PLoS ONE: MicroRNA-34a medierer Autokrin signalering PAR2-Aktivering proteinase og dens rolle i Colon Cancer Cell Proliferation

Abstrakt

Tumoren mikromiljø er fyldt med proteinaser. Som en sensor af proteinaser, proteinase aktiveret receptor 2 (PAR

2) spiller kritiske roller i tumorigenese. Vi viste, at PAR

2 og dens aktivering proteinase blev co-udtrykt i forskellige tyktarmskræft cellelinjer, herunder HT29. Inaktivere proteinase eller knockdown af PAR

2 betydeligt ikke kun reduceret celleproliferation in vitro, men også hæmmet tumorgenicitet af HT29 in vivo. Desuden aktivering af PAR

2 fremmet DNA-syntese og opreguleret Cyclin D1-aktivitet på både transkriptions- og post-transkriptionelle niveau. Yderligere undersøgelser viste, at miRNA-34a medieret PAR

2-induceret Cyclin D1 opregulering. Hæmning af miR-34a delvist afskaffet undertrykkelse af cyclin D1 induceret af PAR

2-mangel. Desuden viste vi, at TGF-β bidrog til reguleringen af ​​miR-34a af PAR

2. Endelig blev i kolorektale karcinom prøver, opregulering af PAR

2 og nedregulering af miR-34a signifikant korreleret med kvalitet og lymphomatic metastaser. Vores resultater giver det første bevis på, at miRNA medierer autokrin proteinase signalering medieret cancercelleproliferation

Henvisning:. Ma Y, Bao-Han W, Lv X, Su Y, Zhao X, Yin Y, et al. (2013) MicroRNA-34a medierer Autokrin signalering af PAR

2-Aktivering proteinase og dens rolle i Colon Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 8 (8): e72383. doi: 10,1371 /journal.pone.0072383

Redaktør: Jun Sun, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: April 3, 2013; Accepteret: 9 juli 2013; Udgivet: 26 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra 973 National Key Fundamental Research Program Kina (https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx) (2012CB967003) og National Nature Science Foundation of China (http: //www.nsfc .gov.cn /Portal0 /default152.htm) (81.172.034, 91.129.717 og 81.201.966). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med færdiggørelsen af ​​humane genom projekt, i alt 553 gener er kommenteret at koder proteinase [1]. Identifikation af proteinase aktiverede receptorer (Pars) afslører en central rolle for proteinaser, ikke blot som protein-nedbrydende enzymer, men også som potentielle receptoraktivatorer der overfører ekstracellulære stimuli i intracellulære signalsystemer begivenheder. PAR’er er syv transmembran-spændende domæner G-protein-koblede receptorer (GPCR’er), der fungerer som mål for visse serinproteinaser, såsom thrombin og trypsin. Proteolytisk spaltning af deres ekstracellulære aminoterminal skaber nye aminoterminale ende, der fungerer som en tøjret ligand og aktiverer receptoren. Den unikke aktivering mekanisme PAR’er giver en ny mekanisme, hvormed mikromiljø påvirker celle adfærd. Til dato er der blevet identificeret fire PAR familiemedlemmer, PAR

1 til PAR

4, som alle deler ligheder i deres struktur og aktivering mekanisme [2]. PAR

2 er det eneste medlem i familien, som ikke kan aktiveres af thrombin. Undersøgelserne i knockout-mus viste, at PAR

2 Afspiller mere vigtige roller i tumordannelse i forhold til andre PAR’er [3].

PAR

2 udtrykkes bredt i kroppen og spiller kritiske roller i forskellige typer af human cancer, herunder colon og lungecancer [4], [5]. PAR

2 fremmer tumor progression gennem en række mekanismer, såsom celleproliferation, invasion og metastase. Det blev vist, at PAR

2 stimuleret celleproliferation i forskellige cancerceller og opstået som en potent mitogen faktor i forskellige cancere [6] – [10]. Yderligere undersøgelser viste, at transaktivering af EGFR [7], aktivering af MAPK [9] og integrin α

5β

1-afhængig adhæsion til fibronectin [10] at mediere PAR

2-stimuleret celleproliferation. Men de molekylære mekanismer, som PAR

2 regulerer cellecyklus er stadig uklar.

