PLoS ONE: Kvantitativ analyse af Differential Proteome Expression i blærekræft vs. Normal Blære Celler Brug SILAC Method

Abstrakt

Den bedste måde at øge patienternes overlevelse er at identificere patienter, der er tilbøjelige til at udvikle sig til muskel- invasiv eller metastatisk sygdom upfront og behandle dem mere aggressivt. Den menneskelige cellelinier HCV29 (normal blære epitel), KK47 (lav kvalitet nonmuscle invasiv blærekræft, NMIBC), og YTS1 (metastatisk blærecancer) er ofte blevet brugt i studier af molekylære mekanismer og cellesignalering under blærekræft (BC) progression. Men lidt opmærksomhed er blevet betalt, til den globale kvantitativ proteomanalyse af disse tre cellelinjer. Vi mærkede HCV29, KK47, og YTS1 celler ved SILAC fremgangsmåde under anvendelse af tre stabile isotoper af hver af arginin og lysin. Mærkede proteiner blev analyseret ved 2D ultrahøj opløsning væskekromatografi LTQ Orbitrap massespektrometri. Blandt 3721 unikke identificerede og kommenterede proteiner i KK47 og YTS1 celler blev 36 betydeligt opreguleret og 74 var signifikant nedreguleret med 95% sikkerhed. Differentiel ekspression af disse proteiner blev bekræftet ved Western blotting, kvantitativ RT-PCR, og cellefarvning med specifikke antistoffer. Gene ontologi (GO) sigt og pathway-analyse viste, at de differentielt regulerede proteiner var involveret i DNA-replikation og molekylær transport, cellevækst og proliferation, cellulær bevægelse, immuncelle handel, og celledød og overlevelse. Disse proteiner og de avancerede proteomanalyse teknikker beskrevet her, vil være nyttig til yderligere belysning af molekylære mekanismer i BC og andre former for kræft

Henvisning:. Yang G, Xu Z, Lu W, Li X, Sun C, Guo J et al. (2015) Kvantitativ analyse af Differential Proteome Expression i blærekræft vs. Normal Blære Celler Brug SILAC Method. PLoS ONE 10 (7): e0134727. doi: 10,1371 /journal.pone.0134727

Redaktør: Jon M. Jacobs, Pacific Northwest National Laboratory, UNITED STATES

Modtaget: Januar 20, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 31 Juli 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data ligger inden for de sagsakter og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation for Unge Forskere i Kina (nr 81.402.115, 81.201.572), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen, Kina (nr BK20140172) og 111 Projekt Kina (No.111-2-06). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft (BC) er den femte mest almindelige form for kræft hos mennesker. Der var en anslået 74,690 nydiagnosticerede tilfælde og 15,580 dødsfald fra denne sygdom i USA i 2013 [1]. Af de samlede BC patienter, 70% har nonmuscle-invasiv sygdom og ~ 25% til stede i første omgang med muskel invasion. Patienter med muskel-invasiv form, har en 50% risiko for fjernmetastaser og en dårlig prognose [2]. Gentagelse af overfladiske blæretumorer er en væsentlig årsag til den verdensomspændende udbredelse af BC [3]. Størstedelen (90%) af BCs klassificeres histologisk som urothelial karcinomer (UCS), afledt fra blæren urothelium [4]. Blære epitelvæv har en klar hierarkisk organisation, der består af tre morfologisk distinkte celletyper: basal, mellemliggende og paraply celler, svarende til henholdsvis begyndelsen, midten og slutningen af ​​differentiering stater [5]. Malign transformation kan forekomme i hver af disse celletyper, hvilket resulterer i en mangfoldighed af tumor fænotyper [6]. Ifølge den seneste rapport fra American Cancer Society, den relative 5-års overlevelse for BC med tidlig påvisning (fase I, (T1, N0, M0)) er ~ 88% [7]. Derfor identifikation af nye debuterende molekylære markører er ønskeligt for forbedret risiko lagdeling.

Kandidat biomarkører for BC detektering evalueret til dato inkluderer telomerase, blære tumor antigen (BTA), nuklear matrix protein 22 (NMP-22) og fibrin nedbrydningsprodukt (FDP). Pålideligheden af ​​tests baseret på disse biomarkører er dårlig på grund af lav følsomhed og høj falsk-positive rater [8-11]. Proteiner kan potentielt blive identificeret specifikke for aggressive eller ikke-aggressive former for kræft. Proteomanalyse er udfordrende på grund af den begrænsede mængde tilgængelige kliniske prøve [12]. Overvågning af proteom af BC celler kunne give yderligere oplysninger til kliniske diagnostiske formål.

