PLoS ONE: Dual PI3K /mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 inducerer tumorregression i en gensplejset mus Model of PIK3CA Wild-Type Kolorektal Cancer

Abstrakt

Formål

For at undersøge

in vitro

in vivo

effekten af ​​den dobbelte PI3K /mTOR-hæmmer NVP-BEZ235 i behandling af

PIK3CA

vildtype kolorektal cancer (CRC).

Eksperimentel design

PIK3CA

mutant og vildtype humane CRC cellelinjer blev behandlet

in vitro

med NVP-BEZ235, og de deraf følgende virkninger på proliferation, apoptose, og signalering blev vurderet. Colon tumorer fra en gensplejset mus (GEM) model for sporadisk vildtype

PIK3CA

CRC blev behandlet

in vivo

med NVP-BEZ235. De resulterende effekter på makroskopisk tumorvækst /regression, proliferation, apoptose, angiogenese, og signalering blev undersøgt.

Resultater

In vitro

behandling af CRC-cellelinjer med NVP- BEZ235 resulterede i forbigående PI3K blokade, vedvarende fald i mTORC1 /mTORC2 signalering og et tilsvarende fald i celle levedygtighed (median IC

50 = 9,0-14,3 nM). Lignende effekter blev set i parrede isogene CRC cellelinjer, der afveg kun i nærvær eller fravær af en aktiverende

PIK3CA

mutant allel.

In vivo

behandling af colon tumor-bærende mus med NVP-BEZ235 resulterede i forbigående PI3K hæmning og vedvarende blokade af mTORC1 /mTORC2 signalering. Langsgående tumor overvågning ved optisk koloskopi viste en stigning på 97% i tumorstørrelse i kontrolmus (p = 0,01) vs. et fald på 43% (p = 0,008) i behandlede mus.

Ex vivo

analyse af NVP-BEZ235-behandlede tumorer demonstrerede et fald 56% i proliferation (p = 0,003), ingen virkninger på apoptose, og en 75% reduktion i angiogenese (p = 0,013).

konklusioner

Disse undersøgelser giver den prækliniske rationale for studier undersøger effekten af ​​den dobbelte PI3K /mTOR-hæmmer NVP-BEZ235 i behandling af

PIK3CA

vildtype CRC.

Henvisning: Roper J, Richardson MP, Wang WV, Richard LG, Chen W, kaffe EM, et al. (2011) Dual PI3K /mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 inducerer tumorregression i en gensplejset mus Model af

PIK3CA

Wild-Type kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10,1371 /journal.pone.0025132

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Juni 14, 2011; Accepteret: August 25, 2011; Udgivet: 26 September, 2011

Copyright: © 2011 Roper et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (2U01CA084301) og National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme (NIDDK) (5K08DK7803325, R03DK088014, og T32-DK07542). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i 2011 vil kolorektal cancer (CRC) fortsætte med at være den tredje mest almindelige årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [1]. På trods af den voksende arsenal af kemoterapeutiske midler, den mediane overlevelse for patienter med metastaserende CRC er stadig mindre end 20 måneder, hvilket understreger det presserende behov for at udvikle nye terapeutiske tilgange [2].

pattedyr mål for rapamycin ( mTOR) er en serin /threonin-kinase, som regulerer cellulær proliferation og apoptose. mTOR binder regulatoriske associeret protein af mTOR (Raptor) og mammale LST8 /G-protein-β-underenheden lignende protein (mLST8 /GβL) til dannelse af mTOR komplekse 1 (mTORC1), som fremmer translation gennem phosphorylering af p70 S6 kinase (S6K), S6 ribosomalt protein (S6), og eukaryot initieringsfaktor 4E bindende protein 1 (4E-BP1). Alternativt kan mTOR binde rapamycin-ufølsom følgesvend af mTOR (Rictor), mLST8 /GβL og pattedyr stress-aktiveret protein kinase interagerende protein 1 (mSIN1) at danne mTOR kompleks 2 (mTORC2) [3], [4].

Den opstrøms phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalvejen kan aktivere mTOR. Klasse IA PI3K’er aktiveres af vækstfaktor-receptor (RTK’er) og er sammensat af en heterodimer bestående af en p110α /p110β katalytiske og en p85 regulatoriske underenhed [5].

