PLoS ONE: Sulforaphane Forkonditionering sensibiliserer Humane Colon Cancer Cells mod bioreduktive Anticancer Prodrug PR-104A

Abstrakt

De kemoprotektive egenskaber sulforaphane (SF), der er afledt af korsblomstrede grøntsager, er almindeligt anerkendt at opstå fra sin potente induktion af miljøfremmede-metaboliske og antioxidant enzymer. Dog langt mindre om virkningen af ​​SF om effektiviteten af ​​cancerterapi gennem modulering af lægemiddel-metaboliserende enzymer. For at identificere proteiner moduleret af en lav koncentration af SF behandlede vi HT29 colon cancerceller med 2,5 uM SF. Proteinforekomst ændringer blev detekteret ved stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur. Blandt 18 proteiner, der findes at være væsentligt opreguleret, aldo-keto reduktase 1C3 (AKR1C3), bioactivating DNA krydsbinding prodrug PR-104A, blev yderligere karakteriseret. Forbehandling HT29-celler med SF reducerede EF

50 af PR-104A 3.6-fold. Stigningen i PR-104A cytotoksicitet var knyttet til AKR1C3 overflod og aktivitet, både fremkaldt af SF på en dosis-afhængig måde. Denne effekt var reproducerbar i en anden coloncancercellelinie, SW620, men ikke i andre kolon cancercellelinier hvor AKR1C3 overflod og aktivitet var fraværende eller næsten ikke detekterbare og ikke kunne induceres af SF. Interessant, SF havde ingen signifikant indflydelse på PR-104A cytotoksicitet i ikke-kræft, udødeliggjort humane colon epiteliale cellelinjer, der udtrykker enten lave eller høje niveauer af AKR1C3. Afslutningsvis øgede respons PR-104A efter forbehandling med SF var tydelig kun i cancerceller, forudsat at AKR1C3 udtrykkes, mens dets ekspression i ikke-cancerceller ikke fremkalde en sådan reaktion. Derfor kan en delmængde af kræft være modtagelige for kombineret fødevarerelaterede afledt komponent og prodrug behandlinger med ingen skade til normale væv

Henvisning:. Erzinger MM, Bovet C, Hecht KM, Senger S, Winiker P, Sobotzki N et al. (2016) Sulforaphane Forkonditionering sensibiliserer Humane Colon Cancer Cells mod bioreduktive Anticancer Prodrug PR-104A. PLoS ONE 11 (3): e0150219. doi: 10,1371 /journal.pone.0150219

Redaktør: Douglas Thamm, Colorado State University, USA

Modtaget: 26 oktober, 2015; Accepteret: 10. februar, 2016 Udgivet: 7 marts 2016

Copyright: © 2016 Erzinger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (136.247), www.snf.ch.

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Kræft medicin er ofte forbundet med alvorlige bivirkninger, der begrænser dosering potentiale, derfor prodrugs, der kræver bioaktivering i målceller aktivt forfølges som en strategi til fremme af terapeutisk selektivitet [1]. For yderligere at skelne mellem mål- og ikke-målceller, især for enzymaktiverede prodrugs, en hidtil ukendt alternativ fremgangsmåde er at selektivt forudsætningsfagene cancerceller med ikke-toksiske mængder af en naturlig bioaktiv forbindelse til sikkert forbedre drug modtagelighed [2]. Disse forbindelser ofte opregulere narkotika enzymer, der bioactivate narkotika, derfor trods lave eksponeringer, kan de få alvorlige konsekvenser terapi resultater [3]. I modsætning til lægemiddelinteraktioner, har fødevarebårne moduleret ændringer i lægemiddelmetabolisme der påvirker narkotika effekt i behandlingen af ​​kræft sjældent blevet behandlet.

isothiocyanater såsom sulforaphane (SF) er afledt af korsblomstrede grøntsager, er biotilgængelige i tyktarmen [ ,,,0],4], og modulerer genekspression af et stort antal xenobiotiske-metaboliserende og antioxidant enzymer [4-6]. I vid udstrækning, er denne proces medieres af transskriptionsfaktoren kernefaktor erythroide 2-relateret faktor 2 (Nrf2) [7]. Indflydelsen af ​​SF på gentranskription og proteinekspression er blevet karakteriseret i gnavermodeller og humane cellelinjer fra forskellige væv oprindelse [8-18], herunder fire undersøgelser med proteom tilgange [14, 16-18]. SF reagerer med cysteinrester i Nrf2 repressoren Keap1, hvilket resulterer i nuklear translokation af Nrf2 og binding af transkriptionsfaktoren til DNA [7]. Genekspression påvirkes primært til gener, der koder for fase II og afgiftning enzymer, men også cellulære NADPH-regenererende enzymer, antioxidanter, eller miljøfremmede-enzymer [14-18]. De fleste translationelle anvendelser af SF til formål at udnytte reguleringen potentiale for deaktivering elektrofile og reaktive ilt arter i sunde eller præmaligne celler til forebyggelse af kræft [15, 19].