Nylige fremskridt i massespektrometri (MS) til identifikation protein og kvantificering letter grundig analyse af et stort antal proteiner, og har været brugt til undersøgelse af hele proteom i flere systemer. Sådanne fremgangsmåder indbefatter 2D forskel gelelektroforese (2D DIGE), den tilsvarende iTRAQ (isobarisk tag for relativ og absolut kvantificering), isotop-kodede affinitet tagging (ICAT), og stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) [13- 15]. I sammenligning med peptidbaserede absolut kvantificeringsfremgangsmåder, SILAC har fordelene ved at blande prøver ved begyndelsen og reducerede prøve-til-prøve variabilitet. Metabolisk mærkning med stabile isotoper er blevet beskrevet som “gold standard” på protein kvantificering [16]. Arginin (Arg) og lysin (Lys) er de isotopmærkede aminosyrer oftest anvendes i SILAC-baserede undersøgelser, fordi efterfølgende trypsin fordøjelse af isolerede proteiner (som spalter ved basiske rester) til MS-analyse genererer peptider med en enkelt mærket amino syre, forenkle analyse og kvantificering [17]. I den foreliggende undersøgelse, tre stabile isotoper hver af Arg (R0, R6, R10) og Lys (K0, K4, K8) i tre separate kulturer ( “light” (L), “medium” (M), og “tung” (H)) blev anvendt til at analysere proteomanalyse forskelle på forskellige stadier af BC. Karakteristisk L, M, og H former af hvert peptid som detekteret ved MS afspejlede relative mængder af det tilsvarende protein i tre isotopisk kodede BC celle stadier

Tre humane cellelinier blev undersøgt:. Normal blære epitel HCV29, lav kvalitet nonmuscle invasiv blærekræft (NMIBC) KK47, og metastatisk muskel invasiv blærekræft YTS1. Hver af de tre cellelinjer blev dyrket i medier tilsat med tre kombinationer af umærket Lys og Arg ( “lys”), D

4-Lys og

13C

6-Arg ( “medium”), og

13C

6

15N

2-Lys og

13C

6

15N

4-Arg ( “tung”). Proteiner med 98% label inkorporering blev analyseret og kvantificeret ved 2D-HPLC-LTQ Orbitrap MS (figur 1). Differentiel udtryk af de identificerede proteiner, som er formentlig relateret til BC udvikling, blev bekræftet af western blotting, kvantitativ RT-PCR, og cellefarvning med specifikke antistoffer.

Materiale og metoder

Cell kultur

HCV29 blev KK47, og YTS1 celler etableret som tidligere [18-20] beskrevet og venligst doneret af Dr. Sen-itiroh Hakomori (The Biomembrane Institute, Seattle, WA, USA). Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære. For SILAC mærkning blev celler dyrket i SILAC-mærket RPMI 1640 med 10% dialyseret FBS og 1% penicillin /streptomycin indeholdende “light” (K0R0), “medium” (K4R6), eller “tunge” (K8R10) Lys og Arg. At forhindre Arg-til-Pro omdannelsen blev L-Pro (200 mg /l) tilsat til mediet som tidligere [21] beskrevne. Celler blev dyrket i mindst 5 passager for at fjerne ikke-mærket Lys og Arg.

Cellelyse og protein-ekstraktion

Totalproteiner af de tre cellelinjer blev lyseret og ekstraheret under anvendelse af T-PER Reagent (Thermo videnskabelige, San Jose, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler (~ 1 x 10

7) blev løsnet med trypsin, vasket to gange med iskold 1 × PBS (0,01 M phosphatpuffer indeholdende 0,15 M NaCl, pH 7,4) og lyseret med 1 ml T-PER-reagens indeholdende proteaseinhibitorer (1 mM PMSF og 0,1% aprotinin), inkuberet i 30 minutter på is, homogeniseret og centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 min. Supernatanten blev høstet og opbevaret ved -80 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-assay. (Beyotime; Haimen, Kina)