PIK3CA

(phosphatidylinositol 3-kinase, katalytisk, α-polypeptid) gen, som koder p110α ofte muteret i mange humane cancere, herunder CRC [6]. Punktmutationer i

PIK3CA

klynge på to hotspots: E545K i den spiralformede domæne (exon 9) og H1047R i det katalytiske kinasedomænet (exon 20). Disse mutationer øger p110α aktivitet og fremme CRC cellevækst, invasion og migration

in vitro

via aktivering af PI3K pathway [7]. Mutationer i de spiralformede og katalytiske domæner af

PIK3CA

giver væsentlige identiske fænotyper i humane CRC cellelinier [7]. AKT er en kritisk nedstrøms effektor af PI3K pathway og fremmer cellevækst og overlevelse via en række mekanismer, herunder phosphorylering af TSC2, hvilket resulterer i mTORC1 aktivering [5]. Fuld aktivering af AKT opnås efter fosforylering på Thr308 og Ser473 af PDK1 og mTORC2 henholdsvis [5], [8] – [11].

På grund af sin centrale rolle i carcinogenese, mTORC1 blokade er en attraktiv terapeutisk strategi for CRC. Behandling af Apc Δ716 mus med mTORC1 inhibitoren everolimus inhiberer cellulær proliferation og tumorangiogenese, hvilket resulterer i et fald i både antallet og størrelsen af ​​intestinale tumorer [12]. Vi har for nylig rapporteret, at behandlingen af ​​en gensplejset mus (GEM) model for sporadisk CRC med mTORC1 inhibitor rapamycin resulterer i en reduktion i individuel tumorvækst 80%, som observeret af langsgående koloskopi overvågning [11]. Imidlertid kan den kliniske effekt af mTORC1 blokade mildnet af den ledsagende tab af en mTORC1-afhængig negativ feedback loop på PI3K-signalering (afspejlet af øgede AKT phosphorylering ved Thr308), og fortsatte mTORC2-medieret aktivering af AKT gennem phosphorylering ved Ser473 [9 ] – [14]. Faktisk et klinisk fase I studie undersøger effekten af ​​mTORC1 inhibitor everolimus i fremskredne solide tumorer viste beskeden fordel i kun én af 16 kolorektal kræftpatienter og generelt øget fosforylering af AKT på Ser473 [13]. Samlet set fremgår det, at terapeutiske strategier, hvor PI3K og mTOR sideløbende inhiberes kan være mest effektive.

NVP-BEZ235 (Novartis) er en dobbelt pan-klasse I PI3K og mTOR kinase inhibitor, der har vist sig at reducere tumorvækst i et antal forskellige xenograft og flere gensplejset mus (GEM) modeller og er i øjeblikket i kliniske forsøg [14] – [50]. Der har været forslag om, at anvendelsen af ​​sådanne midler kan være begrænset til tumorer med aktiverende mutationer i

PIK3CA

[51], [52]. Som aktivering

PIK3CA

mutationer ses i kun 17% af CRC, ville det betyde sådanne midler kan målrettes mod kun en lille del af patienterne [53]. Fordi NVP-BEZ235 hæmmer vildtype og mutant former for

PIK3CA

med sammenlignelig effekt [32], vi hypotese, at NVP-BEZ235 kan have betydelig effekt i behandlingen af ​​

PIK3CA

Wild- skriv CRC.

i dette manuskript, beskriver vi resultaterne fra

in vitro

behandling undersøgelser, der viser sammenlignelig effekt af NVP-BEZ235 mod både

PIK3CA

mutant og vildtype human CRC cellelinier. Vi beskriver også resultater fra

in vivo

behandling undersøgelser, der påviser signifikant effekt i en PERLE model for sporadisk vildtype

PIK3CA

CRC. Tilsammen vores resultater giver en overbevisende præklinisk rationale for kliniske forsøg for at undersøge anvendelsen af ​​NVP-BEZ235 i behandling af

PIK3CA

vildtype CRC patienter.

