XTT assay. Disse cellelinier blev behandlet med embelin (0-15 uM) i 48 timer, og cellelevedygtighed blev udført ved XTT assays. Som vist i fig. 1A og B, embelin inhiberede cellelevedygtighed i alle cellelinier. Vi undersøgte dernæst inddragelse af caspase i denne proces ved hjælp af en pan caspaseinhibitor z-VAD-fmk. Selvom z-VAD-inhibitor alene var ineffektiv til inhibering af cellelevedygtighed det væsentligt blokeret anti-proliferative virkninger af embelin på AsPC-1 og PANC-1 cellelinjer (fig. 1 C og D). Disse data antyder, at caspase (s) kan være behov aktivering til inhibering af cellevækst ved embelin. Salg
(A og B), pancreascancer AsPC-1, PANC-1, MIA PaCa-2 og Hs 766T-cellelinier blev behandlet med embelin (0-15 uM) i 48 timer. Ved slutningen af inkubationsperioden blev XTT assays udført for at måle cellernes levedygtighed. (C og D), Effekter af pan caspaseinhibitor på anti-proliferative virkninger af embelin. Pancreascancer aspC-1 og PANC-1-celler blev præinkuberet z-VAD-fmk (10 pM) i 2 timer og behandlet med forskellige doser af embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved XTT-assay. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. a, b, c, d, og e = signifikant forskellig fra respektive kontrol, P. 0,05
grundlæggende aktiv Akt eller Shh Protein hæmmer Anti-proliferative virkninger af Embelin
Akt er blevet vist at regulere Shh pathway ved phosphorylering Gli. Vi undersøgte dernæst, om aktivering af Akt og Shh veje blokerer anti-proliferative virkninger af embelin ved hjælp konstitutivt aktiv Akt og Shh protein. Konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt) er tidligere blevet beskrevet [28]. Forskellige doser af embelin (0-15 uM) inhiberede celle levedygtighed AsPC-1 og PANC-1 celler transficeret med tom vektor (fig. 1A og B). Endvidere konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt) inhiberede signifikant anti-proliferative virkninger af embelin i både cellelinier. Disse data antyder, at embelin kan inhibere pancreascancer celleproliferation ved at undertrykke Akt pathway.
Vi undersøgte dernæst, om Shh pathway medierer anti-proliferative virkninger af embelin. Kræft i bugspytkirtlen cellelinjer blev inkuberet med Shh protein for at aktivere Gli. Som vist i fig. 2 C og D, forskellige doser af embelin (0-15 uM) inhiberede celle levedygtighed AsPC-1 og PANC-1 cellelinier. Derimod Shh protein hæmmede markant anti-proliferative virkninger af embelin i disse to bugspytkirtelkræft cellelinjer. Disse data antyder, at embelin kan inhibere pancreascancer celleproliferation ved at undertrykke Shh pathway.
(A og B), Inhibering af anti-proliferative virkninger af embelin af konstitutivt aktive Akt. Pancreascancer AsPC-1 og PANC-1-celler blev transient transficeret med enten tom vektor eller konstitutivt aktiv Akt (CA-Akt) og behandlet med forskellige doser af embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved XTT-assay. (C og D), Inhibering af anti-proliferative virkninger af embelin af Shh protein. Pancreascancer AsPC-1 og PANC-1-celler blev forbehandlet med Shh protein (2 uM) i 2 timer, og behandles med forskellige doser af embelin (0-15 uM) i 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved XTT-assay. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. a, aa, b, c, d, og e = signifikant forskellig fra hinanden, P. 0,05
Embelin hæmmer væksten af aspC-1 Xenografter i Balb C Nude Mus
for at undersøge den tumorigent potentiale embelin, vi først undersøgt virkningerne af embelin på vækst af AsPC-1 xenotransplanterede tumorer i Balb C nøgne mus. AsPC-1-celler blev injiceret subkutant i flankerne af Balb C Nøgne mus. Efter tumordannelse blev mus behandlet med embelin (0 eller 40 mg /kg legemsvægt) gennem sonde (mandag til fredag, én gang dagligt) i 6 uger. Som vist i fig. 1A, embelin inhiberet AsPC-1 pancreas tumorvækst i Balb C nøgne mus. Endvidere embelin havde ingen virkning på legemsvægten af AsPC-1 tumorbærende mus, selv om mus tog på i vægt under behandlingen (fig. 3B). Det er vigtigt at bemærke, at vi ikke observere nogen toksicitet i leveren, milten og tarmen hos mus behandlet med embelin, hvilket tyder på det er et sikkert naturprodukt.