SDS-PAGE og

i-gel

fordøjelse

Proteiner blev adskilt ved 10% SDS-PAGE , visualiseret ved Coomassie-farvning i 2 timer, og affarvet natten over. Udskårne gelskiver blev vasket med 25 mM ammoniumbicarbonat /50% acetonitril (ACN). Tørrede stykker blev inkuberet med 20 pi 10 mM dithiothreitol (DTT) ved 56 ° C i 1 time og derefter med et tilsvarende volumen af ​​20 mM iodacetamid (IAM) ved stuetemperatur i mørke. Gelskiver blev vasket og trypsinbehandlet med 20 pi (10 ng /pl) trypsin (Promega, Madison, WI, USA) i 30 minutter ved 4 ° C. Overskydende trypsin blev fjernet, 20 pi 25 mM NH

4HCO blev tilsat

3, og blandingen blev inkuberet natten over ved 37 ° C. Ekstraherede produkter blev tørret med en SpeedVac koncentrator (CentriVap Cold Trap, Labconco, Kansas, MO, USA). [22]

MALDI-TOF /TOF-MS

Tørrede prøver blev opløst med 0,1 % trifluoreddikesyre (TFA), spottet på en MTP AnchorChip prøve target, og lufttørret. Peptider blev omkrystalliseret med matrix α-cyanohydroxycinnamic acid (CHCA; 1 pi 10 mg /ml) og karakteriseret ved MALDI-TOF /TOF-MS (UltrafleXtreme, Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland). Ionisering blev opnået ved bestråling med en nitrogen laser (λ = 337 nm), der opererer ved 20 Hz. Massespektre blev erhvervet ved hjælp af FlexControl og FlexAnalysis softwareprogrammer

In-løsning fordøjelse

Proteiner fra tre typer af isotopmærkede celler blev blandet på 1:. 1: 1, reduceret, og alkyleres ved inkubering med lige store mængder af 10 mM DTT og 20 mM IAM. Alkylerede proteiner blev spaltet med trypsin tilsat i et forhold på 1:50 (vægt /vægt) og inkuberes natten over ved 37 ° C [23]. Total peptider blev opkoncentreret og afsaltet ved anvendelse af en 10 kD størrelse-eksklusion spin-ultrafiltreringsenhed og tørret under anvendelse af en SpeedVac koncentrator.

LC-MS /MS-analyse

2D-LC-MS blev udført under anvendelse LTQ Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) som tidligere beskrevet [24]. Fordøjede peptider (100 ug) blev injiceret i en bifasisk kapillarsøjle (id 200 um) pakket med C

18 harpiks (Reprosil-Pur, 5 um, Dr. Maisch GmbH) og stærk kationbytterharpiks (Luna 5 um SCX 100A, Phenomenex). Peptid udløb fra den tofasede søjle ved hvert trin var rettet i en 15-cm C

18 analytisk søjle (i.d. 75 um, Reprosil-Pur, 3 um) ved strømningshastighed 500 nl /min. Nano-ESI blev udført med spray spænding 2,0 kV og opvarmet kapillær temperatur 200 ° C. En fuld MS-scanning (300-1800) i Orbitrap blev efterfulgt af fem MS /MS scanninger af de fem mest intense ioner valgt fra MS-spektret i LTQ. Opladningstilstand screening blev aktiveret for 2, 3, 4, og over [25].

Dataanalyse

Rå MS-data blev analyseret ved hjælp af MaxQuant software program (V. 1.2. 2.5) [26,27]. En falsk opdagelse sats (FDR) på 0,01 for proteiner og peptider og en minimal peptid længde på 6 aminosyrer var påkrævet. MS /MS-spektre blev ransaget af Andromeda [28] mod IPI menneskelige database (V. 3.85). Den MaxQuant program bestemmes SILAC tilstand peptider fra masse forskelle mellem SILAC peptid par, og disse oplysninger blev brugt til at foretage søgninger med fast Arg6 og Lys4 eller Arg10 og Lys8 ændringer, som er relevant. Kvantificering i MaxQuant blev udført som beskrevet tidligere [26].