Materialer og metoder

In vitro

behandling af human CRC cellelinjer

HCT116 (

PIK3CA

mutant; kinasedomæne på H1047R), DLD-1 (

PIK3CA

mutant; spiralformet domæne ved E545K), og SW480 (

PIK3CA

vildtype) humane CRC cellelinjer (ATCC) og isogene DLD-1

PIK3CA

mutant- og vildtypeceller (opnået fra B. Vogelstein) blev opretholdt i DMEM (Invitrogen) med 10% FBS og 1 × penicillin /streptomycin (Invitrogen). Celler blev udpladet ved forskellige initiale densiteter (HCT116: 3.000 celler /brønd, DLD-1: 5.500 celler /brønd, SW480: 4.500 celler /brønd, DLD-1

PIK3CA

mutant: 7.000 celler /brønd, og DLD -1

PIK3CA

vildtype: 9.000 celler /brønd) at tage højde for differentierede vækst kinetik. Efter 16 timer blev cellerne inkuberet med stigende koncentrationer af NVP-BEZ235 (Novartis), og lægemiddelholdige vækstmedium blev ændret hver 24 timer. Cellelevedygtighed blev vurderet 16 timer efter den indledende udpladning og 48 timer efter påbegyndelse af lægemiddelbehandling under anvendelse af kolorimetrisk MTS-assayet CellTiter 96® Aqueous One Solution celleproliferationsassay (Promega), i henhold til fabrikantens anvisninger. Cellelevedygtighed efter lægemiddelbehandling blev normaliseret med den for ubehandlede celler også dyrket i 48 timer. IC

50 værdier blev beregnet ved hjælp af fire parameter ikke-lineær regression i GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Til Western blot-analyse blev celler udpladet med 0 nM eller maksimal inhiberende dosis (500 nM) NVP-BEZ235 for 2, 6, 24 eller 48 timer.

Sekventering af colon tumorer fra en GEM model for sporadisk CRC

C57BL /6J

Apc

betingede knockout-mus (APC CKO) blev behandlet med Adeno-Cre, som tidligere beskrevet [11]. Efter obduktion blev 10 tumorprøver opsamlet i 1 ml RNA Senere (Invitrogen, Inc), opbevaret natten over i 4 ° C, derefter fjernet fra RNA Senere og arkiveres i -80 ° C. RNA blev ekstraheret fra prøver vha RNeasy (Qiagen, Inc.), og cDNA blev genereret med revers transkriptase (RT Omniscript, Qiagen, Inc.). Primere designet af undersøgelsens forfattere blev brugt til at skabe 553 bp og 477 bp amplikoner (PCR udføres ved hjælp af Platinum PCR SuperMix High Fidelity, Invitrogen, Inc) spænder codon 532-554 af exon 9 (spiralformet område; 9F: 5 ‘GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3’, 9R: 5 ‘TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3’) og c1011-1062 af exon 20 (kinasedomæne; 20F: 5 ‘ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3’, 20R: 5 ‘TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3’) i

Pik3ca

gen henholdsvis som omfatter mutation hotspot regioner. Sanger sekventering af amplikoner blev udført på biopolymerer Facility ved Harvard Medical School, og resultaterne analyseres med Sequencher 4.10.1 (Gene Codes, Inc).

In vivo

behandling af en GEM model for sporadiske CRC

Apc CKO mus blev behandlet med Adeno-Cre og efterfulgt af optisk koloskopi, som tidligere beskrevet [11]. Som coloskopisk metrik for tumorstørrelse blev tumorstørrelse Index (TSI) beregnet som (tumor-området /colon lumen område) × 100 (%). Tumor-bærende mus blev randomiseret til behandling med enten kontrol vehikel alene (n = 8) eller 45 mg /kg legemsvægt NVP-BEZ235 i 10% 1-methyl-2-pyrrolidon /90% PEG 300 (n = 8) ved daglig oral sondeernæring i 28 dage. Dosis behandling blev valgt baseret på litteratur indikerer, at 40-50 mg /kg legemsvægt NVP-BEZ235 effektivt behandler murine tumor modeller uden bivirkninger [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Baseret på farmakokinetiske undersøgelser, som viser maksimal vævskoncentration en time efter NVP-BEZ235 indgivelse blev tumorbærende mus aflivet en time efter sidste behandling [32]. Colon tumor volumen blev vurderet ved hjælp af skydelære (bredde x længde x højde) og tumorer blev høstet for både western blot analyse og immunhistokemi.