Som en vigtig del af den mikromiljø, proteinaser fremmer tumorcelleproliferation og føre til ukontrolleret cellevækst. Nogle af proteinaser er i stand til at fungere som endogene aktivatorer af PAR

2 in vivo. Foruden trypsin, kan urokinase-plasminogenaktivator (uPA) /plasmin, FXa, FVIIa, væv faktorer, matriptase og kallikreiner (KLKs) alle aktivere PAR

2 [11]. Ekstra-pancreas ekspression af trypsin er vist i gastriske og colon cancere [12], [13]. Tvungen ekspression af trypsinogen dramatisk øger tumorigeniciteten af ​​gastriske cancerceller i nøgne mus [13]. Direkte beviser for, at trypsin handler på PAR

2 er en meget potent vækstfaktor for humane colon cancerceller [9].

I betragtning af allestedsnærværelse PAR

2, og produktionen af ​​proteinaser af tumorer eksistensen af ​​en autokrin løkke er ikke uventet, især i kolorektale karcinomer. Unormal ekspression af PAR

2 blev fundet i GI-kanalen kræft og cancercellelinier [14] – [16]. Ekspression af matriptase og trypsin blev påvist i DLD-1 [17] og HT29 colon cancercellelinier [18]. Senest blev KLK14 fundet at blive udtrykt og være i stand til at aktivere PAR

2 i colon cancerceller [19]. Det forventes, at den autokrine interaktion af serinproteinaser og PAR

2 deltager i cancercelle prolifererer i tyktarmen.

I den foreliggende undersøgelse viser vi, at den autokrine virkning af trypsin og KLK14 fremmes coloncancercelle spredning gennem aktivering af PAR

2. Forstyrrelse af den autokrine løkke ved knockdown af PAR

2 reduceret kræft cellevækst både in vitro og in vivo. Desuden viste vi for første gang, at miR-34a, som er rettet mod cyclin D1, var afgørende for PAR

2-induceret celleproliferation.

Metoder og Materialer

Cell Kultur og Cell linjer

den humane colon epithelial cellelinie HT-29, Caco-2, HCT-116, RKO og human lunge-adenocarcinom A549-cellelinje blev opnået fra ATCC (Manassas, VA, USA). Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium /F12 (Hyclone) suppleret med 10% FBS (Gibco).

Stabile transfektant cellelinier med PAR

2 Knockdown

shRNA vektor pRFP- C-RS indeholder fire forskellige PAR

2 specifikke forstyrrende sekvenser og forvrænget sekvens blev købt fra OriGene Technologies. HT29-celler blev transficeret med en af ​​shRNAs og selekteret med puromycin (1 ug /ml). Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) og Western blot blev udført for at kontrollere ekspressionen af ​​PAR

2.

Kemikalier og reagenser

Inhibitorerne for trypsin (katalog nr. T6522 og T9128), og actinomycin D blev købt fra Sigma-Aldrich. (. Cat No. 04 693 159 001) proteinase inhibitor cocktail og TGF-β blev indkøbt fra Roche og R Cell Signaling Technology), PAR

2 (N-19, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) eller β-catenin (Cell Signaling Technology), efterfulgt af inkubation med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer (Cell Signaling Technology) ved 1:10,000 fortynding i 1 time. Signalet blev visualiseret med ECL (Millipore).

