PLoS ONE: ERBB2 Øger metastatisk Potentials Specielt i Androgen-prostatacancer Cells

Abstrakt

På trods af alle blod-baserede biomarkører anvendes til at overvåge prostata kræftpatienter, prostatakræft forbliver som den anden almindelig årsag til dødelighed af kræft hos mænd i USA. Dette skyldes i høj grad en manglende forståelse for de molekylære veje, der er ansvarlige for de aggressive former for prostatakræft, kastreringsområdet-resistente prostatakræft og metastatisk prostatacancer. Cell signalveje aktiveret af

ERBB2

onkogen eller

RAS

onkogen er hyppigt skal ændres i metastatisk prostatakræft. At vurdere og definere den rolle, ErbB2 /RAS vej i prostatakræft metastase, har vi vurderet virkningen af ​​

ERBB2

– eller

RAS

-overexpression på de metastatiske potentialer for fire prostatakræft celle linjer afledt af tumorer med forskellige androgen følsomheder. For at gøre dette, vi transficeret den menneskelige DU145, LNCaP, og PC3 prostatacancerceller og de murine Myc-CAP prostatacancerceller med den aktiverede form af

ERBB2

eller

H-RAS

og vurderes deres metastatiske potentialer hos tre komplementære assays, et sårhelende assay, et transwell motilitet assay, og et transwell invasion assay. Vi viste, at mens overekspression af

ERBB2

øgede metastatiske potentiale androgen-ufølsom prostatacancerceller (dvs. PC3 og DU145), gjorde det ikke påvirke metastatiske potentialer i androgen-følsomme prostatacancerceller (dvs. LNCaP og myc-CaP). I modsætning hertil

overekspression af

H-RAS kun øget celle motilitet af Myc-cap celler, der overudtrykker mennesket

c-myc

onkogen. Vores data tyder på, at ERBB2 samarbejder med androgen signalering at fremme prostatakræft metastase, og at selv om RAS er en af ​​de kritiske nedstrømseffektorer i ErbB2, betyder det ikke phenocopy ERBB2 til dens indvirkning på de metastatiske potentialer på prostatakræft-cellelinier.

Henvisning: Tome-Garcia J, Li D, Ghazaryan S, Shu L, Wu L (2014) ERBB2 Øger Metastatisk Potentialer Specielt i Androgen-prostatacancer Cells. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10,1371 /journal.pone.0099525

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina

Modtaget 11. april 2014 Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 17 Jun 2014

Copyright: © 2014 Tome-Garcia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. findes i papiret Alle data

Finansiering:. startfonde fra Rutgers New Jersey Medical School. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige non-kutant kræft og den anden hyppigste dødsårsag kræft hos mænd i USA [1]. Trods øget screening for tidlig påvisning og overvågning, prostatakræft dødelighed er forblevet på samme niveau [2]. Dette skyldes sandsynligvis både manglende evne til diagnostisk skelne mellem de ikke-invasive, indolente lokaliserede prostatakræft og de meget aggressive lokaliserede cancere med høje metastatiske potentialer og den ringe forståelse af den cellulære og molekylære basis for metastatiske prostatakræft [3].

En af de bedst undersøgte gener i humane maligniteter, herunder prostatakræft, er det

ERBB2

eller

HER2

eller

NEU

onkogen. ERBB2 er medlem af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) familie, der består af fire medlemmer (EGFR, ErbB2, ErbB3 og ErbB4), der fungerer som tyrosinkinasereceptorer [4] – [7]. De betragtes som potente mediatorer for cellevækst og cancer udvikling [8] – [10]. I brystkræft, forstærkning eller overekspression af

ERBB2

er en fælles begivenhed, der vises i 15-30% af alle prøver [11], og

ERBB2

genamplifikation og /eller overekspression har været forbundet med et dårligt klinisk resultat [12], [13]. I overensstemmelse med en vigtig rolle i ErbB2 i brystkræft metastase, overekspression af en konstitutivt aktiveret form af

ERBB2

(dvs.

neut

) [14] i mus er tilstrækkelig til at udløse metastatiske brysttumorer [15 ]. Men den potentielle rolle i ErbB2 i udviklingen af ​​metastatisk prostatacancer er uklar dels fordi forskellige forsøg på at vurdere frekvenser af

ERBB2

amplifikation /overekspression i human prostatacancer prøver givet inkonsistente resultater [16] – [25]. Interessant,

ERBB2

overekspression har været impliceret i androgen-resistent metastatisk prostatakræft [26], hvilket tyder på en mulig rolle for ERBB2 i erhvervelsen af ​​metastatiske potentialer prostatacancerceller.