AsPC-1-celler (2 × 10
6 celler blandet med Matrigel, 50:50) blev subkutant implanteret i flankerne af Balb C nøgne mus. Tumorbærende mus blev behandlet med embelin (0 eller 40 mg /kg legemsvægt) gennem sonde (mandag til fredag, én gang dagligt) i 6 uger. Tumorvolumen (A) og legemsvægt hos mus (B) blev registreret ugentligt. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. * = Væsentlig forskellig fra kontrol, P 0,05
Embelin Hæmmer tumorcelleproliferation, og inducerer apoptose ved aktivering af caspase-3 og Spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)
Vi næste undersøgt virkningerne af embelin på celleproliferation i tumorvæv afledt fra kontrol og embelin behandlede mus under anvendelse af anti-PCNA eller anti-Ki67-antistof (fig. 4). PCNA og Ki67 er markører for celleproliferation. Embelin inhiberede celleproliferation i tumorvæv opnået fra AsPC-1 xenotransplantater sammenlignet med kontrolmus, som målt ved immunhistokemi (IHC) og Western blot (WB) analyse.
(A), Ekspression af PCNA, Ki67, caspase-3 og PARP i tumorvæv. Immunhistokemi blev udført for at måle ekspressionen af PCNA, Ki67, aktive caspase-3 og PARP i tumorvæv isoleret fra kontrol- og embelin-behandlede mus. (B), Kvantificering af TUNEL-positive celler. Apoptose blev målt ved TUNEL-assay. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), Effekter af embelin på markører af celleproliferation og apoptose. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af PCNA, Ki67, caspase-3 og PARP i tumorvæv. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
caspaseaktivering og spaltning af dets substrat PARP er hall tilhørende apoptose [32]. Vi undersøgte dernæst, om embelin induceret tumor-apoptose gennem aktivering af caspase-3 og spaltning af PARP. Caspase-3-aktivering blev målt ved IHC og Western blot-analyse under anvendelse af aktiv anti-caspase-3-antistof (fig. 4A og B). Embelin induceret caspase-3-aktivering. PARP er et substrat for caspase-3 [32]. Embelin behandling resulterede i kløvning af PARP. Aktivering af caspase-3 ved embelin korreleret med spaltning af PARP i tumorvæv. Samlet set har disse data, at embelin hæmmet celledeling og induceret apoptose i pancreas tumorvæv gennem hæmning af PCNA, Ki67, og aktivering af caspase-3 og spaltning af PARP.
Embelin Regulerer Bcl-2 familiemedlemmer og Cell Cycle Proteiner, og hæmmer Akt Aktivering i tumorvæv
medlemmerne af Bcl-2 familie kan enten fremme eller hæmme apoptose [33], [34]. Vækststandsning ved cellecyklusinhibitorer kan føre til induktion af apoptose [35]. Vi målte derfor virkningerne af embelin på ekspressionen af cellecyklusproteiner (cyclin D1, CDK-2, og CDK-6), og Bcl-2-familiemedlemmer (Bcl-2, og Bax) i tumorvæv ved Western blot-analyse og immunhistokemi. Som vist i fig. 5, embelin inhiberede ekspressionen af cellecyklus relaterede proteiner cyclin-D1, CDK-2 og CDK-6 i aspC-1 xenotransplanterede tumorer sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe. Endvidere embelin behandling af AsPC-1 xenotransplanterede mus resulterede i inhibering af anti-apoptotisk protein Bcl-2 og induktion af pro-apoptotisk protein Bax i tumorer sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe. Disse data antyder, at embelin kan regulere pancreascancer tumorvækst ved at forårsage cellecyklusstop og inducere apoptose.