Differential regulering inden for hver eksperimentelle M /L ( “medium /lys”) forholdet og H /L ( “tung /let”) forholdet mellem de identificerede proteiner blev normaliseret ved hjælp z-score-analyse, som tidligere [29,30] beskrevet. Kort fortalt, blev M /L og H /L-forhold omdannet til log2 plads, og gennemsnitlige nøgletal og SD (standardafvigelse) blev beregnet for hvert datasæt. Den log2 M /L og H /L-forhold på hvert protein blev omdannet til en z-score ved anvendelse af følgende formel: hvor b blev anset som et enkelt protein i et datasæt population (a … .N). Den z-score var et mål for, hvor mange SD enheder (o) af log2 M /L eller H /L-forholdet af proteinet var væk fra befolkningen mener. En z-score ≥1.960σ repræsenterede den differentielle ekspression af proteinet løjet uden for 95% konfidensintervallet, en score ≥2.576σ repræsenterede udtryk uden for konfidensintervallet 99%, og en score ≥3.291σ repræsenterede 99,9% sikkerhed. Z-scores ≥1.960σ blev anset for at være væsentlige [29].

Funktionel annotation og Opfindsomhed Pathways Analyse

Identificerede proteiner blev yderligere analyseret ved hjælp af SWISS-PROT-database til at klassificere deres biologiske proces, cellulær komponent, og molekylær funktion [31]. Væsentlige overrepræsenteret gen ontologi (GO) vilkår blev identificeret ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) gen bioinformatiske ressourcer [32, 33]. Proteiner bestemt til at blive differentieret reguleret som beskrevet i det foregående afsnit blev tabuleret i Excel og deres internationale Protein Index (IPI) numre blev uploadet i DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) til funktionel annotation analyse . Datasæt indeholdende gen id’er og tilsvarende udtryk værdier blev derefter uploades til Ingenuity Systems program. Hver IPI nummer blev kortlagt til dens tilsvarende gen objekt i opfindsomhed Pathways Knowledge Base. Netværk af de proteiner blev genereret algoritmisk baseret på deres konnektivitet. Fishers eksakte test blev anvendt til at beregne en p-værdi, som indikerer sandsynligheden for, at en bestemt biologisk funktion og /eller sygdom tildelt dette net skyldtes chance alene.

Western blotting

Western blotting var udført som tidligere beskrevet [34]. Kort fortalt blev proteiner separeret på 10% SDS-PAGE-gel, overført til en PVDF-membran, og membranen blev blokeret ved anvendelse af 5% fedtfri mælk i TBST og probet under anvendelse af specifikke antistoffer. De primære antistoffer var kanin-anti-insulin-lignende vækstfaktor 2-mRNA-bindende protein 1 (IGF2BP1) (# AP10466b, Abgent, San Diego, CA, USA), kanin-anti-melanom-associeret antigen 4 (MAGEA4) (# AP6166a, Abgent), kanin-anti-Thy-1-membran glycoprotein (Thy1) (# AP2050a, Abgent), 14-3-3 protein sigma (SFN) (# sc-365.539, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), kanin-anti -fibronectin (FN1) (# F3648, Sigma-Aldrich), muse-anti-vimentin (VIM) (# V5255, Sigma-Aldrich), CD70 antigen (CD70) (# sc-7681, Santa Cruz Biotechnology), og mus anti- p-catenin (CTNNB1) (# 610.153, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). De sekundære antistoffer var passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret kanin-anti-muse eller gede anti-kanin (# A0216 og # A0208, Beyotime). Bånd blev visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens detektion kit (Westar Nova, Cyanagen, Bologna, Italien).

Kvantitativ realtids-PCR Salg

Celler (1 x 10

5 per brønd i en 6-brønds plade) blev dyrket og behandlet som beskrevet ovenfor. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af en RNApure Tissue Kit (CWBiotech, Beijing, Kina) ifølge producentens instruktioner. Primere blev konstrueret under anvendelse af DNAMAN programmet (V. 6.0.3; Lynnon Biosoft, Canada). Første-streng cDNA blev syntetiseret fra total RNA ved anvendelse ReverTra Ace-α (Toyobo, Osaka, Japan). Kvantitativ realtids-PCR blev udført ved LightCycler-baserede SYBR Green I dye påvisning med UltraSYBR Blanding (CWBiotech). Genekspression blev kvantificeret ved den 2

-ΔΔCT metode [35].