Overekspression af

erbB2

resulterer i induktionen af ​​flere signalveje, såsom phosphoinositid-3-kinase /proteinkinase B (PI3K /AKT) biosyntesen samt mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway [27]. Både PI3K /AKT-vejen og MAPK pathway regulerer celleproliferation og celle overlevelse, og har været impliceret i cancer metastaser [28] – [30]. Den væsentligste nedstrømseffektor i ErbB2 som regulerer disse to kinase pathways er den onkogene

RAS

, selvom ERBB2 er også i stand til at aktivere PI3K /AKT uafhængigt af

RAS Salg aktivering [31]. Vigtigere er det, PI3K /AKT og MAPK er de eneste RAS-effektor veje almindeligt muterede i humane kræftformer [32].

RAS

onkogener indkode tre monomere GTPaser, H-RAS, N-RAS, og K-RAS, som aktiveres ved binding til GTP. Mens hæmning af

RAS

i androgen-uafhængige PC3 prostatacancerceller og androgenafhængige LNCaP prostatacancerceller førte til vækst anholdelse og apoptose [33], konstitutiv aktivering af RAS /MAPK vej hos LNCaP prostatacancerceller fremmes androgen overfølsomhed [34]. Desuden immunhistokemisk analyse af hormon-følsomme og hormon-refraktær prostatacancer prøver viste, at øget ekspression af

N-RAS

var forbundet med hormon-refraktær prostatacancer, og var korreleret med kortere tid til tumortilbagefald og reduceret sygdomsspecifikke overlevelse [35]. I en xenograf musemodel, aktivering af to RAS effektor pathways,

Raf /ERK

RalGEF

, i moderat metastatisk DU145 prostatacancer-cellelinie fremmet metastase til hjernen og knogler, henholdsvis [ ,,,0],36]. Disse data tyder på en mulig rolle af RAS at fremme metastase i humane prostatakræft.

For yderligere at definere de potentielle roller ErbB2 /RAS vej at fremme prostatakræft metastase, vi har undersøgt virkningerne af overekspression af

ERBB2

eller

RAS

på metastatiske egenskaber af tre human prostatacancer-cellelinier og én murin prostatacancer-cellelinie med forskellige niveauer af androgen følsomheder og forskellige metastatiske potentialer. For at gøre det, vi først transficeret tre almindeligt anvendte humane prostata cancer cellelinier (DU145, LNCaP, og PC3) og en muse prostatacancer cellelinje (Myc-cap) med den aktiverede form af

ERBB2

eller

H-RAS

. Vi derefter vurderet metastatiske potentialer de genetisk modificerede celler ved tre forskellige komplementære assays en sårheling assay, en transwell motilitet assay, og en invasion assay. Vi fandt, at mens overekspression af

ERBB2

øget metastatiske potentialer specielt til androgen-ufølsomme humane prostatacancerceller overekspression af

RAS

ikke har lignende virkninger på metastatiske potentialer men specifikt forøget cellemotilitet af

c-myc

-overexpressing murine myc-cap celler.