(A), Ekspression af Bcl-2, Bax, cyklin D1, CDK2, CDK6 og phospho-Akt. Immunhistokemi blev udført som beskrevet i materialer og metoder. (B), blev Western blot-analyse udført for at måle ekspressionen af Bcl-2, Bax, cyklin D1, CDK-2, CDK-6, p-AKT (Ser473), og AKT. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
PI3K /Akt-signalvejen regulerer cellecyklusprogression og tumorigenese, og er konstitutivt aktiv i pancreascancer [36]. Anticancer midler, der inhiberer PI3K /Akt pathway kan udvikles til forvaltning af kræft i bugspytkirtlen. Vi måler derfor ekspressionen af phospho-Akt i tumorvæv (fig. 5). Embelin inhiberede ekspressionen af Pakt i tumorvæv isoleret fra aspC-1 xenotransplantater sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe. Samlet set antyder disse data at embelin inhiberer PI3K /Akt pathway i aspC-1 xenotransplanterede tumorer, og inhibering af Akt pathway kunne inducere standsning af cellens cyklus, undertrykke tumorcelleproliferation og bugspytkirtelkræft vækst.
Embelin inhiberer angiogenese
væksten i solide tumorer afhænger af angiogenese for tilførsel af næringsstoffer, vækstfaktorer og ilt [37]. Vaskulær endotelvækstfaktor er et secerneret vækstfaktor afgørende for angiogenese. VEGF funktioner i både fysiologiske og patologiske angiogenese, især i tumormetastaser, hvilket gør det til et attraktivt terapeutisk mål. Vi søgte derfor at måle effekterne af embelin på angiogenese ved at måle ekspressionen af VEGF og VEGFR i AsPC-1 xenotransplanterede tumorer. Som vist i fig. 6, behandling af tumorbærende mus med embelin resulterede i signifikant inhibering i VEGF og VEGFR ekspression i tumorvæv sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe.
(A), Immunhistokemi blev udført for at undersøge ekspressionen af VEGF, VEGFR, Cox -2, og IL-8 i tumorvæv isoleret fra kontrol- og embelin-behandlede mus. (B), blev Western blot-analyse udført for at måle ekspressionen af VEGF, VEGFR, Cox-2 og IL-8. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), Immunhistokemi blev udført for at undersøge ekspressionen af E-cadherin, snail, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9 i tumorvæv isoleret fra kontrol- og embelin-behandlede mus. (D), blev Western blot-analyse udført for at måle ekspressionen af E-cadherin, snail, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
cyclooxygenase-2 (COX-2) overekspression fremmer inflammation, endotelcelleproliferation, metastase og tumorigenese [38]. Vi undersøgte derfor, om embelin inhiberer ekspressionen af COX-2 i AsPC-1 xenotransplanterede tumorer. Som shwon i fig. 6, embelin inhiberede ekspressionen af COX-2 i tumorvæv isoleret fra aspC-1 xenotransplantater sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe. Disse data antyder, at embelin kan undertrykke inflammation og pancreas tumorvækst ved at undertrykke COX-2.
Cytokiner er blevet impliceret i initiering, progression, og metastase af faste tumorer og angiogenese [39]. Vi har for nylig rapporteret en deregulering af cytokin-ekspression og /eller signalering i bugspytkirtelkræft [14], [25], [31]. IL-8 /IL-8-receptor-aksen spiller en afgørende rolle i metastase og tumor vækst og også modulere tumormikromiljøet [39]. Vi målte derfor ekspressionen af IL-8 i tumorvæv isoleret fra kontrol- og embelin-behandlede xenotransplantater. Behandling af AsPC-1 xenotransplanteret mus med embelin resulterede i suppression af IL-8 sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe (fig. 6A og B). Disse data antyder, at inhibering af IL-8 /IL-8-receptor-aksen kan være betydelige i inhibering pancreas vækst kræft ved embelin.