Mens SF eller høje niveauer af Nrf2 kan bidrage til kemoresistens [7, 20], har det modsatte forhold også blevet observeret, med vigtige forskelle bliver mekanisme narkotika handling og celle egenskaber [21]. Mest kendte forekomster er direkte terapeutisk funktion af SF i en lægemiddellignende måde, men der er begrænset viden om påvirkninger af ikke-toksiske, lave koncentrationer af SF potentielt opnås ved kosten. En proces med særlig relevans er, hvordan transkriptionel aktivering af narkotika-aktiverende enzymer kan fremme virkningen af ​​kræft prodrugs. I denne henseende er det blevet observeret, at når kræftceller (bryst TD47D) blev behandlet med SF, NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1), en aktivator af mitomycin C (MMC), blev induceret, og celler blev sensibiliseret til MMC [22]. I en opfølgende undersøgelse blev dimethylfumarat anvendt som NQO1 inducer, og de første SF resultater blev bekræftet

in vivo

. Vigtigere er det, var der ingen observerede stigninger i negative toksiciteter, motiverende yderligere undersøgelse af, hvordan kost-relevant enzyminduktion kan påvirke prodrug aktivitet [23]. Disse data sammen med den etablerede biotilgængelighed af SF i den humane tyktarm, foreslået os relevansen af ​​karakterisering proteom-dækkende ændringer i humane coloncancer-celler eksponeret for ikke-toksiske doser af SF under anvendelse stabil isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur ( SILAC) [24], en metabolisk tilgang mærkning, som tillader kvantificering af tusindvis af proteiner med høj præcision og følsomhed [25].

PR-104A er prodruget metabolit af dinitrobenzamide sennep pre-prodrug PR-104 (figur 1) [26-29]. I tidligere undersøgelser, enzymet aldo-keto-reduktase (AKR) 1C3 er etableret for at formidle den aerobe aktivering af PR-104A [29, 30]. Dette enzym er et medlem af AKR-enzymet superfamilien, bestående af ketosteroid reduktase-enzymer, der regulerer produktionen af ​​androgener, østrogener, og progestiner [31] og dets ekspression reguleres af Nrf2 /Keap1-pathway [29]. PR-104 har været involveret i en række tidlige kliniske forsøg for kræftbehandling [32-35], men er ikke blevet rapporteret om en potentiel gavnlig effekt af kemisk induceret enzym udtryk på PR-104A cytotoksicitet.

In vivo

, PR-104 er hydrolyseret til PR-104A, som er yderligere reduceret til metabolitter, der danner cytotoksiske ICLs.

for at bestemme indflydelsen af ​​en lav SF koncentration, der kan være udnyttes til graduering af narkotika effekt, vi analyserede proteom hele ændringer efter SF konditionering i HT29 tyktarmskræft celler ved SILAC [24]. På grundlag af disse data, vi formuleret den hypotese, at PR104A aktivitet kan fremmes i cancerceller. Derfor testede vi virkningen af ​​SF konditionering på PR-104A cytotoksicitet i disse og flere andre etablerede tyktarmskræft cellelinjer og sammenlignet med udødeliggjort men normale diploide humane colon epitelceller (HCEC) som en model for sund kolon væv. En række data fra cellulære optagelse, enzym-overflod, aktivitet i forskellige celletyper og knock-down-analyser tyder på en model, der involverer SF-forfremmet sensibilisering på baggrund af øget AKR1C3 protein overflod og aktivitet, og cellulære egenskaber, der begunstiger positivt samspil.