Metoder

cellelinjer og Cell Culture

Myc-Cap er en ikke-metastatisk, androgen -følsom murine prostatakræft cellelinje, der blev etableret fra primære prostatatumorer isoleret fra den

Pb-Hi-Myc

mus [37]. LNCaP [38], DU145 [39], og PC3 [40] er tre humane metastatiske prostata cancer cellelinjer med forskellige androgen følsomheder og forskellige metastatiske egenskaber (tabel 1). LNCaP og PC3-cellelinjer blev opretholdt i RPMI 1640 medium, og Myc-cap-celler blev dyrket i DMEM. Begge medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). DU145 celler blev holdt i DMEM: Hams F12-medium (01:01) tilsat 10% serum fra nyfødte kalve. Amphotrop Phoenix celler blev anvendt til retroviral transfektion og blev opretholdt i DMEM suppleret med 12,5% FBS. Aldrende BJ humane hudfibroblastceller blev genereret ved replikativ senescens [41] og blev anvendt som en positiv kontrol for β-galactosidaseaktivitet assay. De blev holdt i DMEM suppleret med 10% FBS. Alle celler blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO

2.

retroviral transfektion

Retrovirale overekspression vektorer

pBabe-Puromycin-H- Ras

og

pBabe-Puromycin-ERBB2

, som overudtrykker en muteret form af human

H-RAS

gen (

H-RAS

G12V

) og en konstitutiv aktiveret form af human

ERBB2

gen (

neut

) henholdsvis var gaver fra Dr. Gustavo Leone. Høj titer vira blev fremstillet ved calciumphosphat transient transfektion af retrovirale konstrukter til amfotropiske Phoenix pakkeceller som tidligere beskrevet [42]. Vi inficerede prostatacancerceller med friske retrovira under anvendelse af standardmetoder i nærvær af polybren (4 ug /ml). Inficerede celler blev underkastet selektion med puromycin (2,5 ug /ml) i fem dage. Puromycin-resistente celler blev dyrket i frisk DMEM uden puromycin for én dag før de enten Høstet at forberede cellelysater for Western blotting-analyse, eller genudpladet til eksperimenter. Alle data præsenteres blev indsamlet ved hjælp af celler fra mindst to uafhængige retrovirale transfektioner der gav tilsvarende niveauer af

ERBB2

RAS

overekspression.

Western Blot

cellelysater med lige store mængder af proteiner (30 ug) blev separeret i 8% SDS-PAGE, med undtagelse af ERK og pERK, for hvilke cellelysater blev adskilt i 10% SDS-PAGE. Separerede proteiner blev derefter elektroforetisk overført til en 0,45 um nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), som efterfølgende blev blokeret ved 4 ° C i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i TBST (50 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 (vægt /volumen)). Blottene blev derefter inkuberet med passende fortyndinger af primære antistoffer natten over ved 4 ° C i TBST indeholdende 3% fedtfri tørmælk. Primære antistoffer anvendt til Western blot-analyse indbefatter polyklonale antistoffer for H-RAS (sc-520), E2F1 (sc-193), E2F2 (sc-633), ERK1 /2 (sc-135.900), og p-ERK1 /2 ( sc-81.492) fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX); actin (A2066) fra Sigma (St. Louis, MO); ERBB2 (MS-730-PI) fra Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA); AKT (4691S), p-AKT (4060S), p38 (9212S), og p-p38 (9211S) fra Cell Signaling (Beverly, MA). Efter vask 10 min i tre gange i TBST, blev blottene inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer fra Perkin Elmer (Boston, MA) enten mod kanin (NEF 812001EA) eller mod mus (NEF 822001EA) med en fortynding på 1:3000 i TBST med 3% mælk. Efter tre vaske med TBST i 10 minutter hver, blev blottene inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med ECL fra Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL), og udsættes for en røntgenfilm til autoradiografi. Antistoffer mod actin blev anvendt som indlæsning kontroller. Kvantificering af protein niveauer baseret på bandets intensiteter på Western blots blev udført med Image J software (NIH, MD, USA, https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Sår healing assay