Western blot-analyse

Koncentrationer af hele celler eller tumorlysater blev bestemt af Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). 10 ug og 25 ug protein lysat i helcelle og tumor henholdsvis blev separeret på 10% SDS /PAGE-gel, overført til nitrocellulosemembran, blokeret i 1% BSA i en time, inkuberet ved stuetemperatur i to timer med primært antistof og en time sekundært antistof. Påvisning blev udført under anvendelse af Amersham ™ ECL ™ Western Blot Detection Reagents (GE Healthcare). p-AKT Thr308 (1:1000 fortynding), p-AKT Ser473 (1:2000 fortynding), total AKT (1:1000 fortynding), p-S6 Ser240 /244 (1:3000 fortynding), p-S6 Ser235 /236 (1:1000 fortynding), S6 (1:1000 fortynding), spaltet caspase 3 (1:1000 fortynding), og spaltes PARP (1:1000 fortynding) blev opnået fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA). β-actin (1:5000 fortynding) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Peroxidase AffiniPure Donkey Anti Rabbit Ig sekundært antistof (1:10,000 fortynding) blev opnået fra Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) [11].

Immunhistokemi

Fem um paraffin vævssnit blev afparaffiniseret i xylen efterfulgt af alkohol rehydrering. Antigen genfinding blev udført i 1 × citratbuffer (pH 6,0) (Zymed) ved anvendelse af en medicinsk Decloaking afdeling (Biocare Medical). Objektglas blev blokeret ved stuetemperatur med peroxidase blokerende reagens (DAKO), normal æsel /kaninserum, og avidin /biotin Blocking Kit (Vector Laboratories). Objektglas blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primært antistof og 30 minutter ved stuetemperatur med sekundært antistof. Den Vectastain ABC kit (Vector Laboratories) blev anvendt til detektion ifølge producentens anvisninger. Slides blev farvet med Liquid DAB + Substrat Chromogen System (Dako) pr producentens anvisninger og kontrastfarvet med Mayers hematoxylinopløsning og Scotts Bluing løsning. p-AKT Ser473 (1:50 fortynding), p-S6 Ser240 /244 (1:50 fortynding), p-S6 Ser235 /236 (1:100 fortynding), blev opnået fra cellesignalering Technologies (Beverly, MA). CD31 (1:100 fortynding) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). KI-67 (1:100 fortynding) blev opnået fra US Biological (Swampscott, MA). TUNEL-assay (Apoptag) blev indkøbt fra Millipore (Billerica, MA) [11]. Ki-67 proliferationsindeks blev beregnet som det gennemsnitlige antal KI-67 positive celler /totale antal af kirtel celler pr højstyrkefelt (gennemsnit af 16 højeffekt felter) × 100 og mikrokar densitet (MVD) blev beregnet som antallet af CD31 positive celler pr høj effekt felt (gennemsnit af 16 høj effekt felter). TUNEL positivitet indeks blev beregnet som gennemsnitlig antal TUNEL-positive celler /totale antal af kirtel celler pr højstyrkefelt (gennemsnit af 16 højeffekt felter) × 100. Målingerne blev udført af tre blindede, uafhængige observatører i fire kontrol og fire behandlede tumorer.

Statistik

Sammenligninger af endelige tumor volumen, KI-67, MVD, og ​​apoptotiske celler mellem kontrol og NVP- BEZ235-behandlede kohorter blev beregnet ved hjælp af de to-tailed Uafhængige-Samples T Test. Præ- og TSI efterbehandling værdier blev sammenlignet med Wilcoxon-test. P 0,05 blev betragtet som signifikant for alle analyser. Alle analyser blev beregnet ved hjælp af SPSS 18,0 til Windows (IBM, Inc).

Resultater

In vitro

NVP-BEZ235 behandling af humane CRC cellelinjer falder celleproliferation men har ingen effekt på apoptose

for at undersøge effekten af ​​

in vitro

NVP-BEZ235 behandling på cellulær levedygtighed, tre humane CRC cellelinjer (HCT116, DLD-1, og SW480) blev behandlet med stigende mængder af NVP-BEZ235 i 48 timer, og cellulær levedygtighed blev vurderet ved en kolorimetrisk MTS assay. Disse undersøgelser afslørede en lignende dosis-afhængigt fald i levedygtighed efter NVP-BEZ235 behandling (gennemsnitlig IC

50 af tre separate forsøg = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5 og 12,0 ± 1,6 nM for HCT116, DLD-1, og SW480 cellelinier, henholdsvis; p = 0,74) for alle tre cellelinier (figur 1a). For at bestemme om den observerede nedgang i cellulær levedygtighed efter NVP-BEZ235 behandling resulterede fra en induktion af apoptose, western blot-analyse for spaltet caspase-3 og spaltes PARP blev udført, afslørede ingen stigning i disse apoptotiske markører med NVP-BEZ235 behandling (figur 1B ). Tilsammen disse undersøgelser tyder på, at

in vitro

behandling med NVP-BEZ235 resulterer i en tilsvarende reduktion i cellulær proliferation i to CRC cellelinjer huser tydelig

PIK3CA

mutationer (HCT116 og DLD-1) samt i en

PIK3CA

vildtype kolorektal cancercelle (SW480), uden virkning på apoptose.