RNA Isolation, RT og PCR

Total RNA, isoleret fra A549 celler, HT29-celler eller patientprøver ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen), var behandlet med DNase i og revers transkriberet under anvendelse af en transskription kit (Invitrogen) for at få den samlede cDNA som skabeloner til mRNA opsporing eller transskriberede med TaKaRa ™ microRNA transskription kit til at få cDNA som skabeloner til microRNA detektion. Salg

Alle primerne anvendes til kvantitativ PCR blev købt fra GeneCopoeia (Fulen Gen Co. Ltd., Guangzhou, Kina). Kvantitativ realtids-PCR blev normaliseret til GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase) eller U6 udtryk for mRNA og miRNA henholdsvis

Primere for regelmæssig PCR trypsinogen, KLK14 og PAR

2 var som følger:. Trysinogen sense, 5′-TACCTTTGTTGCAGCTGCTG-3 ‘, og anti-sense, 5′-CACCACCCACTGTTCGCTG-3′; KLK14 forstand, 5′-CACTGCGGCCGCCCGATC; og anti-sense, 5’-GGCAGGGCGCAGCGCTCC-3 ‘; PAR

2 sense, 5′-TGAAGATTGCCTATCACATAC-3 ‘og anti-sense, 5’TGCATTATTTTCTGATTAAGAGCC-3’. Actin blev anvendt som en intern kontrol.

Luciferase Reporter Assay

Forbigående transfektion blev udført med en E2F-drevet luciferase som reporter for transkriptionel aktivitet. Transfektionen agent lipofectamin 2000 (Invitrogen) blev inkuberet med DNA i serumfrit medium i 30 minutter før tilsætning til cellerne. Cellerne blev inkuberet med det transfektion kompleks i 2 timer. Cellelysater for luciferaseaktivitet blev opsamlet 24 timer efter transfektion, og celler blev behandlet med PAR

2-AP i 3 timer før høst. De luciferaseassays blev udført med en Dual-Luciferase assay kit (Promega) og data blev normaliseret til pTK-RL.

tumorigenese i nøgne mus

For in vivo studier, 10

6 celler blev injiceret i nøgne mus subkutant og tumorvækst blev fulgt i 3 uger. Alle dyr pleje var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Tumor størrelse (

V

) blev beregnet to gange om ugen fra den anden uge, ved hjælp af formlen,

V

(mm

3) = 0,52 × (bredde)

2 × (længde).

Statistical Analysis

data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Sammenligning af 2 grupper blev foretaget ved hjælp af ANOVA med enten en post hoc Tukey test eller en post hoc Dunnett test. Sammenligning af 2 grupper blev foretaget under anvendelse af Students t-test for uparrede data. En tilhørende værdi på

s.

0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Knockdown af PAR

2 Blokeret Cell Proliferation i HT29 Celler

I denne undersøgelse testede vi PAR

2 mRNA-niveauer i forskellige coloncancerceller herunder HT29, HCT116, Caco-2 og RKO-celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter [18], alle de testede celler viste positivt udtryk for PAR

2 (figur 1A). Ekspressionen af ​​endogene PAR

2-aktiverende proteinaser trypsinogen og KLK14 blev også undersøgt ved RT-PCR. KLK14 mRNA var til stede i alle humane coloncancer-celler analyseret, mens trypsinogen ekspression kun blev observeret i Caco-2 og HT29-cellelinjer (figur 1A). Siden HT29-celler til stede høj ekspression af både trypsinogen og KLK14, valgte vi dette coloncarcinom-cellelinie til yderligere undersøgelse.