migrationen evne af cellerne blev vurderet ved anvendelse af en sårhelende assay som tidligere beskrevet med mindre ændringer [43]. Celler blev udpladet i 35 mm skåle og venstre for at vokse indtil den når 100% konfluens. Sammenflydende celler blev holdt under de samme dyrkningsbetingelser i 48 timer for at inducere densitet arrest og minimere cellulær proliferation. Konfluente plader blev ridset ned tre gange med en 200 pi pipettespids, skaber venstre, center og højre ridser /sår, krydsede med to vandrette linjer tidligere trukket som pejlemærker for kvantificeringer. Efter ridser, blev pladerne vasket en gang med medium for at fjerne flydende celler, og blev erstattet med frisk medium. Cellerne fik lov til at migrere tværs sårene og billeder blev taget på forskellige tidspunkter under anvendelse af et fasekontrastmikroskop indtil såret var helt lukket. Tidspunkterne, hvor billederne blev taget afhang migreringsevnen af ​​forskellige cellelinier undersøgt. Hvert forsøg blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst en gang for at validere de oprindelige data.

motilitet assay (Boyden Chamber Assay)

motilitet af cellerne blev også vurderet under anvendelse af cellekultur indsætter fra BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), og efter den protokol, der tidligere etableret med mindre modifikationer [44]. Celler, der tidligere blev holdt i en sult medium med 0,2% FBS i 24 timer for at minimere cellulær proliferation, blev resuspenderet i en koncentration på 2 × 10

5 celler /ml i medium indeholdende 0,2% FBS. 1 × 10

5 celler eller 500 pi cellesuspensioner blev udpladet på hver indsats, der tidligere blev overtrukket med 3 ug /ml rottehalecollagen opløsning fra BD (Bedford, MA) natten over ved stuetemperatur. Det nedre kammer indeholdt medium med 10% FBS som kemo-tiltrækningsstof. Cellerne fik lov til at passere gennem den porøse membran og blev opsamlet på forskellige tidspunkter, som blev empirisk bestemt på basis af migreringsevnen af ​​hver cellelinie. Ikke-migrerende celler blev derefter fjernet fra overfladen af ​​de membraner ved anvendelse vatpinde. Celler, der passerede gennem porerne i membranen blev fikseret og farvet under anvendelse af Diff-Quick kerner og cytoplasma farvning kit (Dade Behring, Newark, DE). Farvede migrerende celler blev talt under et mikroskop. Hvert forsøg blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst en gang for at validere de oprindelige data.

Invasion Assay

invasionsevne af cellerne blev målt ved anvendelse cellekultur inserter fra BD Falcon (Franklin Lakes, NJ) ved at følge en tidligere beskrevet protokol med mindre modifikationer [45]. Som i transwell-baserede motilitet ovenfor beskrevne assay blev cellerne opretholdt i en sult medium med 0,2% FBS i 24 timer før såning at minimere cellulær proliferation. Inserter blev overtrukket med 50 ug /ml rottehalecollagen opløsning fra BD (Bedford, MA) i 5 timer ved stuetemperatur. Efter inkubationen blev inserter vasket tre gange med serumfrit medium og fik lov til at tørre ved 37 ° C natten over. Når tørret blev membranerne overtrukket med 100 pi collagen opløsning ved en slutkoncentration på 1,3 mg /ml (for alle celler) eller med 100 pi Matrigel (Cat. # 356.231) fra BD (Bedford, MA) ved en slutkoncentration på 300 ug /ml (for kun Myc-cap-celler), og fik lov at størkne ved 37 ° C. Celler blev resuspenderet ved en koncentration på 2 × 10

5 celler /ml i medium indeholdende 0,2% FBS. 1 × 10

5 celler eller 500 pi cellesuspensioner blev udpladet på hver indsats. Den resterende procedure blev udført som beskrevet ovenfor i motilitet assay afsnittet. Hvert forsøg blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst en gang for at validere de oprindelige data.