Embelin inhiberer Markører for Epithelial-til-mesenchymal Transition (EMT) i AsPC-1 xenotransplantater
Epithelial-til-mesenkymale overgang og dens omvendte proces, mesenchymale-til epitel overgang (MET), spiller en vigtig rolle i embryogenese, stemness, kræft progression, metastase og kemoresistens. Adskillige signalveje og lovgivningsmæssige transkriptionelle netværk kan regulere EMT [40]. Et kendetegn for EMT er nedregulering af celleadhæsionsmolekyle E-cadherin, og opregulering af mesenchymale markør N-cadherin. En række transkriptionsfaktorer herunder zinkfinger snail homologer (Snail) og basiske helix-loop-helix faktorer såsom Twist, ZEB-1, og ZEB2, alle interagerer med E-box element i det proximale område af E-cadherin promotoren. Under EMT, de MMP’er fordøje den ekstracellulære matrix og basalmembran og således tillader celler at invadere og danne metastaser [41]. Vi har derfor målt effekten af embelin på ekspressionen af E-cadherin, sneglen, Slug, ZEB1, MMP-2 og MMP-9 i tumorvæv. Behandling af aspC-1 xenotransplanterede mus med embelin inducerede ekspressionen af E-cadherin og inhiberede ekspressionen af MMP-2, MMP-9, snail, Slug, og Zeb-1 i tumorvæv sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe (fig. 6 C og D). Vore data viser, at embelin kan inhibere /reverse pancreas tumormetastase ved at inducere ekspressionen af E-cadherin og hæmme dets tilknyttede transkriptionsfaktorer (sneglen, Slug, og ZEB1) og MMP’er (MMP-2 og MMP-9). Samlet set vores data viser, at embelin kan en potentiel hæmmer af tidlig metastaser.
Embelin Hæmmer Sonic Hedgehog Pathways, og op-regulerer TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5
Shh pathway fremmer celleinvasion, migration, metastase, og tumorvækst ved mediering et komplekst signalnet i pancreascancer [20], [42]. Inhibering af Shh pathway er blevet vist at undertrykke tumorvækst og metastase. Vi søgte derfor at undersøge effekten af embelin på Shh vej ved at måle ekspressionen af transskription faktorer Gli1 og Gli2. Gli1 regulerer sit eget udtryk. Behandling af AsPC-1 xenotransplanteret mus med embelin inhiberede ekspressionen af Gli1 og Gli2 sammenlignet med ubehandlede kontrol (fig. 7 A og B). Disse data antyder, at embelin kan inhibere AsPC-1 tumorvækst ved at undertrykke Shh pathway.
(A), Immunhistokemi blev udført for at måle ekspressionen af Gli1, Gli2, DR4 og DR5 i tumorvæv isoleret fra kontrol- og embelin -behandlede mus. (B), blev Western blot-analyse udført for at måle ekspressionen af Gli1, Gli2, DR4 og DR5. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol
Vi har vist, at aktiveringen af TRAIL-død receptor pathway inducerer apoptose i cancerceller [43] -. [45]. Da TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 induceres ved inhibering af Gli aktivitet [29], kan Shh hæmmere kombinere med liganden TRAIL at inducere apoptose. Vi har derfor undersøgt virkningerne af embelin på ekspressionen af TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvæv isoleret fra AsPC-1-xenografter (fig. 7 A og B). Behandling af AsPC-1 tumorbærende mus med embelin opreguleret ekspression af TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvæv sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe. Disse data tyder på, at embelin kan kombineres med døden receptor ligander (TRAIL eller agonistiske antistoffer) til behandling af kræft i bugspytkirtlen.