(a) Cellelevedygtighed af HCT116, DLD-1, og SW480 CRC celle linjer blev vurderet ved MTS-assay efter behandling med stigende koncentrationer (0-500 nM) på NVP-BEZ235 i 48 timer. De viste resultater er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. (B) Western blot-analyse for p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, p-S6

Ser235 /236, kløvet caspase 3, og kløvet PARP blev udført efter 2, 6, 24, og 48 timers inkubation med (-). 0 eller (+) 500 nM NVP-BEZ235

In vitro

NVP-BEZ235 behandling af humane CRC cellelinjer resulterer i vedvarende mTORC1 og mTORC2 hæmning, men forbigående PI3K blokade

for at undersøge effekten af ​​

in vitro

NVP-BEZ235 behandling på PI3K (p-AKT

Thr308) , mTORC1 (p-S6

Ser235 /236 og p-S6

Ser240 /244), og mTORC2 (p-AKT

Ser473) mTOR signalering, blev udført western blot analyse. Efter to timers NVP-BEZ235 behandling, niveauer af p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, og p-S6

Ser240 /244 var alle signifikant faldt. Ud fra følgende betragtninger blev observeret en vedvarende fald i niveauerne af p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, og p-S6

Ser240 /244, fuld hæmning af p-AKT

Thr308 var tabt i så lidt som seks timer (figur 1b). Tilsammen disse resultater tyder på, at

in vitro

NVP-BEZ235 behandling resulterer i vedvarende hæmning af mTORC1 og mTORC2 signalering, men at PI3K blokade er forbigående.

Effekten af ​​

in vitro

NVP-BEZ235 behandling af humane CRC cellelinjer afhænger ikke PIK3CA mutationsstatus

sammenlignelig effekt af NVP-BEZ235 behandling i

PIK3CA

mutant (HCT116 og DLD-1) og

PIK3CA

vildtype (SW480) humane CRC cellelinier antyder, at dets kliniske effekt ikke kan være begrænset til de patienter, hvis tumorer indeholder aktivering

PIK3CA

mutationer. For yderligere at undersøge denne mulighed, vurderede vi effekten af ​​NVP-BEZ235 på cellulær proliferation og intracellulær cellesignalering i parrede

PIK3CA

mutant og vildtype cellelinjer.

PIK3CA

mutant cellelinje blev afledt fra DLD-1 til afbrydelse af vildtype

PIK3CA

allel ved målrettet homolog rekombination, mens

PIK3CA

vildtype celle linje blev udledt gennem afbrydelse af mutant

PIK3CA

allel (en slags gave fra B. Vogelstein) [7]. Som sådan er den genetiske sammensætning af disse celler afviger kun på

PIK3CA

locus, hvilket gør disse ellers perfekt isogene kontrol. Vi fandt lignende IC50-værdier for NVP-BEZ235 i både

PIK3CA

mutant og vildtype DLD-1 celler (gennemsnit IC

50 af tre separate forsøg = 15,1 ± 6,0 og 12,1 ± 4,3 nM for DLD-1

PIK3CA

mutant og vildtype-cellelinier, henholdsvis; p = 0,82, figur 2A). Western blot analyse af p-AKT og p-S6 afslørede vedvarende inhibering af p-AKT

Ser473, p-S6

Ser235 /236, og p-S6

Ser240 /244; imidlertid inhibering af p-AKT

Thr308 var forbigående i begge cellelinier (figur 2B). Desuden har NVP-BEZ235 behandling ikke øge niveauerne af spaltet caspase-3 og spaltes PARP i enten cellelinje (figur 2B). Samlet set disse resultater tyder på, at

PIK3CA

mutationsstatus ikke forudsige effekten af ​​NVP-BEZ235 behandling i humane CRC-cellelinjer.