Vurdering af Ældning-associeret β-galactosidaseaktivitet

endogene β-galactosidase aktivitet af prostatacancerceller var vurderet ved X-gal-farvning som beskrevet tidligere [46]. Celler podet i 35 mm skåle in triplo blev fikseret i tre minutter ved stuetemperatur i 1X PBS indeholdende, 2% formaldehyd og 0,2% glutaraldehyd. Efter to på hinanden følgende vaske med 1X PBS blev cellerne inkuberet i 16 timer ved 37 ° C med farveopløsning (2 ml pr skål), der består af X-gal ved en slutkoncentration på 1 mg /ml i dimethylformamid, 40 mM citronsyre /natriumphosphatpuffer pH 5,7 (0,1 M citronsyre /0,2 M natriumphosphat), 5 mM kaliumferrocyanid, 5 mM kaliumferricyanid, 150 mM natriumchlorid, og 2 mM magnesiumchlorid. Billeder blev taget under en fase-kontrast mikroskop. Positive og negative celler blev talt fra mindst tre forskellige områder.

Cell Growth Rate Assessment

Prostatakræft celler blev podet i 6-brønds plader i tre eksemplarer. Tætheden af ​​den oprindelige såning var empirisk fast besluttet på at gøre det muligt for os at tælle mindst fire tidspunkter, før cellerne nåede 100% sammenløb. Således blev celler seedet som følger: 70000 celler til PC3, 35000 celler til LNCaP, 120000 celler til DU145 og 70000 celler til Myc-CaP. Tolv timer efter podning blev cellerne talt ved anvendelse af et hæmocytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA), der skal normaliseres som den tilsvarende seeding celle nummer og skal anvendes som det første tidspunkt. Celler blev derefter talt hver 12 timer for PC3 og Myc-Cap-cellelinjer eller hver 24 timer for DU145 og LNCaP cellelinjer. Vækstraterne blev estimeret ved beregning og sammenligning den lineære hældning for hver vækstkurve.

Statistisk analyse

Værdier præsenteres som gennemsnit ± SD. Statistisk signifikans blev bestemt ved Students

t

-test med en signifikans grænse på

P

0,05. I alle figurer, blev statistiske betydninger betegnet som

*

P

0,05, **

P

0,01, og ***

P

0.001.

Resultater

Overekspression af

ERBB2

RAS

Onkogener i Prostata Cancer cellelinier ved retroviral infektion

for at overekspression

ERBB2

RAS

onkogener i prostatakræft-cellelinjer, vi transficeret prostatacancerceller med

pBabe-Puromycin-

(

PBP-

) baseret retrovirus overekspression en aktiveret form af

ERBB2

(

PBP-ERBB2

) eller en muteret form af

H-RAS Hotel (

PBP-RAS

). Som vist i figur 1, Western blotting-analyse viste, at transfektion af celler med

PBP-RAS

retrovira førte til moderat up-forskrifter

RAS

området fra 1,5 fold (for LNCaP) til 4,7 gange (for PC3), og at transfektion af celler med

PBP-erbB2

retrovira førte til moderat op-forskrifter

ERBB2

området fra 2,5 gange (for DU145) til 4,0 gange (for Myc- CaP) Interessant skønt

RAS Salg overekspression ændrede ikke proteinniveauer i ErbB2,

ERBB2

overekspression forhøjet proteinniveauer af RAS (2,9 gange) specifikt i Myc-CAP-celler (figur 1), der overudtrykker menneske

c-myc

onkogen [37].

ERBB2 og RAS protein niveauer blev vurderet ved Western blot ved hjælp af antistoffer mod H-RAS eller ERBB2 for den samlede cellelysater fremstillet af prostatakræft celler transficeret med enten kontrol retrovirus (

PBP

) eller retrovirus overekspression

PBP

–

H-RAS Hotel (

RAS

) eller

PBP -ERBB2 Hotel (

ERBB2

). Blots med antistoffer mod actin tjente som lastning kontrol. Tal i hvid repræsenterer fold ændringer i ERBB2 eller RAS protein niveauer i

ERBB2

– eller

RAS

-overexpressing celler i forhold til dem i deres tilsvarende

PBP

kontrol celler efter actin normalisering.