Embelin inhiberer vækst af kræft i bugspytkirtlen celler isoleret fra Kras
G12D Mus
KRAS-mutationer er fundet i ca. 95% af humane pancreatiske ductale adenocarcinomer [6]. Vi har derfor undersøgt virkningerne af embelin på vækst egenskaber og signalveje i mus bugspytkirtlen kræftceller isoleret fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus. Bugspytkirtelkræftceller blev isoleret fra mus og
in vitro
blev udført for at undersøge de biologiske virkninger af embelin. Embelin inhiberede cellelevedygtighed og kolonidannelse i muse bugspytkirtelkræftceller (fig. 8A). For at bekræfte den rolle, Shh, og AKT pathways på anti-proliferative virkninger af embelin, målt vi ekspressionen af komponenter af disse veje. Embelin hæmmede udtryk for Gli1 og Gli2 og deres downstream-target cyclin D1 i muse bugspytkirtelkræftceller (fig. 8B). Endvidere embelin inhiberede ekspressionen af phospho-Akt, en kinase meget aktiv i pancreascancer (fig. 8C). Disse data antyder, at embelin kan inhibere muse pancreas cancervækst ved at undertrykke Shh og Akt signalveje.
(A), blev Bugspytkirtelkræft celle isoleret fra 10-måneder gamle Kras
G12D mus. Celler blev behandlet med embelin (0-5 uM) til at måle cellernes levedygtighed og kolonidannelse ved 2 og 21 dage henholdsvis. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), blev mus bugspytkirtelkræftceller isoleret fra 10 måneder gamle Kras
G12D mus og behandlet med eller uden embelin (3 uM) i 36 timer. Ved slutningen af inkubationsperioden blev crud protein ekstraheret. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af Gli1 og Gli2. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), var musen bugspytkirtelkræftceller isoleret fra 10 måneder gamle Kras
G12D mus og behandlet med eller uden embelin (3 uM) i 36 timer. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af phospho-Akt (Pakt) og Akt. Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
Diskussion
Kræft i bugspytkirtlen er en af de mest aggressive og ødelæggende ondartetheder. Vi har vist, for første gang, at embelin hæmmede levedygtighed bugspytkirtelkræft cellelinjer
in vitro
AsPC-1 xenotransplanteret tumorvækst der var forbundet med undertrykkelse af Akt og Shh veje. Desuden embelin hæmmede væksten af kræft i bugspytkirtlen celler isoleret fra Kras
G12D mus gennem undertrykkelse af Akt og Shh veje. Disse tilgange er blevet vist at spille vigtige roller i pancreas carcinogenese. Embelin inhiberede tumorcelleproliferation, og cellecyklus, og apoptose. Embelin inhiberede også markører for angiogenese og metastase. Interessant behandling af aspC-1 xenotransplanterede mus med embelin resulterede i opregulering af dødsreceptor DR4 og DR5, kunne tyder kombinationen af embelin med TRAIL-agonister være en levedygtig strategi til behandling af human pancreascancer.
PI3K /Akt signalvejen regulerer celleproliferation og overlevelse, og er ofte og afvigende aktiveret i PDAC. I vores undersøgelse embelin inhiberede phosphorylering /aktivering af Akt i humane og muse bugspytkirtelkræftceller og væv. Aktivering af Kras resulterer i phosphorylering og aktivering af Akt kinase. Da embelin induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller huser Kras mutation ved at undertrykke Akt vej, hvilket tyder de kliniske fordele mod human bugspytkirtelkræft hvor Kras er mest muteret. I en nylig undersøgelse, den heterozygote tab af PTEN i Kras
G12D mutant mus fremskyndet udviklingen af acinære-til-duktalt metaplasi (ADM), mPanIN, og PDAC inden for et år [18]. Denne undersøgelse tyder stærkt rolle PTEN /PI3K /Akt og Kras signalveje i både bugspytkirtelkræft initiering og progression.