Cellefarvning

Celler blev dyrket på steriliserede dækglas i 24-brønds plader indtil 70-80% sammenløb, vasket immobiliseret, permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur, og blokeret med 5% fedtfri mælk natten over ved 4 ° C. Fikserede celler blev inkuberet med fortyndet primære antistoffer i 12 timer, inkuberet med FITC-mærkede sekundære antistoffer ved 4 ° C i 6 timer i mørke, vasket, farvet med 4 ug /ml DAPI ved stuetemperatur i 10 minutter, vasket med 1 × PBS, og fotograferet med en fluorescens mikroskop (Eclipse E600, Nikon, Tokyo, Japan).

Resultater

Bestemmelse af isotop inkorporering effektivitet

at analysere dynamiske ændringer i BC onkogenese på proteomet plan blev SILAC anvendte metode til tre blære cellelinjer at opnå mærkede cellepopulationer. Tilstrækkelig mærkning er en forudsætning for pålidelig kvantificering ved hjælp af denne metode. I tilfælde af ufuldstændig mærkning af proteiner, især til mærkningseffekt 95%, kvantificering af lav tæthed proteiner ville være maskeret af forurenede “lette” peptider. For at bestemme inkorporering effektivitet mærket Lys og Arg, “let” (HCV29), “medium” (KK47), og “tunge” (YTS1) proteiner blev separeret, og den høje forekomst protein var

i-gel

fordøjet. MALDI-TOF /TOF-MS-resultater for peptid GVVDSEDLPLNISR i varmechokprotein 90 (P08238) indikerede, at fuldstændig inkorporering af isotopmærket Arg og Lys blev opnået i KK47 og YTS1, og ingen Arg-til-Pro omdannelse indtraf (Fig 2A). LC-ESI-MS /MS-analyse af den dobbelt ladede peptid VNQIGSVTESLQACK af alfa-enolase (P06733) og GGPEVQQVPAGER af fedtsyresyntase (P49327) viste, at disse dubletter af faktiske peak klynger var fra HCV29, KK47, og YTS1 celler henholdsvis ( fig 2B).

(A) Bestemmelse af inkorporering effektivitet ved MALDI-TOF /TOF-MS. Peaks kommenteret som R0 (venstre), R6 (i midten), og R10 (højre) er peptid GVVDSEDLPLNISR af varmechokprotein 90 fra HCV29, KK47, og YTS1 celler. (B) Identifikation og kvantificering af proteom i BC celler ved 2D-HPLC LTQ Orbitrap MS. Peaks kommenterede som K0, K4, og K8 (til venstre) og R0, R6, og R10 (til højre) er dobbelt ladede peptid VNQIGSVTESLQACK af alfa enolase og GGPEVQQVPAGER fedtsyre syntase.

SILAC celle model for kvantificering af proteom i BC progression Salg

proteiner isoleret fra de tre cellelinier blev blandet (1: 1: 1) og fordøjet anvendelse af en 10 KD-filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Peptider blev analyseret ved ultrahøj opløsning væskekromatografi-tandem MS (nLC-ESI-MS /MS) på en hybrid lineær ion trap LTQ Orbitrap instrument. I alt 3721 unikke proteiner blev identificeret i to uafhængige gentagne eksperimenter (fig 3A og S1 Table). Af disse blev 1766 proteiner (47.5% af det samlede beløb), der blev identificeret i begge forsøg og opfyldte kriterierne for protein kvantificering underkastes yderligere bioinformatiske analyse. Distributionsselskaberne histogrammer for log nøgletal for både M /L og H /L passer til en gaussisk fordeling. De fleste af de identificerede proteiner var indenfor ± 1 vifte af log-forhold (Fig 3C og 3D). Brug en som tærskel log ratio, ekspressionen af ​​255 proteiner var højere i både KK47 og HCV29, og ekspressionen af ​​434 proteiner var lavere i både KK47 og HCV29 (Fig 3B). Befolkning fordeling-baserede z-scores tilladt direkte sammenligning af proteiner fra forskellige eksperimenter. Forskellige Konfidensniveau cutoffs blev anvendt til de data, som z-score analyse for at afgøre, hvilke proteiner markant forskelligt blev reguleret. De cutoffs anvendte var 95%, 99% og 99,9%, svarende til z-score på ± 1,960, ± 2,576, og ± 3,291 hhv. Ved hjælp af en 95% cutoff, blev signifikant forskellen regulering observeret for 110 proteiner i KK47 vs. HCV29 (36 opreguleres, 74 nedreguleret), og for 87 proteiner i YTS1 vs. HCV29 (17 op, 70 ned). Differential regulering blev observeret i 35-proteiner i de to BC linjer vs. HCV29 bruger 99% cutoff (2 op, 33 ned), men kun fem af disse proteiner under anvendelse af en 99,9% cutoff (2 op, 3 ned) (tabel 1 ). Tabel 2 og 3 liste de opreguleres og nedreguleres proteiner bestemt i de to eksperimenter, med deres gennemsnitlige SILAC nøgletal og z-scores. Alle proteiner forskelligt reguleret med 95% sikkerhed havde en 5-fold ændring af SILAC nøgletal, og de fleste proteiner forskelligt reguleret med 99% sikkerhed havde en . 10-fold ændring af SILAC nøgletal