Overekspression af

ERBB2

fører til moderate stigninger i cellevækst i LNCaP, DU145 og PC3 Celler

betragtning af, at aktivering af

ERBB2

/

RAS

signalvejen i prostata kræftceller kan påvirke deres vækstrater, som kunne påvirke analyse for at vurdere deres metastatiske potentialer, vi foretaget en vækstkurve under anvendelse asynkrone celler. Som vist i figur 2,

ERBB2

overekspression førte til moderate stigninger i vækstrater for alle de tre humane prostatakræft-cellelinier: i gennemsnit 43% stigning for LNCaP-celler, 33% stigning for DU145 celler, og 25% stigning for PC3 celler. Men overekspression af

ERBB2

påvirkede ikke vækstraten for den murine prostatacancer cellelinje, Myc-CaP. I modsætning hertil

RAS

overekspression ikke få væsentlig indvirkning på væksten i nogen af ​​de fire cellelinjer (figur 2).

Cell vækstrater blev vurderet ved celle tælle hver 12 timer eller 24 timer til forskellige prostata kræftceller, der blev transficeret med kontrol retrovirus (

PBP

), eller retrovirus overekspression enten

PBP-H-RAS Hotel (

RAS

) eller

PBP-ERBB2 Hotel (

ERBB2

).

Overekspression af

RAS

Reducerer Cell Migration Satser for LNCaP og DU145 cellelinier

virkningerne af

ERBB2

RAS

overekspression på metastatiske potentialer LNCaP, DU145, PC3, og Myc-cap prostatakræft-cellelinier blev først vurderet ved at udføre en sårheling assay. For at overvinde potentielle virkninger af øget celleproliferation i

ERBB2

-overexpressing celler (Figur 2) på sårheling assay, vi inducerede celletæthed anholdelse ved at opretholde sammenflydende plader til 48 timer, før du foretager ridser /sår. Som vist i figur 3, overekspression af

ERBB2

RAS

viste forskellige effekter på de tre menneskelige prostata cancer cellelinjer. Konkret mens overekspression af

ERBB2

havde ingen signifikant effekt på migrationen satser for alle de tre menneskelige prostatakræft-cellelinier, overekspression af

RAS

faldt betydeligt migrationen satser LNCaP og DU145 celle linjer. Sammenlignet med de menneskelige prostatakræft-cellelinier, den murine prostatakræft cellelinje Myc-CaP syntes at have lavere migration, som fremgår af det faktum, at de ikke helt at lukke såret, før de begyndte at vokse igen omkring 32 timer tidspunkt (data ikke vist), uanset status for

ERBB2

– eller

RAS

-overexpression (figur 3). Ikke desto mindre,

ERBB2

-. Eller

RAS

-overexpressing Myc-cap celler havde en moderat, men statistisk ubetydelig stigning i migration satser i forhold til kontrol-celler (figur 3)

Cell migration satser blev estimeret ved en sårheling assay for prostata kræftceller, der blev transficeret med enten kontrol retrovirus (

PBP

), eller retrovirus overekspression

PBP

–

H-RAS

(

RAS

) eller

PBP-ERBB2 Hotel (

ERBB2

). Venstre paneler viste procentdele af sår forblev på forskellige tidspunkter. Procentdelen af ​​sår blev anslået på grundlag af gennemsnittet af 12 målinger på hver plade afspejler målinger af fire jævnt fordelt afsnit om hver af de tre sår /ridser på hver plade. Data blev præsenteret som middelværdier ± SD fra tre gentagelser. Højre paneler viste repræsentative billeder taget på forskellige tidspunkter. Alle billeder blev taget på samme skala med en skala bar på 200 uM vises i det første billede.

ERBB2

overekspression Øger Cell Motilities af androgen-ufølsom DU145 og PC3 Cells og

RAS

overekspression Øger Cell motilitet af Myc-cAP Celler

Som supplement til sårheling data præsenteret ovenfor, vi også vurderet effekten af ​​overekspression af

ERBB2

og

RAS

på cellemotilitet af prostata cancer cellelinier ved en transwell-baserede cellemotilitet assay under anvendelse porøs membran skær i transbrøndene. Mens sår healing assay måler lateral celle motilitet skyldes afbrydelse af celle-celle-interaktioner [47], Boyden kamre Transwell assay måler kemo-tiltrækkende migration, som i modsætning til sårheling assay, er uafhængig af brud i celle-celle vejkryds [48]. Derfor er disse to assays supplerer hinanden og anvendes ofte i parallel for at opnå biologiske indsigt i forskellige typer af cellemigrering. For at minimere konsekvenserne af differentierede celle vækstrater på