Shh er unormalt udtrykt i pancreas adenocarcinom og dens forløber læsioner (Panin). Pancreas of PDX-Shh-mus (hvor Shh er fejl-udtrykt i pancreas endoderm) udvikler abnorm rørformede strukturer, Panin-1 og -2 [46]. Desuden er disse Panin læsioner indeholder også mutationer i K-ras og overudtrykke HER-2 /neu, som er genetiske mutationer findes tidligt i udviklingen af human pancreascancer. Vi har for nylig vist, at komponenterne i Shh pathway er stærkt udtrykt i humane pancreas cancer stamceller og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, og flere kemoforebyggende midler hæmmede kræft i bugspytkirtlen vækst [19], [26], [27], [47]. Ligeledes i den foreliggende undersøgelse, embelin inhiberet AsPC-1 tumorvækst og muse PDAC cellevækst ved at undertrykke Shh pathway. I en anden undersøgelse blev det påvist, at inhibering af Hh-vejen faldt celleproliferation og apoptose gennem hæmning af PI3K /Akt pathway og cancer stamceller [48]. Vi har endvidere påvist, at inhibering af Shh signalvejen signifikant inhiberede EMT ved at undertrykke aktivering af transkriptionsfaktorer Sneglen og Slug, som blev korreleret med signifikant reduceret bugspytkirtelkræft stamcelle invasion [26], [27], [47], [ ,,,0],49], [50], hvilket tyder på, at Shh signalvejen er involveret i tidlig metastase. Samlet tyder disse data, at inhibering af Shh pathway kan være en potentiel molekylært mål af nye terapeutiske strategier for human pancreascancer.
akkumulerende beviser tyder på en vigtig rolle for COX-2 i patogenesen af en lang række maligniteter. COX-2 opreguleres i pancreas PDAC [38]. COX-2 deletion i Pdx1 + pancreasstamfaderceller forsinker væsentligt udvikling af PDAC i mus med K-ras-aktivering og PTEN haploinsufficiency. Omvendt COX-2-overekspression fremmer tidlig indtræden og progression af PDAC i K-ras musemodel. Tab af PTEN funktion er en kritisk faktor ved bestemmelse letal PDAC indtræden og samlet overlevelse. Mekanistisk, COX-2-overekspression øger p-Akt-niveauer i pro-læsioner af Pdx1 (+); K-ras (G12D) (/+); PTEN (lox) (/+) mus i fravær af PTEN LOH. I modsætning hertil COX-2 deletion i den samme indstilling formindsker p-Akt niveauer og forsinkelser cancer progression. Denne undersøgelse tyder på en vigtig celle iboende rolle for COX-2 i tumor initiering og progression gennem aktivering af PI3K /Akt pathway. I fravær af indre COX-2, PDAC vinder udvikler med nedsat FKBP5 og forøget GRP78 ekspression, to alternative veje fører til Akt aktivering [38]. Derfor kan simultane hæmning af både COX-2 og Akt repræsenterer en hidtil ukendt strategi til forvaltning af pancreascancer.
Tumorceller undergår EMT er også kendt for at øge udskillelsen af specifikke faktorer, herunder cytokiner, chemokiner og vækst faktorer, som kunne spille en vigtig rolle i tumor progression [39], [51]. I den foreliggende undersøgelse embelin inhiberede ekspression af IL-8 i AsPC-1 tumorvæv. Således kan IL-8-signalering blokade af embelin tilvejebringe et middel til at inhibere eller vende EMT. Endvidere kunne hæmning af Snail, Slug og ZEB-1-ekspression og opregulering af E-cadherin ved embelin regulere kræft i bugspytkirtlen progression gennem dens indflydelse på tilbageførsel af EMT. Følgelig er inhibering af ekspressionen eller funktionen af EMT-inducerende transkriptionsfaktorer i pancreascancer forventes at føre til nye terapeutiske strategier.
cancercelle metastase er en trinvis proces, som omfatter frigørelse af celler fra den primære tumor
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.