Materialer og metoder

Materialer

Cellekulturmedium og supplementer var fra Invitrogen (Life Technologies) og kemikalier fra Sigma Aldrich, hvis ikke andet er angivet. Stamopløsninger af R-sulforaphane (LKT Laboratories) og PR-104A (Proacta) fremstilles i DMSO, chlorambucil i ethanol. NADPH var fra Calbiochem. Coumberone var generøst tilvejebragt af Prof. Dalibor Sames (Columbia University, NY, USA) og SN34037 af Prof. Bill Wilson og Dr. Adrian Blaser (Auckland Cancer Society Research Centre, University of Auckland, New Zealand). ON-TARGETplus Menneskelig AKR1C3 siRNA (SMARTpool) og ON-TARGETplus ikke-targeting pool siRNA blev opnået fra Dharmacon (Thermo Scientific). Lipofectamine RNAiMAX transfektionsreagens (Life Technologies) blev anvendt til siRNA transfektion ifølge producentens protokol.

Celler og dyrkningsbetingelser Salg

HT29 celler blev opnået fra Leibnitz-Institut DSMZ GmbH i januar 2012. SW620, SW480, HCT116 og GP2d celler, der er beskrevet i [36, 37], blev opnået fra Institut for Molekylær Cancer Research (universitetet i Zürich, Schweiz) i oktober 2013 og godkendt af selskabet Microsynth (Balgach, Schweiz) ved hjælp af kort tandem gentage profilering i januar 2015. HT29, blev SW620 og GP2d celler dyrket i DMEM, SW480 celler blev dyrket i RPMI-1640 medium og HCT116-celler blev dyrket i McCoys medium. Alle medier blev suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum og 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. HCEC kloner blev opnået i august 2011 (HCEC1CT) og august 2013 (HCEC2CT) og dyrkes under tidligere rapporterede betingelser, men under normoxi [38]. Alle cellelinier er løbende blevet bekræftet at være mycoplasma gratis. For SILAC eksperimenter blev HT29-celler dyrket i lysin og arginin DMEM (Silantes), som blev enten tilsat 0,219 mM lysin (Lys0) og 1,14 mM arginin (Arg0) for den lette medium (L), mens den tunge medium (H) blev suppleret med 0,219 mM [

13C

6

15N

2] -lysin (Lys8) og 1,14 mM [

13C

6

15N

4] – arginin (Arg10). For en komplet inkorporering af isotopmærkede aminosyrer blev celler dyrket i i alt 24 cell populationsfordoblinger (seks passager, 4 celle populationsfordoblinger hver) i SILAC medium før eksperimentet. 24 timer efter podning blev celler dyrket i SILAC lys mellemstore behandlet med 0,1% (vol /vol) DMSO og celler dyrket i SILAC tunge medium blev behandlet med 2,5 pM SF i 48 timer. Alle celleprøver blev fremstillet in triplo.

Protein Extraction

Celler blev trypsiniseret, vasket med PBS og inkuberet ved 4 ° C i 15 minutter med lysispuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCI, 1 mM EDTA, pH 7,4) indeholdende proteaseinhibitorer (Complete Mini, Roche Diagnostics). Lysatet blev sonikeret og centrifugeret, proteinkoncentrationen bestemt ved BCA-assay (Thermo Fisher Scientific), og prøverne opbevaret ved -80 ° C.

SILAC

Protein fordøjelse, massespektrometrisk analyse af SILAC prøver og bioinformatik analyse blev udført ved tilpasning af standard metoder (detaljer om metode fastlagt for denne undersøgelse i S1 appendiks).

AKR1C3 aktivitet

AKR1C substrat coumberone blev brugt som aktivitet sonde sammen med en bestemt AKR1C3 inhibitor (SN34037) ved modifikation af fremgangsmåden beskrevet i [30] metode. I 96-brønds plader for hver prøve, blev 40 ug totalt protein tilsat til assaybuffer (100 mM KPO4-buffer [pH 7] indeholdende 250 uM NADPH) med eller uden 1 pM SN34037 og inkuberet 60 min, 37 ° C. Reaktionen blev initieret med coumberone (30 pM endelig, DMSO 5% [v /v]). Fluorescensemission, på grund af dannelsen af ​​coumberol, ved 510 nm (385 nm excitation) blev registreret på en uendelig M200 PRO pladelæser (Tecan) ved 37 ° C. AKR1C3 aktivitet blev beregnet som ΔRFU /min over 60 minutter (fuld coumberone stofskifte i S1 Fig). Målinger udført i to eksemplarer med biologiske tre eksemplarer; statistisk analyse (middelværdier, t-test) udføres under anvendelse af GraphPad Prism 6.