(A) Cell levedygtighed mutant og vildtype isogeniske

PIK3CA

celler blev vurderet ved MTS-assay efter behandling med stigende koncentrationer (0-500 nM) på NVP-BEZ235 i 48 timer. De viste resultater er gennemsnittet af fire uafhængige forsøg. (B) Western blot-analyse for p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, p-S6

Ser235 /236, kløvet caspase 3, og kløvet PARP blev udført efter 2, 6, 24, og 48 timers inkubation med (-). 0 eller (+) 500 nM NVP-BEZ235

In vivo

NVP-BEZ235 behandling inducerer tumorregression i en PERLE model for sporadisk PIK3CA vildtype CRC

for at undersøge effekten af ​​

in vivo

NVP-BEZ235 behandling på colon tumorvækst, vi brugte en roman GEM model for sporadisk CRC at vi for nylig har beskrevet [11]. Adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase (Adeno-Cre) blev anvendt til at inducere colon tumorer i floxet

Apc

mus. Tumorer fra 10 mus blev analyseret for tilstedeværelse af aktiverende mutationer ved direkte sekventering af exon 9 og 20 i

Pik3ca

gen. Ingen mutationer blev identificeret, hvilket antyder, at disse mus er repræsentative for

PIK3CA

vildtype CRC. Optisk koloskopi blev anvendt til at randomisere behandling af sammenligneligt mellemstore colon tumorer med kontrol lægemiddelvehikel eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 ved daglig oral sondeernæring i 28 dage. Vi bemærkede ingen toksicitet eller bivirkninger under dette stof behandlingsregime. Efterfølgende langsgående vækst eller regression af individuelle colon tumorer blev bestemt ved optisk koloskopi, som tidligere beskrevet [11]. For hver tumor blev en relativ tumorstørrelse Index (TSI) metrisk beregnet som tumorstørrelse (T) normaliseret til colon luminal område (L) (figur 3A).

Mus med colon-tumorer blev randomiseret til behandling med kontrol fortyndingsmiddel (N = 8) eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 (N = 8) ved daglig oral sondeernæring i 28 dage. Resulterende colon tumorvækst eller regression blev serielt undersøgt ved optisk koloskopi. (A) tumorstørrelse Index (TSI) blev beregnet som Tumor Area (T) divideret med Lumen Area (L) x 100. (B) repræsentant tumor koloskopi stillbilleder under behandlingen 28 dages periode. (C) Tumorvolumen af ​​kontrol og NVP-BEZ235-behandlede tumorer ved obduktion (gennemsnit 65 mm

3 vs. 5 mm

3; p = 0,01). (D) Sidste TSI vs. Tumor Volume (R

2 = 0,89, P 0,0001). Ændring i gennemsnitlig TSI for (E) kontrol (32% forbehandling vs. 57% post-behandling, P = 0,01) og (F) behandlet (32% vs. 20%, p = 0,02) kohorter.

Et repræsentativt tidsforløb for koloskopi billeder til kontrol (n = 8) og NVP-BEZ235-behandlede tumorer (n = 8) er vist i figur 3B. Tumorvolumen ved obduktion var signifikant større i kontrol vs. behandlede grupper (65 mm

3 vs. 5 mm

3; p = 0,01, figur 3C). I overensstemmelse med vores tidligere analyser [11], den endelige TSI i begge behandlingsgrupper positivt korreleret med tumor volumen ved obduktion (R

2 = 0,89, p = 0,0001, Figur 3D). Den gennemsnitlige TSI i kontrolgruppen steg betydeligt i behandlingsperioden (32% forbehandling vs. 57% post-behandling, p = 0,01, figur 3E), mens der i NVP-BEZ235 kohorten faldt betydeligt (36% vs. 20%, p = 0,008, figur 3F). Hver tumor i kontrolgruppen steg i størrelse; behandlede tumorer alle faldt i størrelse. Tilsammen viser disse resultater, at

in vivo

behandling med NVP-BEZ235 resulterer i signifikant regression i

PIK3CA

vildtype-colon tumorer.