A. mRNA ekspressionen af ​​PAR

2, trypsinogen blev KLK14 målt med almindelig PCR i tyktarmskræft cellelinjer. B. coloncancer-celler blev forbehandlet med inhibitorer af trypsin (T9128 og T6522) eller serinproteinaser (proteinaseinhibitor cocktail, PIC) og celleproliferation blev målt ved MTT-assayet. C. mRNA ekspressionen af ​​PAR

2 i stabile transfektantcellerne (PAR

2-1 og PAR

2-2) blev målt ved real time PCR. HT29 RS repræsenterer kontrolcellerne stabilt transficeret med scrambled kontrol-RNA. Proteinniveau af PAR

2 blev målt ved Western Blot og vist som insert. Virkningen af ​​PAR

2 knockdown på celleproliferation blev målt ved (D) MTT assay og (E) kolonidannelse i HT29-celler. F. Celler (10

6) injiceret subkutant i nøgne mus, blev tumorvolumener målt som angivet og tumorvægte blev bestemt ved aflivning. *

s

0,05, **

s

0,01 Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. N = 3-6. Alle forsøg er blevet gentaget mindst 3 gange uafhængigt af hinanden.

For at afgøre, om PAR

2-proteinase autokrine løkke er afgørende for celleproliferation, vi brugte to metoder til at nedbryde den autokrine sløjfe. Først blev forskellige inhibitorer anvendes til at blokere aktiviteten af ​​proteinase. To trypsininhibitorer (T6522 og T9128) og en proteinaseinhibitor cocktail (PIC) blev anvendt til at blokere kendte og ukendte serinproteinase, der kan aktivere PAR

2, og alle af dem signifikant blokeret HT29 celleproliferation som målt ved MTT-assayet ( Figur 1B). For det andet blev PAR

2 udtryk stabilt slået ned i HT29-celler (Figur 1C). MTT og kolonidannelse analyse viste henholdsvis at knockdown af PAR

2 blokeret celleproliferation (figur 1 D) og koloni-dannende evne (figur 1E) in vitro. Vigtigst knockdown af PAR

2 i HT29-celler reducerede signifikant tumorvækst i nøgne mus (fig 1F). Disse data viste, at autokrin aktivering af PAR

2 ved dens aktiverende proteinase fremmer coloncancer celleproliferation både in vitro og in vivo.

cyclin D1-E2F Pathway medieret PAR

2-medieret celleproliferation

for at bestemme de molekylære mekanismer bag effekten af ​​PAR

2-aktivering på spredning, brugte vi den menneskelige lunge karcinom-afledt A549 epitelial cellelinje, som udtrykker PAR

2, men ikke de aktiverende proteinase. BrdU mærkning assay viste, at den selektive PAR

2-aktiverende peptid (PAR

2-AP), men ikke omvendt-sekvensen peptid (RP), inducerede en signifikant stigning i DNA-syntese (Figur 2A). Endvidere PAR

2 aktivering signifikant forøget cyclin D1 på både mRNA og protein niveauer (figur 2B og C). Disse resultater antyder, at PAR

2-aktivering fremmer cellecyklus ved G1 /S checkpoint.

A549-celler blev behandlet med PAR

2 aktiverende peptid (PAR

2-AP, 50 uM) eller revers peptid (PAR

2-RP) i 24 timer. A. DNA-syntese blev målt ved BrdU mærkning assay.B. Niveauer af Cyclin D1 og cyclin E-mRNA blev detekteret med PCR efter behandling med eller uden PAR

2-AP. C. Protein niveau af cyklin D1 blev bestemt ved Western blot. D. A549-celler blev behandlet med PAR

2-AP (50 uM) 24 timer efter transient transfektion med E2F-luciferase (1 ug /brønd). Dataene blev normaliseret med tk-RL og vist som den procentdel af kontrolgruppen. E. HT29-celler blev behandlet med PIC (proteinase inhibitor cocktail) eller T9128 (trypsininhibitor). DNA-syntese blev målt ved BrdU mærkning assay. F. Protein (til venstre) og mRNA (højre) niveauer af cyclin D1 i PAR

2 knockout celler blev målt. *

s

0,05, ***

s

0,001 Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. N = 3-6. Alle forsøg er blevet gentaget mindst 3 gange uafhængigt af hinanden.