Western blot-analyse

Cellelysater blev separeret på NuPAGE® 4-12% Bis-Tris gel ved 200 V i 45 minutter i 1X NuPAGE® MES SDS-løbebuffer (Life Technologies) og elektroforetisk overført til Amersham Hybond-P PVDF-membran (GE Healthcare) ved 30 V i 60 minutter i 1 x NuPAGE® transfer buffer (Life Technologies). PVDF-membraner blev blokeret med 5% -milk-TBST ved stuetemperatur. Membranerne blev inkuberet med kanin polyklonalt anti-AKR1C3 antistof (1: 2’000, Thermo Scientific), efterfulgt af inkubation med anti-kanin IgG HRP-antistof (1: 5’000, GE Healthcare). Proteinet blev detekteret under anvendelse af et Pierce® ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). Behandlede membraner blev eksponeret for røntgenfilm. Membranen blev strippet, inkuberet med anti-actin-antistof (1: 1’000, Sigma Aldrich) og analyseret igen. Proteinbånd blev kvantificeret med ImageJ software [39], og blev justeret for tilsvarende actin ladningskontrol

Drug Cytotoksicitet

Celler blev podet i plader med 96 brønde (HT29, HCEC, SW480:. 1 ‘500 celler /brønd; SW620: 1’000 celler /brønd; HCT116: 500 celler /brønd; GP2d: 5’000 celler /brønd). 24 timer senere blev cellerne eksponeret for 2,5 uM SF (undtagelse HCT116: 1 uM) svarende til en IC

10 eller 0,1% (vol /vol) DMSO. Efter 48 timer blev mediet fjernet og stigende koncentrationer af lægemiddel i frisk medium blev tilsat. 24 timer senere blev mediet erstattet med frisk medium. 72 timer senere cellelevedygtighed blev analyseret under anvendelse af CellTiter-Glo® Luminescent Cell Levedygtighed Assay (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Eksperimentet blev udført tre gange. Alle luminescens værdier blev normaliseret i forhold til bærerbehandlede celler. Dosis-respons-kurver blev monteret af en ikke-lineær regression funktion i GraphPad Prism 6. Statistisk analyse blev udført ved ekstra sum-of-kvadrater F test for at teste, om dosis-respons kurver i kontrol og SF-forbehandlede celler statistisk forskellige fra hinanden.

PR-104A cytotoksicitet med siAKR1C3

HT29-celler blev podet i 6-brønds plader (90’000 celler /brønd) og fik lov til at vedhæfte. 24 timer senere blev de udsat for siAKR1C3 (120 pmol) og 2,5 pM SF eller 0,1% DMSO samtidigt. Efter 48 timer blev mediet fjernet og tre koncentrationer af PR-104A (0, 25, 100 uM) blev tilsat i frisk medium. 4 timer efter tilsætning af lægemidlet blev mediet fjernet og en klonogen overlevelse assay blev udført ifølge standardprotokoller [40]. Efter to uger inkubering blev kolonier farvet med Giemsa farve og talt. Som en kontrol blev ikke-targeting siRNA (120 pmol), der anvendes. Eksperimentet blev udført tre gange. Statistiske analyser (uparret t-test med Welch korrektion) blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 6.

SF Optagelse

Intracellulær SF koncentrationer i HT29 og HCEC1CT celler blev målt ved HPLC-koblede Cyclokondenseringen assay ( reaktion med 1,2-benzendithiol), som tidligere beskrevet (yderligere detaljer i S1 Appendiks) [41].

Resultater

Indflydelse af SF på genekspression i HT29 kolon kræftceller

SILAC blev anvendt til at undersøge ændringer i overflod niveauer af cellulære proteiner ved behandling med en lav koncentration af SF i HT29 colon cancerceller. Efter behandling med 2,5 pM SF i 48 timer, hvilket svarer til en IC