ERBB2

overekspression på motilitet assay, vi induceret cellecyklusstop ved at opretholde celler under serum-sult betingelser for 24 timer før udførelse af motilitet assay. Som vist i figur 4, overekspression af

ERBB2

signifikant øget celle motilities af de to mere metastatiske, androgen-ufølsom cellelinjer, DU145 celler og PC3-celler, med en stigning på 30% og en 6-fold forøgelse, henholdsvis . I modsætning hertil

ERBB2

overekspression væsentligt reduceret de motilities de to ydmyge eller ikke-metastatiske, androgen følsomme prostatacancer cellelinjer, LNCaP- og Myc-CaP. Hertil kommer, mens

RAS

overekspression væsentligt reduceret de motilities af LNCaP celler og PC3 celler, det væsentligt øget motilitet Myc-cap celler, som overudtrykker

c-myc

onkogen.

Cell motilities blev vurderet ved en transwell-baserede motilitet assay for prostata kræftceller, der blev transficeret med enten kontrol retrovirus (

PBP

) eller retrovirus overekspression

PBP

–

H-RAS Hotel (

RAS

) eller

PBP-ERBB2 Hotel (

ERBB2

). Hver søjlediagram viste relative antal celler, der har passeret gennem transwell indsatser /membraner, der blev farvet og talt under et mikroskop i mindst 10 felter pr insert. Data blev præsenteret som middelværdier ± SD fra tre gentagelser. Repræsentative billeder taget på et givet tidspunkt blev vist under hver søjlediagram. Alle billeder blev taget på samme skala med en skala bar på 200 uM vises i det første billede.

ERBB2

overekspression Fremmer Cell invasiv i androgen-ufølsom DU145 og PC3 Cells

De metastatiske potentialer

ERBB2

– eller

RAS

-overexpression i forskellige prostatakræft-cellelinier blev yderligere vurderet ved at vurdere deres relative invasionsevne af en transwell-baserede invasion under anvendelse celleindsatsene overtrukket med en collagenmatrix. Denne invasion assay tillader celler at gå gennem en 100 uM-tyk kollagenmatrix fra en lav-serumholdigt medium til et serum-beriget miljø. Som vist i figur 5 blev invasivitet af androgen-ufølsom DU145 celler og PC3-celler i det væsentlige forøget i nærvær af

ERBB2

overekspression men ikke i nærvær af

RAS

overekspression. Disse data er i overensstemmelse med dataene fra Transwell-baserede motilitet assay viser, at overekspression af

ERBB2

i DU145-celler og PC3-celler førte til forøget cellemotilitet (figur 4). Overensstemmelse med deres lave eller ingen metastatiske potentialer, hverken Myc-CaP-celler eller LNCaP-celler viste sig at være i stand til at gennemtrænge collagenmatrix selv efter 96 timers inkubation (data ikke vist). Vigtigere, overekspression af

ERBB2

eller

RAS

var utilstrækkelig til at muliggøre enten Myc-CAP celler eller LNCaP celler at passere gennem kollagen matrix (data ikke vist).

Cell invasionsevne blev vurderet ved en transwell-baserede invasion assay for prostata kræftceller, der blev transficeret med enten kontrol retrovirus (

PBP

) eller retrovirus overekspression

PBP

–

H-RAS

(

RAS

) eller

PBP-ERBB2 Hotel (

ERBB2

). Hver søjlediagram viste antallet af celler, der er passeret gennem collagenmatrix enten 72 timer (for PC3-celler) eller 96 timer (for DU145 celler) efter udpladning. Transwell inserter blev farves og invaderende celler blev talt for hele skær. Data blev præsenteret som middelværdier ± SD fra tre gentagelser. Repræsentative billeder blev vist under hver søjlediagram. Alle billeder blev taget på samme skala med en skala bar på 200 uM vises i det første billede.