In vivo

NVP-BEZ235 behandling af en GEM model for sporadiske CRC resultater i vedvarende mTORC1 og mTORC2 hæmning, men forbigående PI3K blokade

for at undersøge effekten af ​​

in vivo

NVP-BEZ235 behandling på PI3K og mTOR signalering, blev western blot-analyse udført i colon tumorer, der blev høstet én time efter sidste dosis lægemiddel på dag 5 og 28 i behandlingen. Western blot-analyse for niveauer af p-AKT

Thr308, p-S6

Ser240 /244, og p-AKT

Ser473 blev udført som surrogater for aktivering af PI3K, mTORC1, og mTORC2 veje, henholdsvis. En vedvarende fald i niveauet af p-AKT

Ser473 og p-S6

Ser240 /244 blev observeret i tumorerne i mus behandlet med NVP-BEZ235, sammenlignet med kontroldyr fortyndingsmiddel (figur 4A og 4B). Disse resultater blev bekræftet ved tumor immunhistokemi (figur 4C). Som med vores

in vitro

undersøgelser, en indledende fald i niveauet af p-AKT

Thr308 blev observeret ved fem dage efter behandlingen, men normaliseret ved 28 dage (figur 4A og 4B). Tilsammen disse resultater tyder på, at

in vivo

NVP-BEZ235 behandling resulterer i vedvarende hæmning mTORC1 og mTORC2, men forbigående PI3K blokade.

Mus med colon tumorer blev randomiseret til behandling med kontrol fortynder eller 45 mg /kg NVP-BEZ235 ved daglig oral sondeernæring i fem dage. Western blot analyse af p-AKT

Thr308, p-AKT

Ser473, og p-S6

Ser240 /244 blev udført i tumorer behandlet med (-) kontrol fortyndingsmiddel eller (+) NVP-BEZ235 for ( A) fem og (B) 28 dage. (C) Immunhistokemi af p-AKT

Ser473, p-S6

Ser240 /244, og p-S6

Ser235 /236 blev udført i tumorer behandlet med kontrol fortyndingsmiddel eller NVP-BEZ235 i 28 dage.

In vivo

NVP-BEZ235 behandling af en GEM model for sporadisk CRC hæmmer spredning, har ingen effekt på apoptose, og blokerer tumorangiogenese

for at undersøge virkningerne af

in vivo

NVP-BEZ235 behandling på celleproliferation blev colon tumorer undersøgt ved immunhistokemi for spredning markør KI-67. Denne analyse viste, at proliferation faldt med 56% efter 28 dages NVP-BEZ235 behandling (p = 0,003, figur 5A). For at vurdere effekten af ​​NVP-BEZ235 behandling på cellulær apoptose blev colon tumorer undersøgt af TUNEL assay. Ingen forskelle blev set mellem tumorer behandlet med kontrol fortyndingsmiddel og NVP-BEZ235 (p = 0,9, figur 5B). Som PI3K og mTOR veje spiller en væsentlig rolle i tumorangiogenese [54], [55], vi undersøgt virkningerne af NVP-BEZ235 behandling på mikrokardannelse densitet (MVD) gennem immunhistokemi for endotel markør CD31. Denne analyse viste, at MVD faldt med 75% efter 28 dages NVP-BEZ235 behandling (p = 0,013, figur 5C). Tilsammen disse resultater tyder på, at

in vivo

behandling med NVP-BEZ235 resulterer i et betydeligt fald i tumor spredning, ikke inducerer cellulær apoptose, og hæmmer tumor angiogenese.

(A) Repræsentant immunhistokemi for proliferationsmarkør KI-67 efter behandling med kontrol fortyndingsmiddel eller NVP-BEZ2355 i 28 dage (p = 0,003). KI-67 proliferationsindeks blev beregnet som det gennemsnitlige antal positive tumorceller pr højstyrkefelt. (B) TUNEL immunohistokemi blev udført i tumorer behandlet med kontrol fortyndingsmiddel eller NVP-BEZ235 i 28 dage (p = 0,9). TUNEL-farvning blev kvantificeret som procent positive celler pr høj powered felt. (C) repræsentant immunhistokemi for endotel markør PECAM efter behandling med kontrol fortyndingsmiddel eller 45 mg /kg NVP-BEZ2355 (p = 0,013). Mikrokar tæthed blev beregnet som gennemsnitlige antal positive fartøjer pr høj effekt felt.