Generelt kan aktivering af cyklin /CDK-kompleks forårsage hyperphosphorylering af pRb, som fører til E2F transkriptionel aktivering og tænd downstream target gener, såsom som cyclin E. luciferase reporter assay viste, at PAR

2-AP aktivering af PAR

2 forhøjet E2F transkriptionel aktivitet (figur 2D), sammen med en samtidig forhøjelse af cyclin E-mRNA-ekspression (figur 2B). Disse resultater viser, at PAR

2-aktivering fremmes celleproliferation gennem Cyclin D1 /E2F signalering.

Desuden testede vi, om cyclin D1 spiller en rolle i PAR

2 auto-aktivering i HT29-celler. Behandling med PIC eller trypsininhibitor væsentligt afskaffet DNA-syntese i HT29-celler (Figur 2E). Ekspressionsniveauet af cyclin D1 i PAR

2 Knockdown celler blev også nedreguleret på både proteinet og mRNA-niveauer (figur 2F). Disse resultater tyder på, at cyclin D1 medieret PAR

2-induceret celleproliferation.

PAR

2 Regulerer cyclin D1 Expression på Transkriptionel og Post-transkriptionel Niveauer

For at forstå den mekanisme, som PAR

2 aktivering regulerer cyclin D1 udtryk, vi brugte A549 celler, som ikke har nogen autokrine løkke. Først blev A549-celler forbehandlet med actinomycin D til at inhibere transkription. Inhibering af transkription blokerede fuldstændigt PAR

2-induceret cyklin D1 på mRNA-niveauet (figur 3A), men ikke på proteinniveauet (figur 3B). På den anden side, knockdown af β-catenin, hvilket er en afgørende transkriptionsfaktor til induktion af cyclin D1, også blokerede fuldstændigt cyclin D1-mRNA-ekspression (figur 3C). Disse resultater antydede, at β-catenin-medieret PAR

2-induceret opregulering af cyclin D1 på det transskriptionelle niveau. Men knockdown af β-catenin kun moderat reduceret cyclin D1 på proteinniveauet (figur 3D), hvilket indikerer, at cyclin D1 også blev opreguleret af PAR

2 ved posttranskriptionel niveau.

A549-celler blev forbehandlet, med actinomycin D (2 ug /ml) 30 min før provokation med PAR

2-AP (50 uM) i 24 timer. (A) mRNA og (B) proteinniveauer af cyclin D1 blev påvist ved real time PCR og Western Blot. siRNA targeting beta-catenin blev transficeret i A549-celler 24 timer før behandling med PAR

2-AP. (C) mRNA og (D) proteinniveauer af cyclin D1 blev påvist ved real time PCR og Western Blot, henholdsvis.

Det er blevet rapporteret, at phosphorylering af cyclin D1 er involveret i dens nedbrydning. Men der var ingen signifikant ændring i phospho-cyclin D1 efter PAR

2 aktivering (data ikke vist).

miRNA Mediate PAR

2-induceret Cyclin D1 Expression

I Ud over protein modifikation, microRNA (miRNA) dukker op som vigtige regulatorer af genekspression ved at spalte mål mRNA eller ved at hæmme deres oversættelse. Faktisk havde flere microRNA blevet påvist at regulere cyclin D1 udtryk direkte [21]. For at bestemme om miRNA blev reguleret af PAR

2, vi har registreret niveauerne af miR-15a, miR-16, og miR-34a i PAR

2 Knockdown celler og PAR

2 aktiverede celler. Real time PCR viste, at niveauet af miR-34a, men ikke mir-15a og miR-16, blev dramatisk forhøjet i PAR

2 knockdown HT29 celler (PAR

2-1 og PAR

2-2 ) sammenlignet med scrambled RNA kontrolceller (RS) (figur 4A). Endvidere PAR

2 aktivering faldt betydeligt MIR-34a-ekspression i A549-celler (figur 4B). For at teste om MIR-34a kan reguleres ved HT29-afledte proteinaser, vi sulte HT29-celler i 3 timer, 24 timer og 48 timer at akkumulere PAR