(A) Venn diagrammer af antal identificerede proteiner fra individuelle eksperimenter. (B) Nøgletal i KK47 /HCV29 (M /L) og YTS1 /HCV29 (H /L) for sættet af 1766 proteiner. log2 af SILAC ratio for hvert protein (n = 2) afspejler forskelle i relative ekspression blandt KK47, YTS1 og HCV29 celler. (C) Fordeling af SILAC M /L-forhold. (D) Fordeling af SILAC H /L-forhold. (E) Cluster graf ( “heat map”), der genereres af hierarkisk gruppering af betydelige regulerede proteiner efter gennemsnit z-scores ved hjælp af en 95% cutoff. Vejviser

Hierarkisk klyngedannelse analyse af prøver blev udført for at undersøge korrelationer af proteommønstrene blandt de tre cellelinjer. Den Cluster grafen ( “heat map”) viser, at prøver af samme cellelinje klynge sammen (fig 3E). Nogle proteomer var karakteristisk blandt de tre cellelinjer baseret på væsentlige ændringer i metastatisk vs. lav kvalitet nonmuscle invasiv, mens andre proteomer var moderat og konsekvent. Proteiner i førstnævnte gruppe kan være involveret i BC udvikling.

Funktionel klassifikation og sti analyse af identificerede proteiner

Funktionel fortolkning er et afgørende skridt i dataanalyse, når omfattende funktionel annotation af datasættene er ikke tilgængelig. Under hensyntagen til deres eksklusiv lokalisering i GO blev de identificerede proteiner forbundet med mindst én annotation sigt hver inden for den molekylære funktion GO, biologisk proces, og molekylære kategorier komponent. De mest almindelige molekylære funktioner blev binding (47,2%), og katalytisk aktivitet (30,9%) (Fig 4A). De store biologiske proceskategorier var cellulære (16,3%), enkelt-organisme (14,2%), og metabolisk (13,8%) (fig 4B). De store cellulære komponenter kategorier blev celle (17,6%), celle del (17,6%), og organel (15,8%) (Fig 4C).

Proteiner viste produkter er blevet bundet til mindst én annotation sigt inden GO molekylære funktion (A), biologisk proces (B), og cellulære komponent (c) kategorier.

for at identificere berigelse vilkår forbundet med de opreguleres og nedreguleres grupper af proteiner efter gennemsnit af z-scores ved hjælp af 95 % cutoff, lister over proteiner blev overført til DAVID websted ved hjælp af komplette menneskelige proteom som baggrund. At bidrage til at afklare hvilke molekylære funktioner og biologiske processer blev hårdest ramt under BC modning blev overrepræsenterede GO vilkår identificeret baseret på tærsklen tæller ≥ 2 og Expression Analysis Systematisk Explorer (EASE) 0.1. De overrepræsenterede molekylære funktioner, biologiske processer og cellulære komponenter i de betydelige berigede GO form af opreguleret proteiner blev analyseret. Den mest højt rangeret molekylære funktion var neutral aminosyre transmembrane transporter aktivitet (2 proteiner). De højest sorteret biologiske processer var cellulær aminosyrederivat metaboliske proces (4-proteiner), ribonukleoproteinkompleks biogenese (4-proteiner), reaktion på ekstracellulær stimulus (4-proteiner) og nitrogen Forbindelse biosyntetiske proces (4-proteiner). De mest klassificeret cellulære komponenter var intracellulær ikke-membran-afgrænset organel (14 proteiner) og ikke-membran-afgrænset organel (14 proteiner).