Diskussion

På grund af deres centrale rolle i initiering og progression af CRC, blokade af mTOR og PI3K signalveje har vist sig som en overbevisende mål for udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske midler CRC [10], [56] – [59]. Vi og andre har vist, at effekten af ​​mTORC1 pathway hæmning i prækliniske CRC modeller [11], [12]. Men en tidlig klinisk forsøg undersøger mTORC1 inhibitorer i humane CRC patienter viste beskedne resultater, måske på grund af tab af en mTORC1-afhængige feedback-loop, der begrænser PI3K aktivering og /eller fortsat mTORC2-medieret aktivering af AKT [3], [60]. Tilsammen ser det ud dual PI3K /mTOR-hæmmere, såsom NVP-BEZ235, er nødvendige for maksimal terapeutisk effekt.

Nogle undersøgelser har antydet, at

PIK3CA

mutant kræftformer er “oncogenically afhængige” til PI3K signalering, hvilket fører til øget følsomhed over for PI3K-hæmmer [7], [61], [62]. Imidlertid har en gruppe rapporteret ingen sammenhæng mellem

PIK3CA

mutationsstatus og reaktion på PI3K inhibitorer [63]. Ikke desto mindre har en anden gruppe rapporteret udelukkende rettet mod

PIK3CA

mutant patienter til PI3K /mTOR terapi [64]. Som

PIK3CA

mutationer ses i kun 17% af menneskers CRC, ville denne tilgang væsentlig grad begrænser den kliniske effekt af disse midler [53]. Fordi NVP-BEZ235 lige hæmmer mutant og vildtype former for

PIK3CA

, vi hypotese, at NVP-BEZ235 ville have signifikant effekt i human vildtype

PIK3CA

CRC [32]. Til støtte for dette, fandt vi sammenlignelig følsomhed over for

in vitro

NVP-BEZ235 behandling

PIK3CA

mutant (HCT116, kinasedomæne mutation, DLD-1, spiralformet domæne mutation) og

PIK3CA

vildtype (SW480) CRC cellelinier, såvel som i matchede

PIK3CA

mutant og vildtype isogene cellelinier. Direkte sekventering af de varme spot regioner på exon 9 og 20 i

Pik3ca

i colon tumorer valideret vores GEM modellen som et surrogat for

PIK3CA

vildtype CRC, som vi brugte i vores

in vivo

NVP-BEZ235 behandling undersøgelser. Tilsammen tyder disse resultater på, at NVP-BEZ235 behandling kan have klinisk fordel i 83% af CRC patienter med vildtype

PIK3CA

. For yderligere at vurdere denne funktion, søgte vi at undersøge, om NVP-BEZ235 ville være effektiv i en PERLE model for sporadisk

PIK3CA

vildtype CRC.

Traditionel

in vivo

målvalidering tilgange afhængige xenograft platforme. Desværre er disse modeller er ikke rigtig prædiktive for respons i humane patienter, fordi de stammer fra høj passage tumorcellelinier dyrket

in vitro

. Disse cellelinjer implanteres i ektopiske websteder, der ikke ligner den colon mikromiljø, og derfor undlader at rekapitulere den heterogene karakter af kræft og dens understøttende stroma [65]. Selvom GEM kræftmodeller afhjælpe disse mangler, de fleste GEM modeller anvender kim-line eller ændring af gener er kendt for at være muteret i humant CRC væv over. Desuden er mange CRC GEM modeller hovedsageligt til stede med små intestinale tumorer [66]. For præcist modellere menneskelig sporadisk CRC, har vi for nylig beskrevet en procedure, hvor Adeno-Cre indgives til floxet mus for somatisk inaktivere

Apc

gen i en stokastisk måde og begrænse tumordannelse til den distale colon. Den reproducerbare anatomiske placering af disse tumorer tillader brugen af ​​optiske koloskopi til at undersøge individuelle tumorer i en langsgående måde [11].

For at undersøge effekten af ​​

in vivo

NVP-BEZ235 behandling, vi brugt vores GEM model for sporadisk CRC. I vores undersøgelser, der var stærk korrelation mellem de endelige tumor størrelser vurderet af koloskopi versus obduktion (R

2 = 0,89), hvilket validerer vores koloskopi-baserede tumor dimensionering protokol. I overensstemmelse med vores

in vitro

NVP-BEZ235 behandling af humane CRC cellelinjer, colon tumorer fra GEM-modellen faldt med 43% i størrelse efter

in vivo

behandling med NVP-BEZ235, hvorimod kontroltumorer vokset i størrelse ved 97% (p 0,0001). Lignende resultater er blevet rapporteret med en anden dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer, PKI-587, i en xenograft model af CRC [67].