Da overekspression af

RAS

øget celle motilitet specifikt i Myc-CaP celler (figur 4), udførte vi en transwell-baseret invasion assay på Myc-cAP celler under anvendelse Matrigel at erstatte collagen. Sammenlignet med collagenmatrix, at Matrigel matrix er en rekonstitueret basalmembran fremstillet ud fra et muse sarkom at bedre efterligner ekstracellulære miljø af en cancer. Som i tilfældet med collagenmatrix, blev ingen celle ses at passere gennem Matrigel matrix enten i kontrolcellerne eller i de

RAS

-overexpressing celler (data ikke vist).

moderate niveauer af

betyder RAS

overekspression ikke Fremme Cellular Ældning i Prostata Cancer Cells

Tidligere undersøgelser har vist, at langvarig udtryk for onkogen

RAS

i menneskelige og gnaver primære fibroblastceller

in vitro

[49] eller høje niveauer af overekspression af oncognic

RAS

i mammaepitelceller

in vivo

[50] ført til øget cellulær ældning. Da

RAS

-overexpressing LNCaP celler og DU145 celler viste reducerede evner til at lukke en provokeret sår (figur 3), og siden

RAS

-overexpressing LNCaP celler og PC3 celler viste nedsat celle motilities i Transwell mobilitet assay (figur 4), forsøgte vi at bestemme, om den nedsatte mobilitet i disse

RAS

-overexpressing humane prostatacancerceller kan forklares med en potentiel stigning i cellulær senescens i disse celler. Til dette formål anvendte vi

in vitro

X-gal-farvning for at vurdere senescens-associerede β-galactosidase aktiviteter, en almindeligt anvendt biomarkør for cellulær aldring [51]. Som vist i figur 6A og figur 6B, moderate niveauer af

RAS

overekspression i vores eksperimentelle indstilling (figur 1) øgede imidlertid ikke signifikant cellulær senescens i LNCaP, PC3 og DU145 celler, hvilket fremgår af den kendsgerning, at

RAS

-overexpressing celler viste lignende procentdele af X-gal-positive celler som deres tilsvarende

PBP

kontrol celler. I modsætning hertil PC3 celler med et meget højere niveau af

RAS

overekspression (dvs. 13,6 fold, figur 6C, “

Hi-Ras”

) viste en signifikant stigning i procentdelen af ​​X-gal -positive celler end enten PC3 celler inficeret med kontrol vektor (figur 6C, “

PBP”

) eller PC3 celler med et moderat udtryk for

RAS

(dvs. 4,2 fold; Figur 6C “

RAS”

) (figur 6A og 6B). Den øgede procentdelen af ​​X-gal-positive PC3-celler med et højere niveau af

RAS Salg overekspression både er i overensstemmelse med deres senescens-lignende morfologi (dvs. store og flad) (figur 6A) og med en tidligere rapport, at høje niveauer af

Ras

overekspression ført til øget cellulær aldring [50]. Tilsammen vore data antyder, at manglende evne RAS at fremme cellemotilitet eller invasivitet i human prostatacancer-cellelinier ikke skyldes tidlig cellulær ældning.

(A) Ældning-associerede β-galactosidase aktiviteter blev vurderet ved X-gal farvning for humane prostatakræft-cellelinier transficeret med enten kontrol retrovirus (

PBP

) eller retrovirus overekspression

PBP-H-RAS Hotel (

RAS

). PC3 celler, der udtrykker et ekstremt højt niveau af

RAS

(

Hi-RAS

) blev inkluderet til sammenligninger. Aldrende BJ humane hudfibroblastceller blev anvendt som en positiv kontrol for X-gal-farvning. Repræsentative billeder blev vist med de repræsentative X-gal-positive celler markeres med røde pile. Indstik i hvert billede viste forstørret, repræsentative X-gal-positive celler. (B) kvantificering af data indsamlet fra panelet (A). Data blev præsenteret som middelværdier ± SD fra tre gentagelser.