2-aktiverende proteinaser (trypsin og KLK14) i medium. Kvantitativ PCR viste, at MIR-34a ekspressionsniveauet blev nedreguleret med tiden (figur 4C). Inhibitor af miR-34a, som reducerede niveauet af miR-34a (figur 4D, øverste panel) delvist genoprettet nedregulering af cyclin D1 i PAR

2 Knockdown celler (figur 4D, nederste panel). Taget sammen antyder disse data, at MIR-34a medieret PAR

2-induceret opregulering af cyclin D1.

(A) Samlet RNA af HT29, HT29 RS (scrambled kontrol-RNA) og to forskellige kloner af stabilt transfektantcellerne med PAR

2 knockdown (PAR

2-1 og PAR

2-2) blev indsamlet. Niveauerne af målrettede miRNA blev målt med real time PCR. (B) A549-celler blev behandlet med PAR

2-AP i 24 timer. (C) HT29 celler blev inkuberet med DMEM /F-12 medium uden FBS i forskellige tidsrum som angivet. (D) Transfektion af miR-34a-hæmmer eller kontrol-RNA (c-RNA) med Lipofectamin2000 i HT-29-RS eller HT-29-PAR-2. Tre dage senere blev cellerne opsamlet til analyse. Niveauerne af miRNA blev målt med real time PCR og normaliseret med U6. *

s

0,05, **

s

0,01 Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. N = 3-6.

TGF-β medieret PAR

2-relateret miRNA-34a Expression

Det næste spørgsmål er, hvordan PAR

2 aktivering regulerer udtrykket af miR-34a. Behandlingen med betinget medium fra kontrol HT29-celler (HT-29-RS) reducerede signifikant ekspressionsniveauet af MIR-34a, som blev opreguleret ved knockdown af PAR

2 i HT29-celler (HT-29-PAR-2) (fig 5A). Da TGF-β er blevet rapporteret at formindske ekspressionen af ​​MIR-34a nylig (39), rolle TGF-β i PAR-2-relateret miR34a ekspression blev testet. For det første fandt vi, at TGF-β (5 ng /ml) var i stand til at sænke MIR-34a-ekspression i både PAR

2-deficiente HT29-celler (HT-29-PAR2) (figur 5B) og i A549-celler (fig 5C). Vigtigst, udtømning af TGF-β fra det betingede medium af HT-29-RS af anti-TGFp-antistof afskaffet inhiberende virkning af betinget medium på MIR-34a-ekspression (figur 5D). Alle disse stærkt indikeret, at TGF-β medieret regulering af miR-34a induceret af PAR

2 aktivering.

(A) HT-29-RS eller HT-29-PAR-2-celler blev behandlet med betinget medium fra HT-29-RS celler (cM-RS) i 3 dage. (B) HT-29-PAR-2-celler blev behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 12 timer. (C) A549-celler blev behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 6 timer. (D) Betinget medium fra HT-29-RS (cm RS) blev inkuberet med anti-TGF β-antistof og protein A /G agarose ved 4 ° C i 2 timer. Efter centrifuge blev supernatanten (CM-RS-anti-TGF β) anvendes til behandling af HT-29-PAR-2-celle i 3 dage. Efter de forskellige behandlinger, som nævnt ovenfor, blev cellerne opsamlet til assayet af MIR-34a med real time PCR. *

s

0,05, **

s

0,01 Alle data er vist som gennemsnit ± SEM. N = 4-8.