10 i HT29-celler (S2 Fig); vi identificeret 23 differentielt rigelige proteiner (figur 2; tabel 1). En overvægt af proteiner involveret i cellulære metaboliske og redoxprocesser fandtes at blive beriget, og enzymer karakteriseret tidligere at mediere aktivering af reduktive prodrugs, såsom AKR1C3, PTGR1, og NQO1 var blandt denne gruppe [22, 29, 42-44] . Den største fold ændring var tydelig for cyclin-D1-bindende protein 1, en negativ regulator af transkriptionel aktivering involverer de E2F transkriptionsfaktorer [45], og flere metaboliske og redox-regulerende proteiner reguleres af transskription faktor Nrf2, herunder AKRs og et aldehyd dehydrogenase, forhøjet med 4,6 gange eller højere. Den store ændring i overflod for AKR1C3 (7 gange), tidligere impliceret i aktiveringen af ​​PR-104A, påberåbes muligheden for lægemidlet sensibilisering. Derfor fokuserede vi vores yderligere indsats belyse eventuelle SF-PR104A interaktioner og bidrag fra AKR1C3 som en molekylær basis. En komplet liste over alle kvantificerede proteiner i SILAC eksperimentet, herunder deres normaliseret H /L-forholdet, er fastsat i S1 tabel.

2653 proteiner (sort og grå) blev kvantificeret og testet for signifikans. Blandt de 23 betydeligt regulerede proteiner (sort), 18 var opreguleret og 5 nedreguleret i overflod.

For at uafhængigt bekræfte stigningen i AKR1C3 overflod tydeligt i SILAC undersøgelsen, Western blot-analyse blev udført, og det viste sig, at AKR1C3 overflod blev induceret i HT29-celler i en SF dosisafhængig måde (fig 3A). For at bekræfte højere AKR1C3 aktivitet i HT29 lysater, vi anvendte en modificeret version af en fremgangsmåde der tidligere er beskrevet for måling specifikt AKR1C3 aktivitet i intakte celler, der involverer coumberone som et substrat for alle fire medlemmer af AKR1C familien, og den specifikke AKR1C3 inhibitor SN34037 [30 ]. Svarende til proteinniveauer, AKR1C3 aktivitet steg på en dosisafhængig måde i HT29-celler (Fig 3A).

AKR1C3 aktivitet og proteinniveauer er vist i (a) til HT29 celler og i (e) for HCEC1CT celler behandlet 48 timer med SF eller DMSO (kontrol). Søjler repræsenterer middelværdier og fejlsøjler er standardafvigelser. Statistisk analyse blev udført ved en uparret t-test med Welch korrektion. Eksperimenter blev udført tre gange. (*:

s

0,05; RFU = relative fluorescensenheder). Modulering af cellelevedygtigheden er vist for HT29 i (b) og for HCEC1CT i (f) efter cellerne blev inkuberet 48 timer med 2,5 pM SF eller 0,1% DMSO (kontrol) og inkuberet med stigende koncentrationer af PR-104A. De viste data er middelværdier ± SD fra fire (HT29) eller tre (HCEC1CT) biologiske gentagelser. En ekstra sum-of-kvadrater F-test blev udført for at teste, om dosis-respons-kurver statistisk forskellige fra hinanden. De resulterende p-værdier viser, at SF betydelig indflydelse lægemiddelrespons i HT29-celler, og har ingen signifikant virkning i HCEC1CT celler. (C) Klonogen overlevelse assay viser forøget overlevelse af HT29 behandlet med siRNA mod AKR1C3 sammenlignet med celler behandlet med ikke-målretning siRNA efter PR-104A behandling i 4 timer. Celler blev forbehandlet i 48 timer med 2,5 uM SF sammen med siRNA. Hvert datapunkt repræsenterer tre uafhængige forsøg. Fejlbjælker viser SD af middelværdien. Statistisk analyse blev udført ved en uparret t-test med Welch korrektion; **:

s

0,01, ***:

s

0,001. (D) Western blot viser niveauer af AKR1C3 protein i HT29-celler behandlet med enten ikke-targeting siRNA eller siAKR1C3 med eller uden samtidig SF behandling (kontrol = 0,1% DMSO).

Virkningen af ​​SF-medieret AKR1C3 induktion på lægemiddeltoksicitet i HT29 colon cancerceller

Vi fandt, at ved forkonditionering HT29-celler med 2,5 pM SF i 48 timer, efterfulgt af behandling med stigende doser af PR-104A, en signifikant 3,6-fold fald i EF

50 af lægemidlet blev observeret (fig 3B, tabel 2,

s

0,0001). Højere SF koncentrationer blev testet for forkonditionering men stigende toksicitet forbehandlingen selv forhindret den videre anvendelse af disse højere SF koncentrationer. Som en kontrol blev denne interaktion i forhold til indflydelsen af ​​SF forkonditionering på cytotoksiciteten af ​​chlorambucil (CBL), et anticancer lægemiddel, også danner DNA interstreng tværbindinger (ICLs), men er ikke afhængig af enzymatisk bioaktivering. Som forventet cytotoksicitet af CBL var uændret (tabel 2).