Dernæst overrepræsenteret molekylære funktioner, biologiske processer og cellulære komponenter i de betydelige berigede GO form af nedreguleret proteiner blev analyseret. De mest klassificeret molekylære funktioner var calcium-ion binding (16 proteiner), strukturel molekyle aktivitet (11 proteiner), og identisk proteinbinding (10 proteiner). De højest sorteret biologiske processer var celleadhæsion (14 proteiner), biologisk adhæsion (14 proteiner), respons på sårdannelse (13-proteiner), og immunrespons (13 proteiner). De højest sorteret cellekomponenter var plasmamembranen (40 proteiner), plasmamembran del (30-proteiner), og ikke-membran-afgrænset organel (24 proteiner) (S2 tabel).

Proteiner blev yderligere analyseret, og metaboliske og kanoniske veje og forbindende proteiner blev genereret ved hjælp Opfindsomhed Pathways Analysis (IngenuityH Systems, www.ingenuity.com). De øverste netfunktioner identificeret som opreguleres proteiner i BC-celler var involveret i DNA-replikation, aminosyremetabolismen, molekylær transport (52 proteiner; Fig 5A), genekspression og arvelige sygdomme (33 proteiner), cellevækst og proliferation (20-proteiner, fig 5B), og post-translationel modifikation og cancer (4-proteiner). De øverste netfunktioner identificeret som nedreguleret proteiner i BC-celler blev cellulær bevægelse og immuncelle handel (97-proteiner, Fig 5C), lipidmetabolisme (31-proteiner, Fig 5D), cellulære udvikling, vækst og proliferation, og celledød og overlevelse (6 proteiner). Disse resultater viser, at BC celle proteomer kontinuerligt var skiftende afhængigt af den fase af celle metastaser.

(A og B) Top netværksfunktioner af DNA-replikation, molekylær transport, cellevækst og celledeling for opreguleres proteiner. (C og D) Øverste netværksfunktioner af cellulær bevægelse, immuncelle handel, og lipidmetabolismen. Solid linjer: direkte kendte interaktioner. Stiplede linjer: mistanke om eller indirekte interaktioner. Hvid: proteiner vides at være i netværket, men ikke identificeret i vores undersøgelse

Bekræftelse af MS resultater ved Western blotting

Variationer af den differentierede proteiner beskrevet ovenfor, blev bekræftet ved Western blotting. . Thy1, MAGEA4, IGF2BP1 og SFN blev påvist på højere niveauer i BC KK47 og YTS1 celler end i normale blære epitel HCV29 celler, mens VIM, CTNNB1, FN1 og CD70 blev påvist på lavere niveauer i KK47 og YTS1 end i HCV29 (Fig 6B og 6C). Generelt de vestlige blotting resultaterne var i overensstemmelse med de variable fra MS-analyse (figur 6A, S1 Bord og S1 Fig)

(A) SILAC L:. M: H gennemsnitlige nøgletal for seks udvalgte proteiner. (B) Western blotting-analyse af udvalgte proteiner. Proteiner blev overført til en PVDF-membran, probet med deres primære antistoffer, og inkuberet med HRP-konjugeret kanin-anti-mus eller ged anti-kanin sekundære antistoffer. (C) Densitometrisk kvantificering af protein niveauer. Proteinet blev normaliseret ved tublin, og derefter sammenlignet med HCV29, som vilkårligt blev sat til 1,0. (D) Genekspression for proteinerne blev analyseret ved QRT-PCR. Relativ ekspression i sammenligning med kontrolprøver blev analyseret af 2

-ΔΔCt fremgangsmåde og repræsenteret Log

2. Ekspression af gener over Log

2 (2) eller under Log

2 (1/2) var signifikant opreguleret eller nedreguleret, henholdsvis.

Bekræftelse af SILAC resultater ved QRT-PCR

ekspressionen af ​​seks responderende gener på det transskriptionelle niveau blev vurderet ved QRT-PCR. I BC KK47 og YTS1 celler, udtryk for

MAGEA4

,

Thy1

, og

IGF2BP1

blev væsentligt forøget, mens den for

VIM

,

CTNNB1

, og

FN1

blev stærkt reduceret (figur 6D). Disse resultater er i overensstemmelse med SILAC resultater.