Korrelation af PAR

2, Trypsinogen, KLK14, cyclin D1 og miR-34a i Colon Cancer Prøver

For at få indsigt i den biologiske rolle af PAR

2 autokrine signalering i human colorectal carcinogenese, ekspressionsniveauer af PAR

2 og dens aktiverende proteinase blev målt i 30 parret menneskelige T3 colorectal cancer (CRC) prøver. Regelmæssig RT-PCR blev anvendt til at detektere mRNA-ekspression af trypsinogen og KLK14 i CRC prøver og viste, at næsten alle prøverne ekspres PAR

2-aktiverende proteinase (figur 6A). Halvfjerds procent (21/30) af humane CRC prøver viste forhøjede trypsinogen ekspression i tumorvæv sammenlignet med parrede normale colon væv, mens normale væv udviste næsten ingen trypsinogen ekspression. Real time PCR viste, at PAR

2 blev i vid udstrækning udtrykt i normal slimhinde og primære CRC prøver. Som vist i figur 6B, PAR

2 viste sig at være i gennemsnit signifikant (

s

0,05) overudtrykt i CRC prøver med højere udvikling klasse, mens CyclinD1 og miR-34a viste ingen signifikant ændringer (figur 6B). Interessant, højere niveauer af PAR

2, cyclin D1 og lavere miR-34a var signifikant korreleret med lymfeknude metastaser i CRC prøver (figur 6C). Tilsammen valideret disse data, at den autokrine løkke af PAR

2 og aktiverende proteinase kan fremme tumor udvikling og kræft invasion i humane CRC prøver.

(A) Udtrykket af trypsinogen og KLK14 i human CRC tumorprøver (t) og parret normalt væv (N) blev målt med PCR. Actin blev anvendt som en intern kontrol. MRNA ekspression af PAR

2, CCND1 og niveauet af MIR-34a i humane CRC prøver blev testet med real time PCR. De blev sammenlignet i henhold til (B) karakteren eller (C) status for lymfeknude metastaser. Dataene er vist som fold ændring af tumor prøve (T) for at parret normale væv (N).

Diskussion

MikroRNA’er (miRNA) er endogent udtrykt 17-25 nukleotid, ikke-kodende RNA og regulere genekspression på post-transkriptionel niveau. Siden den første miRNA, lin-4, blev opdaget i 1993 [22], [23], cirka 1000 miRNA er blevet identificeret i mennesker [24] og kan målrette over 30% af alle gener og et flertal af genetiske pathways [25] , [26]. I det sidste årti, har miRNA dukket op som kritiske regulatorer i cancer [27] og er involveret i udviklingen af ​​en række cancersygdomme, herunder colorectal carcinom [28]. Stigende evidens for, at bestemte miRNA er korreleret med sygdom scene, metastaser og overlevelse i CRC. Til dato er der 118 miRNA som alle er blevet bekræftet, og er forbundet med CRC udvikling [29]. Nogle af miRNA funktion som tumorsuppressor, såsom let7a, miR-34 a /b /c, miR-126, miR-143, miR-145, og miR-200 familie, mens nogle af dem menes at være onkogen, såsom som mIR-17-92 klynge, mIR-21, og mIR-135.

Ukontrolleret celleproliferation er en funktion af cancer. En række miRNA er blevet identificeret, der regulerer cellecyklus. Nogle af miRNA fremmer celleproliferation, såsom MIR-125b [30], mens nogle af dem inducere standsning af cellecyklus. For eksempel, lad-7 har vist sig at være en kraftig vækst suppressor i forskellige cancerceller [31], [32]. To relaterede miRNA MIR-143 og MIR-145 har vist sig at undertrykke vækst dels gennem målrettet ERK5 [33]. Thrombin har vist sig at stimulere celleproliferation fra stigningen i MIR-222, som kan inhibere p27 ekspression [34]. Den aktuelle undersøgelse viste, at serin proteinase aktiveret PAR

2 og var også i stand til at påvirke niveauet for miRNA, der funktionelt medieret cellevækst i kræftceller (figur 7).