For at bekræfte, om øget AKR1C3 overflod niveauer på grund af SF konditionering af HT29 er ansvarlige for den øgede cytotoksicitet af PR-104A, vi udførte RNA interferens ved hjælp af en pulje af fire siRNA’er mod

AKR1C3

. En klonogene assay blev anvendt til at bestemme cytotoksiciteten af ​​PR-104A i HT29-celler efter samtidig forkonditionering med SF og siRNA mod

AKR1C3

(fig 3C og 3D, S2 tabel). Som kontrol blev ikke-målretning siRNA anvendes. Derudover blev varierende inkubationstider og siRNA koncentrationer testet for at sikre, at SF-induceret AKR1C3 ekspression blev undertrykt af siRNA mod

AKR1C3

under de beskrevne betingelser, og efter 48 timer samtidig forkonditionering med SF og siRNA mod

AKR1C3

, proteinniveauer svarede til niveauerne i ubehandlede HT29-celler (data ikke vist). Når SF-induceret AKR1C3 overekspression blev nedreguleret via RNA-interferens, blev cytotoksicitet PR-104A reduceret, hvilket indikerer, at SF konditionering sænkede PR-104A koncentration, der kræves for at opnå en tilsvarende cytotoksicitet ved at inducere AKR1C3 overflod niveauer. Disse data understøtter den tidligere fastsatte forbindelse mellem AKR1C3 overflod og PR-104A effekt [29, 30], og desuden bekræfter den samme effekt under forhold med kemisk induktion, dvs. SF.

Virkningen af ​​SF forkonditionering om toksicitet narkotika i HCEC ikke-kræft colon celler

Fremme narkotika cytotoksicitet i kræftvæv kan være en fordel, hvis den samme interaktion er fraværende eller reduceres hos raske kolleger. Derfor blev kombinationen af ​​SF og PR-104A undersøgt i en immortaliseret human colon epithelial cellelinie (HCEC) som model for ikke-kræft væv [38]. HCECs (HCEC1CT og HCEC2CT, fra to forskellige individer) er ikke-tumorigene diploide celler, der udtrykker epitelial samt stamcelle markører og blev etableret fra normal colon mucosa. De behøver ikke bære mutationer i hotspot-gener såsom

APC

,

KRAS

, eller

TP53

[38]. AKR1C3 abundance niveauer målt ved Western Blot var lidt induceret ved SF behandling i HCEC1CT celler (Fig 3e), men i mindre grad end for de HT29-celler (Fig 3A). Der var hverken signifikant stigning i AKR1C3 aktivitet (Fig 3E) eller narkotika følsomhed (HCEC1CT: Fig 3F, Tabel 2,

s

= 0,2; HCEC2CT: Tabel 2;

s

= 0,8).

SF optagelse i HT29 og HCEC1CT celler

for at undersøge, om de forskellige svar i HT29 vs. HCEC1CT celler kan være relateret til cellulær SF optagelse, vi analyserede SF optagelse i HT29 og HCEC1CT af en Cyclokondenseringen assay. Dette assay har den fordel, at kvantificering af fri SF samt SF bundet til cellulære thioler, såsom glutathion [41]. Der var ingen signifikante forskelle i SF optagelse (S3 Fig), hvilket tyder på udelukkelsen af ​​øget optagelse som grundlag for SF-PR104A interaktion i HT29 men ikke HCEC celler.

Virkningen af ​​SF konditionering på lægemiddeltoksicitet i yderligere tyktarmskræft cellelinjer

for at udforske den generelle og grundlaget for SF konditioneringsmetoder effekter, blev cytotoksicitet eksperimenter udført med ekstra tyktarmskræft cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde (tabel 2). Svarende til HT29, i SW620 EF