Bekræftelse af SILAC og vestlige blotting resultater ved cellefarvning med antistoffer

Antistoffer genkender MAGEA4, Thy1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, og fn1 proteiner, hvis ekspression afveg betydeligt i BC celler vs. HCV29 celler, blev anvendt til at bekræfte resultaterne af tidligere analyser og vurdere protein distributioner. Fluorescens signalintensiteter i de to BC cellelinjer var signifikant højere for MAGEA4, Thy1, og IGF2BP1 og betydeligt lavere for VIM, CTNNB1, og FN1 efter aftale med SILAC, western blotting, og RT-PCR-resultater. Præferentiel lokalisering blev observeret for MAGEA4 i det centrale cytoplasma (herunder mitokondrier og centrosom) og den nukleare region, for Thy1 og VIM i cytoplasmatiske membran og cytoplasma, for IGF2BP1 på det nukleare område og cytoplasma og for CTNNB1 og FN1 i cytoplasmatiske membran (fig 7 )

HCV29, KK47, og YTS1 celler dyrket og farvet med seks antistoffer rettet til identificerede proteiner (MAGEA4, Thy1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, FN1) mærket med Cy3 som beskrevet i M . M. Billeder vises af flettefelter billeder af Cy3-konjugerede antistoffer og DAPI farvning af cellekerner (objektivforstørrelse 60 ×). Scale barer: 70 um

Diskussion

urothelial karcinom i blæren er unik blandt epitel karcinomer i sine divergerende veje for tumorigenese.. På tidspunktet for diagnosen til overgangsstøtte celle BC, ~ 80% af patienterne er i lav kvalitet (grad 1-2) non-muscle invasive (CTA eller CT1) fase. Hos patienter med lav kvalitet Ta sygdom, den 15-årige progressionsfri overlevelse er 95% uden kræft dødelighed [36]. Derfor er der behov biomarkører til at forudsige risiko for fase progression fra ikke-invasiv for invasiv eller ikke-metastatiske til metastatisk og forudsigelse reagere på systemiske terapier. Den menneskelige cellelinier HCV29 (normal blære epitel), KK47 (lav kvalitet nonmuscle invasiv blærekræft), og YTS1 (metastatisk blærecancer) er ofte blevet brugt i studier af molekylære mekanismer og cellesignalering under udviklingen af ​​blærekræft til muskel eller metastatisk stater [37]. Men lidt opmærksomhed er blevet betalt til global kvantitativ proteomanalyse af disse tre cellelinjer,.

Kvantitativ analyse af proteiner på forskellige stadier af BC progression er en udfordrende, men vigtig opgave for forståelsen af ​​sygdomsmekanismer. SILAC, en differential isotop mærkning strategi, der involverer metabolisk mærkning af proteiner

in vivo

, har været almindeligt anvendt i cellebiologi og studier af modelorganismer såsom gær, bakterier, nematoder, planter, og mus [38, 39 ]. I SILAC, er naturlige “light” isotoper af carbon, nitrogen og hydrogen i aminosyrer tilsættes under proteintranslation substitueret med “tunge” isotoper, såsom

13C,

15N, og

2H. Ingen undersøgelse til dato har kvantificeret forskelle i protein overflod på forskellige stadier af BC. Tidligere undersøgelser har fokuseret på komparative protein niveauer i BC patienter vs. kontrolpersoner, men ikke på ændringer af protein niveauer under BC progression [8,9].

Identifikation og karakterisering af protein niveauer på forskellige trin af differentiering er væsentlig for vores forståelse af normalt væv udvikling og malign transformation. I den foreliggende undersøgelse, vi anvendte SILAC metode til analyse af HCV29, KK47, og YTS1. Denne strategi gav oplysninger protein for alle tre cellelinjer i løbet af en MS eksperiment. Efter normalisering af z-score metode blev differentieret regulering observeret for 110 proteiner i KK47 vs. HCV29 og 87 proteiner i YTS1 vs. HCV29. Disse differentielt regulerede proteiner, som kan spille vigtige roller i BC udvikling, indbefatter SFN (14-3-3-protein sigma), SELENBP1 (selen-bindende protein 1), COL6A3 (collagen α3 (VI) kæde), og CD70.