Som en vigtig regulator af G1 /S checkpoint, kan cyclin D1 målrettes af forskellige miRNA. MIR-15a og MIR-16 ofte slettet eller nedreguleret og disse begivenheder omvendt forhold med ekspressionen af ​​cyclin D1 i cancer. Yderligere undersøgelser viste, at cyclin D1 er direkte reguleret af miR-15a og miR-16 [35]. Desuden kan cyklin D1-ekspression reguleres af MIR-200b and Let-7b ved at målrette Rho familie GTPase 3 (RND3) [36], [37]. I den aktuelle undersøgelse blev detekteret MIR-15a og MIR-16. Men der var ingen signifikant ændring i deres ekspressionsniveauerne efter PAR

2 aktivering i A549-celler (figur 3F) eller efter PAR

2 knowdown i HT29-celler. Desuden var der ingen signifikant ændring af MIR-200b and Let-7b (data ikke vist), der var heller ingen konsistent ændring i ekspressionen af ​​målgenet, RND3, som bestemt ved western blot og luciferase reporter assay med 3’UTR af RND3 (data ikke vist). Det antydes, at MIR-15a, MIR-16 og MIR-200b er ikke de mediatorer af PAR

2-induceret opregulering af cyclin D1.

MIR-34a tilhører MIR-34 familien, som også omfatter mIR-34b og mIR-34c. Lave niveauer af miR-34 er ofte blevet observeret i forskellige tumorer, herunder CRC [38]. Inaktivering af endogene MIR-34a stimulerer celleproliferation og inhiberer p53-afhængig apoptose ved at målrette cyclin E2, cyklin-afhængige kinaser 4/6 (CDK4 /6) [38]. Vores undersøgelse har vist, for første gang, at MIR-34a medierede den autokrine sløjfe af PAR

2 og dets aktiverende proteinase, som er nødvendig for at opretholde colon cancer celleproliferation.

Aktivering af ERK og transaktivering af EGFR er blevet vist at være involveret i den proliferative effekt af PAR

2 [7], [9]. Men i den aktuelle undersøgelse, hverken hæmmer af ERK (PD98059 og U0126) eller inhibitor af EGFR-tyrosinkinase (AG1478) var i stand til at blokere celleproliferation eller ændringen i MIR-34a ekspression i HT29 og A549-celler (data ikke vist). Det indebar, at reguleringen af ​​miR-34a ikke var afhængig af EGFR og ERK vej efter PAR

2 aktivering i kræftceller.

For nylig er det blevet rapporteret, at forhøjet TGF-β aktivitet undertrykt udtryk for microRNA-34a i leveren væv [39]. Desuden har PAR

2 aktivering blevet påvist at forøge TGFp-produktion i mus [40]. Derfor er det ikke overrasket over, at TGFp formidler undertrykkelsen af ​​miR-34a induceret af PAR

2 aktivering i aktuelle undersøgelse. Endvidere konstitutiv aktivering af PAR

2 på grund af den autokrine sløjfe af PAR

2 og dens aktiverende proteinase kan delvis bidrager til det lave niveau af MIR-34a, som er fælles i forskellige kræftformer, såsom tyktarmskræft.

i betragtning af de nye roller PAR

2 i kræft, PAR

2 er blevet attraktivt mål for kræftbehandling. PAR

2 var bredt udtrykt i kræft og positivt korreleret med tumor progression i CRC. Vigtigere, PAR

2 blev aktiveret ikke blot af proteinaser fra mikromiljøet af cancer, men også, som vores undersøgelse viser, ved proteinaser produceret af cancerceller selv. Desuden overvejer reguleringen af ​​miRNA ved PAR

2-aktivering, at vi nu har beskrevet, en mere omfattende virkning på spredning vil blive forventet efter at målrette PAR

2 aktivering i kræftceller. Med forbedring af PAR

2-antagonister i øjeblikket er under udvikling, PAR

2 vil være et godt mål for kræftbehandling i fremtiden.

Tak

Vi takker professor Nathalie Rivard,