50 af PR-104A var signifikant reduceret 3,6 gange ved SF konditionering (

s

0,0001). Som i HT29-celler, blev AKR1C3 overflod i SW620-celler induceret omkring 3 gange og aktivitet steg 1,7 gange (figur 4, S3 tabel). I modsætning til HCT116, SW480, og GP2d celler, PR-104A cytotoksicitet blev ikke ændret. Denne observation synes overens med det faktum, at ingen AKR1C3 protein blev påvist i HCT116 og SW480 cellelysater, og heller ikke SF forkonditionering inducerer protein overflod eller aktivitet (figur 4, S3 tabel). I GP2d celler blev AKR1C3 knap udtryk; imidlertid blev overflod og aktiviteten af ​​dette enzym ikke steget tilstrækkeligt af SF at ændre PR-104A cytotoksicitet (figur 4, S3 tabel). En klar tendens blev observeret i retning af lavere PR-104A EF

50 værdier for celler med højere AKR1C3 aktivitet (figur 4C, R

2 = 0,7063;

s

0,01). Disse resultater viser, at en kombination af AKR1C3 basale niveauer og aktivitet, samt modtagelighed for induktion af SF, påvirke tilbøjelighed celler til at støtte PR-104A-styrke potentiale SF. Derfor genetisk variation på tværs primær sunde og tumorvæv, samt forskellige kræftformer, kan forventes at bidrage til individuelle svar.

(a) AKR1C3 aktivitet med (grå) og uden (sort) SF konditionering for kolon cellelinier anvendt i denne undersøgelse. Statistisk analyse blev udført ved uparret t-test med Welch korrektion; *:

s

0,05. (B) Western blot for AKR1C3 protein med og uden SF forkonditionering (2,5 uM i 48 timer). (C) Sammenhæng mellem AKR1C3 aktivitet og PR-104A cytotoksicitet (

s

0,01). Graph indeholder data fra HCEC1CT, HCEC2CT, HT29, SW620, og GP2d celler med (åbne symboler) og uden (lukkede symboler) SF konditioneringsmetoder. Cellelinier med nogen AKR1C3 protein (HCT116, SW480), er fjernet. *: Signifikant skift i EF

50 på SF konditionering i henhold til ekstra sum-of-kvadrater F-test for at teste, om dosis-respons kurver i kontrol og SF forbehandlet celle statistisk adskiller sig fra hinanden

Discussion

på trods af tilgængeligheden af ​​data vedrørende virkningen af ​​SF på genekspression, var der kun begrænsede oplysninger om protein overflod ændring i humane colon celler, især for SF-koncentrationer for lav til at signifikant vil ændre cellernes levedygtighed. I proteomisk skærm udføres her, 23-proteiner var differentielt rigelige, 18 forøges i overflod ved behandling med 2,5 pM SF. Flere af disse proteiner, herunder forskellige AKRs fandtes tidligere at blive induceret af højere doser af SF (5 og 15 uM) i bryst cellelinier etableret fra mælkekirtler med fibrocystisk sygdom og human colon adenocarcinoma Caco-2-celler også ved hjælp af proteom tilgange [14, 16]. Men i den foreliggende undersøgelse, blev det cellulære respons analyseret på en påvist ikke-toksisk og potentielt fysiologisk relevant koncentration af SF eksponering i humane væv (2,5 uM) [46]. Ved høje doser, SF har cytostatisk og cytotoksisk aktivitet på dyrkede celler [47-50]. En moderat ændring i AKR1C3 overflod (7,3 gange) og generelt begrænset liste over opreguleret enzymer detekteret i vores undersøgelse kan være relateret til celletype eller det ringe SF koncentration, understøtter en stigning i en høj andel af reduktase enzymer selv ved lav koncentration .

på grundlag af de SILAC resultater, vi udforsket potentialet for SF konditionering af HT29-celler til at ændre cytotoksicitet bioreduktive prodrug PR-104A, og fandt der at være en positiv interaktion direkte relateret til modulation af AKR1C3. Western blot-analyse, specifikke enzym aktivitet målinger, og siRNA knock-down eksperimenter alle bekræftet, at øget følsomhed over for PR-104A var relateret til en stigning i AKR1C3 overflod niveauer og aktivitet. I modsætning hertil denne sensibilisering var ikke påviselig i immortaliserede HCEC1CT celler, i overensstemmelse med manglen på inducerede enzymaktivitet påvist i disse celler (Fig 4A). På basis af western blot data, der syntes at være en relativ stigning i protein overflod (Fig 4B). Men absolutte protein niveauer forblev så lavt i både præ-aircondition og ubehandlede celler, ingen effektiv sensibilisering blev observeret. Resultatet for HCEC1CT cellelinie var af interesse på grund af sin ikke-kræftvæv oprindelse og molekylære karakteristika tyder det som en model for sunde kolon epitelceller [38].

Den mulige selektiv forøgelse af PR-104A i tumorceller motiveret os til at undersøge yderligere fem cellelinier, nemlig HCEC2CT (ikke-kræft), og tyktarmskræft cellelinjer SW480, SW620, HCT116, og GP2d til bedre at forstå, hvordan molekylære faktorer påvirker kombinationen respons. Svarende til HT29, blev SW620 celler sensibiliseret mod behandling med PR-104A fra SF-forbehandling. Endvidere blev AKR1C3 protein overflod og aktivitet ligeledes induceret i disse celler. I modsætning hertil blev protein overflod og aktivitet ikke påvirkes af SF-forbehandling i ikke-kræft HCEC2CT celler, disse celler blev derfor ikke sensibiliseret mod lægemidlet. I cellelinjer, der havde meget lave eller ingen AKR1C3 mRNA-niveauer [51] og ikke udtrykke proteinet (SW480, HCT116), AKR1C3 overflod var også ikke inducerbar med SF konditionering. Der var derfor ingen indvirkning på PR-104A cytotoksicitet. GP2d celler havde lav

AKR1C3

mRNA-niveauer [51], men protein overflod og enzymaktivitet kunne øges på SF konditionering, men med et niveau af induktion tilsyneladende utilstrækkelig til at påvirke cytotoksicitet PR-104A. Således AKR1C3 aktivitet viste sig at være mere diagnostisk af PR-104A cytotoksicitet (Fig 4C) end små protein overflod ændringer, der kan påvises ved western blot, men var utilstrækkelig til at have en reel effekt. Denne observation giver yderligere støtte i forbindelse med tyktarmskræft celler til forslaget om, at AKR1C3 aktivitet kunne bruges som en prædiktiv markør for PR-104A modtagelighed som rakte tidligere på grundlag af data fra patient-afledte xenotransplantater og leukæmi celler. Endelig foreslås en værdi for fortsat udvikling af strategier til at overvåge AKR1C3 aktivitet, herunder aktivitetsbaseret protein profilering [30, 52, 53].

Det er blevet spekuleret, at yderligere faktorer, såsom DNA-reparation, kan redegøre for inkonsistente resultater observeret tidligere vedrørende forholdet mellem PR-104A modtagelighed og AKR1C3 aktivitet i cellelinier, men vores data tyder på en svag rolle, hvis nogen for reparation forskelle at være betydelig i tyktarmskræft celler overvejer at resultater opnået med CBL (tabel 2). PR-104A danner ICLs, foreslås at være de samme som beskrevet for CBL og MMC [26-28, 54]. Da vi testede CBL som model tværbindingsmiddel og analyseret cytotoksicitet i de samme cellelinier som PR-104A, var der ingen signifikant påvirkning af SF forkonditionering på cellelevedygtighed (tabel 2). Men under aerobe betingelser, som ansat her, PR-104A ICLs menes, at være kun dannes, hvis AKR1C3 udtrykkes, ellers andre virkemåder i cellelinier mangler dette enzym er blevet foreslået, såsom monoalkylering af DNA ved PR-104A selv eller dets oxiderede halv sennep [27, 28, 54]. Strukturerne for sådanne DNA addukter er ikke blevet strengt karakteriseret, og heller ikke deres tilsvarende form for reparation kendt, derfor betydningen af ​​disse veje påvirke cytotoksicitet i celler med lav basal eller inducerede AKR1C3 niveauer garanterer yderligere undersøgelse.

Muligheden øge cytotoksicitet af bioreduktive anticancer prodrugs med kosten fytokemikalier er blevet påvist i en håndfuld tidligere undersøgelser af humane cellelinjer [21, 22, 43, 55]. Fire cellelinier, af colon, lunge eller bryst oprindelse, blev sensibiliseret mod bioreduktive lægemiddel MMC ved induktion af NQO1 [22]. Yu

et al

. Brugte curcumin og resveratrol at inducere lægemiddel-metabolizing enzym PTGR1 og derfor bevidstgøre lever HepG2 og kolon SW620 celler mod bioreduktive stof hydroxymethylacylfulven [43]. En lignende sensibilisering dybt hydroxymethylacylfulven blev opnået i HT29-celler ved anvendelse D3T som enzyminducer [55].